新编-第3章蛋白质课件

第一篇物质篇第3章蛋白质第一篇物质篇第3章蛋白质13.1蛋白质的化学组成与分类3.2氨基酸与肽3.3蛋白质的分子结构3.4蛋白质的理化性质3.5蛋白质的功能性质及其在食品加工中的应用3.1蛋白质的化学组成与分类3.2氨基酸与肽3.32蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。蛋白质是食品的主要营养成分，除保证食品的营养价值外，在决定食品特征上也起重要作用。蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和3早在1878年，思格斯就在《反杜林论》中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”

可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断。早在1878年，思格斯就在《反杜林论》中指出：“生命是蛋白体4蛋白质的生物学意义1.生物体的组成成分2.酶3.运输4.运动5.抗体6.干扰素7.遗传信息的控制8.细胞膜的通透性9.高等动物的记忆、识别机构木瓜蛋白酶蛋白质的生物学意义1.生物体的组成成分2.酶3.运输45

3.1蛋白质的化学组成与分类蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳50％--60%氢6％--8%氧19%--24％氮16%硫0—4％其他微量一、蛋白质的化学组成 3.1蛋白质的化学组成与分类蛋白质是一类含氮有机化合物，61.蛋白质的含氮量氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量：蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数6.251.蛋白质的含氮量氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。72.蛋白质的大小与分子量蛋白质是分子量很大的生物分子。蛋白质可以被酸、碱或酶催化水解。尽管蛋白质的种类千差万别，但水解的最终产物都是氨基酸。构成蛋白质的氨基酸共20种，称为基本氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的基本单位。2.蛋白质的大小与分子量蛋白质是分子量很大的生物分子。蛋8蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量9（一）依据蛋白质的组成分类按照蛋白质的组成，可以分为：简单蛋白(simpleprotein)和结合蛋白(conjugatedprotein)。二、蛋白质的分类（一）依据蛋白质的组成分类按照蛋白质的组成，可以分为：二、蛋101、简单蛋白又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。（1）清蛋白和球蛋白(albuminandglobulin

)：广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70－80％乙醇中。（3）精蛋白和组蛋白：可溶于水或稀酸，碱性蛋白质，存在与细胞核中。（4）硬蛋白：溶解度最低，能抗酶水解。存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。1、简单蛋白又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成112、结合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。如血清-，-脂蛋白等。核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。2、结合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，12(二)依据蛋白质的外形分类按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。球状蛋白质globularprotein：外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质fibrousprotein：分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。(二)依据蛋白质的外形分类13（三）根据蛋白质来源分类根据蛋白质来源的不同，蛋白质可分为动物性蛋白质、植物性蛋白质和单细胞蛋白质三类。⑴动物性蛋白质：主要来源于肉类、乳类和蛋类。①肉类蛋白质：约含有70%的结构蛋白和30%的水溶性蛋白质。水溶性蛋白质又可分为肌浆蛋白和肌清蛋白两种。②乳类蛋白质：乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白和脂肪球膜蛋白质。③蛋类蛋白质：蛋类蛋白质包括蛋清、蛋黄蛋白质两类。⑵植物性蛋白质：主要是来源于蔬菜、谷物和油料种子中的蛋白质。①蔬菜蛋白，②谷类蛋白,③油料种子蛋白。⑶单细胞蛋白质：单细胞蛋白质来源于微生物。在酵母菌中可达40%～60%，细菌中甚至可达80%以上。单细胞蛋白质特点是核蛋白含量高，目前主要用于饲料生产。

（三）根据蛋白质来源分类143.2氨基酸与肽一、氨基酸氨基酸是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种基本氨基酸（20standardaminoacids)组成。1、氨基酸的结构通式：19种氨基酸具有一级氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）结合到α碳原子（Cα），同时结合到（Cα）上的是H原子和各种侧链（R）；脯氨酸（Pro）具有二级氨基（α-亚氨基酸）（一）氨基酸的结构与分类3.2氨基酸与肽氨基酸是蛋白质的基本组成单位。从细15不带电形式

H2N—Cα—HCOOHR

+H3N—Cα—HCOO-R两性离子形式Cα如是不对称C（除Gly），则：具有两种立体异构体[D-型和L-型]2.具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]不带电形式H2N—Cα—HCOOHR+H3N—Cα—1620种氨基酸甘氨酸丙氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸丝氨酸半胱氨酸苏氨酸甲硫氨酸脯氨酸20种氨基酸甘氨酸丙氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸丝氨酸半胱氨酸苏17苯丙氨酸天冬氨酸酪氨酸色氨酸组氨酸赖氨酸精氨酸谷氨酸天冬酰胺谷氨酰胺苯丙氨酸苯丙氨酸天冬氨酸酪氨酸色氨酸组氨酸赖氨酸精氨酸谷氨酸天冬酰胺182、氨基酸的分类根据侧链R的性质不同，可将氨基酸分为四类：非极性或疏水性氨基酸、极性不带电荷氨基酸、在pH7.0时R带负电荷氨基酸和在pH7.0时R带正电荷氨基酸。

非极性或疏水性氨基酸和极性不带电荷氨基酸是中性氨基酸，在pH7.0时R带负电荷氨基酸为酸性氨基酸，在pH7.0时R带正电荷氨基酸为碱性氨基酸。

2、氨基酸的分类根据侧链R的性质不同，可将19①非极性或疏水性氨基酸含有非极性的侧链，呈中性，具有不同程度的疏水性。主要包括脂肪烃侧链的丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸以及脯氨酸；芳香环侧链的苯丙氨酸和色氨酸；含硫氨基酸的甲硫氨酸或称蛋氨酸。②极性不带电荷氨基酸侧链带有羟基、巯基或酰胺基等极性基团，因此，比极性基团易溶于水，但在水溶液中不电离。主要包括丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺和半胱氨酸。甘氨酸虽然不带有R基团，但由于其带电荷的氨基和羧基占据了整个分子的大部分，具有明显的极性，所以也可归入这一类。③R侧链带负电荷的氨基酸这类氨基酸在pH7.0时带有净的负电荷，在侧链中含有羧基，易解离出H+而具有酸性。包括天冬氨酸和谷氨酸两种氨基酸。④R侧链带正电荷的氨基酸这类氨基酸的R侧链在pH7.0时带有正电荷，易接受H+而具有碱性。包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。①非极性或疏水性氨基酸含有非极性的侧链，呈中性，具有20溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。(2)熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200℃以上。(3)味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。（二）氨基酸的性质1.氨基酸的物理性质溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀21除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据（4）氨基酸的旋光性除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性22（5）氨基酸的

光吸收构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;（5）氨基酸的

光吸收构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没23（1）氨基酸的离解性质

由于氨基酸既含有酸性的羧基（-COOH），又含有碱性的氨基（-NH2），-NH3+可以释放H+，而-COO-可以接受H+，既可以H3N+—CH—COO-的形式存在。因此，氨基酸是两性电解质。R在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。2.氨基酸的化学性质正离子

两性离子

负离子酸性溶液水溶液（pH＜pI）（pH=pI）碱性溶液（pH＞pI）（1）氨基酸的离解性质由于氨基酸既含有酸性的羧基（24氨基酸的等电点(pI)

当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子所带正、负电荷数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK’1和pK’2的算术平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK’值的算术平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R-COO-

)/2硷性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2

氨基酸的等电点(pI)当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸25（2）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法R—CH—COOHNH2HCHOR—CH—COOHNHCH2OHHCHOR—CH—COOHN(CH2OH)2α氨基酸氨基酸的二羟甲基衍生物+碱中和滴定氨基酸的二羟甲基衍生物碱性被遮盖（2）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法R—CH—COOHNH26（3）与亚硝酸的反应氨基酸与亚硝酸发生重氮化反应，生成α羟酸，并放出氮气。

反应产生的氮气一半来自氨基酸，另一半来自亚硝酸。在标准条件下，测定反应生成的氮气量可计算氨基酸量。是范斯莱克（VanSlyke)法测定氨基酸含量的原理。（3）与亚硝酸的反应27（4）茚三酮反应

α-氨基酸与茚三酮（苯骈环三酮）的水合物在弱酸溶液中（pH4左右）加热时，可发生氧化脱氨反应，生成醛、氨与二氧化碳。水合茚三酮则被还原成还原水合茚三酮。一分子还原水合茚三酮和一分子水合茚三酮与氨基酸氧化分解放出的氨缩合而生成蓝紫色化合物.其反应过程为：

所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生（亮）黄色物质。此反应是氨基酸的特异性反应，常用于氨基酸的定性或定量分析。定量释放的CO2可用测压法测量，计算出参加反应的氨基酸量。产生的蓝紫色化合物可用比色法进行定性或定量测定。（4）茚三酮反应所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮28（5）桑格反应（2,4-二硝基氟苯(DNFB)反应）NO2FO2N+HN—CH—COOHRNO2O2NHN—CH—COOHR+HF弱碱性DNP-氨基酸（黄色）反应特点A.为α-NH2的反应。B.氨基酸α-NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃)。C.在弱碱性条件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸。应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。DNFB（5）桑格反应（2,4-二硝基氟苯(DNFB)反应）NO229★首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构A.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽。B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸。C.分离DNP-氨基酸。D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目。★首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构30由Edman于1950年首先提出。为α-NH2的反应。用于N末端分析，又称Edman降解法。（6）艾德曼（Edman)反应在弱碱性条件下，氨基酸的α-氨基可与苯异硫氰酸（PITG）反应生成相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（简称PTC-氨基酸）。在酸性条件下，PTC-氨基酸环化形成在酸中稳定的苯乙内酰硫脲氨基酸（简称PTH）。蛋白质多肽链N-末端氨基酸的α-氨基也可有此反应，生成PTC-肽，在酸性溶液中释放出末端的PTH-氨基酸和比原来少一个氨基酸残基的多肽链。PTH-氨基酸在酸性条件下极稳定并可溶于乙酸乙酯，用乙酸乙酯抽提后，经高压液相层析鉴定就可以确定肽链N-末端氨基酸的种类。该法的优点是可连续分析出N端的十几个氨基酸。瑞典科学家P.Edman首先使用该反应测定蛋白质N-末端的氨基酸。氨基酸自动顺序分析仪就是根据该反应原理而设计的。由Edman于1950年首先提出。（6）艾德曼（Edman)31苯异硫氰酸酯肽苯异硫腈氨基酸衍生物（PTH氨基酸）

裂解重排++少一个氨基酸残基的肽苯异硫氰酸酯肽苯异硫腈氨基酸衍生物裂解重排++少一个氨基酸残32Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链，灵敏度提高，能连续测定。Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种33二、肽一个氨基酸的α氨基与另一个氨基酸的α羧基之间通过脱去一分子H2O所形成的酰胺键互相连接在一起，这个酰胺键称为肽键。（一）肽的结构与命名二、肽一个氨基酸的α氨基与另一个氨基酸的α羧基之间通过脱34肽键及肽平面20世纪30年代，Pauling,Corey用x射线衍射法得到：肽键的键长0.132nm肽键中的C-N键为共价键，具有部分双键性质，不能自由旋转。形成肽键的4个原子（C、O、N、H)和与之相连的2个α-碳原子共处于一个平面—肽平面存在顺、反两种结构。在大多数情况下，以反式结构存在。肽键及肽平面20世纪30年代，Pauling,Corey用35φ角和Ψ角绕Cα-C键旋转的角度称Ψ（角）。绕Cα-N键旋转的角度称φ（角）。这两个旋转的角度称二面角或构象角。φ角和Ψ角36肽——氨基酸通过若干个肽键连接形成的链状结构化合物。二肽——由两个氨基酸组成的肽。寡肽——由少于十个氨基酸组成的肽。多肽——十个以上氨基酸组成的肽。四肽的结构谷氨酸甘氨酸丙氨酸赖氨酸肽——氨基酸通过若干个肽键连接形成的链状结构化合物。四肽的结37在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln丝氨酰缬氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酰胺在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基38（二）多肽的性质

多肽是由氨基酸以肽键连接而成，因此，多肽可以发生氨基酸的一切反应。如两性解离。但解离情况较为复杂。1.多肽的水解（二）多肽的性质1.多肽的水解39完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。所以，氨基酸是蛋白质的基本结构单元。大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。这20种氨基酸被称为基本氨基酸。多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解.完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最40（1）酸水解常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。（1）酸水解常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在41（2）碱水解一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。（2）碱水解一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。42（3）酶水解目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolyticenzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。最常见的蛋白水解酶有以下几种：（3）酶水解目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteo43Trypsin：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。肽链水解位点胰蛋白酶Trypsin：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一44Pepsin：R1和R2、R3=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸，水解速度较快。肽链水解位点胃蛋白酶Pepsin：R1和R2、R3=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp45thermolysin：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。肽链水解位点嗜热菌蛋白酶thermolysin：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,46分别从肽链羧基端和氨基端水解肽链水解位点羧肽酶和氨肽酶肽链水解位点羧肽酶和氨肽酶472.多肽链的消旋化多肽链上的α-碳原子均为L-构型。在一定条件下，可转化为D-构型。这种构型的转化是通过烯醇化实现的。消旋化速率与氨基酸的结构和反应条件相关，当氨基酸残基侧链含有吸电子基团时，消旋化的速率大大加快。碱性和高温有利于消旋化。2.多肽链的消旋化多肽链上的α-碳原子均为L-构型。在一定48（三）天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。（三）天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是491、谷胱甘肽(glutathione,GSH)谷胱甘肽也叫γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，广泛存在于生物细胞中。GSH分子中含有活性的硫氢基（巯基），极易被氧化。氧化时，两分子还原型GSH以二硫键结合成氧化型GSH 。GSH的还原型和氧化型的转变是可逆的。

还原型GSH氧化型GSHGSH在生物体内发生的氧化还原反应中起重要的作用，它可以抵抗体内生产的过多的H2O2和外源性氧化剂，起到保护蛋白质巯基免遭氧化，维持蛋白质生理功能的作用。1、谷胱甘肽(glutathione,GSH)谷胱甘肽也50

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-脑啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽2、脑啡肽3、催产素和加压素+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO51

L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val

L-OrnL-Orn

L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu

短杆菌肽S(环十肽)

由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine,缩写为Orn）。

4、短杆菌肽S(环十肽)

4、短杆菌肽S(环十肽)523.3蛋白质的结构蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。天然蛋白质的结构主要包括以肽链线形结构为基础的一级结构，以及由肽链卷曲、折叠和盘绕而形成的空间结构—蛋白质的二级、三级和四级结构。在二级结构和三级结构间还可分为超二级结构和结构域。3.3蛋白质的结构蛋白质是由一条或多条多肽(polype53一、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primarystructure)包括组成蛋白质的多肽链数目.多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。维系蛋白质一级结构的主要化学键是肽键。除此之外，还有二硫键（二硫桥）。一、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构(Primarystr54SS牛胰岛素的化学结构HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-GlyGlu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB链15710151920212530HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A链711621SS—S————S——SS牛胰岛素的化学结构HPhe-Val-Asn-Gln-Hi55蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。

蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的56测定蛋白质的一级结构的要求1，样品必需纯（>97%以上）；2，知道蛋白质的分子量；3，知道蛋白质由几个亚基组成；4，多肽链的拆分。5，测定多肽链的氨基酸组成。6，测定多肽链的氨基酸顺序。测定蛋白质的一级结构的要求1，样品必需纯（>97%以上）；57(1)，测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。蛋白质一级结构的测定(1)，测定蛋白质分子中多肽链的数目。蛋白质一级结构的测定58(2)，多肽链的拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。蛋白质一级结构的测定(2)，多肽链的拆分。蛋白质一级结构的测定59(3)，二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。蛋白质一级结构的测定(3)，二硫键的断裂蛋白质一级结构的测定60蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定611作用：这些反应可用于巯基的保护。巯基（-SH）的保护1作用：这些反应可用于巯基的保护。巯基（-SH）的保护62(4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；蛋白质一级结构的测定(4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比63(5)分析多肽链的N-末端和C-末端多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端基氨基酸测定(5)分析多肽链的N-末端和C-末端末端基氨基酸测定64Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。末端基氨基酸测定二硝基氟苯（DNFB）法Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N65在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。末端基氨基酸测定丹磺酰氯法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸66此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。末端基氨基酸测定肼解法此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C67氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。末端基氨基酸测定氨肽酶法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。68羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除哺氨酸（Pro）,精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。末端基氨基酸测定羧肽酶法羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据69(6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。蛋白质一级结构的测定(6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将70酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶多肽链的选择性降解酶解法:多肽链的选择性降解71化学法：(Cyanogenbromide)溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。多肽链的选择性降解化学法：(Cyanogenbromide)多肽链的选择72(7)测定每个肽段的氨基酸顺序。蛋白质一级结构的测定(7)测定每个肽段的氨基酸顺序。蛋白质一级结构的测定73Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。Edman氨基酸顺序分析法Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种74异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯75(8)确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。蛋白质一级结构的测定(8)确定肽段在多肽链中的次序。蛋白质一级结构的测定76(9)确定原多肽链中二硫键的位置蛋白质一级结构的测定(9)确定原多肽链中二硫键的位置蛋白质一级结构的测定77一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。二硫键位置的确定一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，二硫键位置的确定78蛋白质测序序列的确定涉及要用特殊的蛋白水解酶或切割特定肽键的化学试剂将蛋白质分割成一系列的小肽。例如胃蛋白酶只切割赖氨酸（K）或精氨酸（R）之后的肽键，V8蛋白酶只在谷氨酸（E）后切割；而溴化氰在甲硫氨酸残基后切割肽键。然后将每一段小肽用自动蛋白质测序仪采用Edman降解法（Edmandegradation）进行自动序列测定。

蛋白质测序序列的确定涉及要用特殊的蛋白水解酶或切割特定肽键的79原初样品蛋白质的肽链顺序可以通过测定经不同蛋白酶处理产生出的肽段的序列，并根据重叠序列的办法推测出来。

（i）胰蛋白酶裂解多肽链；（ⅱ）V8蛋白酶的裂解；（iii）Edman降解法测定胰蛋白酶裂解的肽片段（T1～T3）和V8蛋白酶裂解的肽片段（V1～V3）的氨基酸序列；（ⅳ）根据重叠肽段组装完整的全长序列肽链.原初样品蛋白质的肽链顺序可以通过测定经不同蛋白80二、蛋白质的空间结构多肽链折叠、盘曲，形成特有而稳定的三维空间结构。具有空间结构的蛋白质才有生物功能。研究蛋白质空间结构最有效的方法是X射线衍射法。近年来，高分辨核磁共振技术在蛋白质的空间结构研究中获得了广泛应用。蛋白质分子中各原子和基团在三维空间所处的相对位置构成的特定空间结构，称为蛋白质的构象（proteinconformation）。天然蛋白质分子都有与其生物活性密切相关的一种或几种特定构象。蛋白质构象十分复杂，可分为二级结构、三级结构和四级结构。具有生物功能的完整蛋白质必定具有三级甚至四级结构。二、蛋白质的空间结构多肽链折叠、盘曲，形成特有而稳81蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链的主链在空间盘曲、折叠所形成的构象。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。它不涉及侧链基团的空间排布。二级结构是由肽键的特殊结构决定的。（一）蛋白质的二级结构

（secondarystructure）

蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链的主链在空间盘82肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。使C-N键具有部分双键的性质。肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。使C83组成肽键的原子处于同一平面。在肽链中，称为肽平面。两个相邻肽键通过一个共同的α-碳原子相连接。Cα-N键和Cα-C键可以自由旋转，因此，在保持肽键平面结构不变条件下，能够形成不同的空间排列。绕Cα-N键旋转的角度称

（角），经Cα-C键旋转的角度称为ψ（角）。原则上，和ψ可以取-180°～+180°之间的任意值（=0，ψ=0的构象不存在）。肽平面蛋白质二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和自由肽段。组成肽键的原子处于同一平面。在肽链中，称为肽平面。两个相邻肽841、-螺旋Pauling和Corey于1952年α-螺旋是蛋白质中最常见、含量最丰富的二级结构。它是多肽链主链围绕中心轴有规律的向左或向右盘绕而形成的一种螺旋状结构。-helix1、-螺旋Pauling和Corey于1952年α-螺旋是85①螺旋每上升一周需要3.6个氨基酸残基，沿螺旋轴方向上升0.54nm，每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm。②α-螺旋中的每一个氨基酸残基的侧链基团伸向螺旋的外侧，相邻螺旋之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与螺旋中心轴平行。氢键是由肽键上的-N-H的氢和它后面（N-端）第四个残基上的-C＝O的氧之间形成的。-螺旋要点①螺旋每上升一周需要3.6个氨基酸残基，沿螺旋轴方向上升086左手和右手螺旋③天然蛋白质中存在的α-螺旋主要是右手螺旋，既螺旋的走向为顺时针方向。-螺旋要点左手和右手螺旋③天然蛋白质中存在的α-螺旋主要是右手螺旋，既87β-折叠也是蛋白质中常见的二级结构，也叫β-折叠片或β-片层结构。它是两条或多条充分伸展成锯齿状折叠构象的肽链侧向聚集，按肽键的长轴方向平行并列，相邻肽链上的-NH和-CO之间形成有规则的氢键，形成折纸状结构。

-pleatedsheet2、-折叠β-折叠也是蛋白质中常见的二级结构，也叫β-折叠片或β-片层88在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm；-折叠在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处89-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。-折叠结构的氢键主要是由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽90在-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的–N-H之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构，又叫μ-型回折、β-弯曲或发夹结构。是在球状蛋白质分子中发现的另一种二级结构。β-转角多数处在球状蛋白质分子的表面，约占球蛋白全部残基的25%左右，含量十分丰富。3、-转角-turnN—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHO在-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨914、自由肽段自由肽段——蛋白质结构中无规则的肽段，多与蛋白质的功能有关。没有一定规律的松散肽链结构。酶的活性部位。4、自由肽段自由肽段——蛋白质结构中无规则的肽段，多与蛋白质92

蛋白质二级结构：α-螺旋、β-折叠、β-转角和自由肽段。蛋白质二级结构：α-螺旋、β-折叠、β-转角和自由肽93（二）蛋白质的超二级结构和结构域在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构聚集体。几种类型的超二级结构：αα；βαβ；βββ．

ααβββαβ★超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域．1、超二级结构（Rossmann，1973）（二）蛋白质的超二级结构和结构域在蛋白质分子94２、结构域（Edelman,1970)对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称结构域。结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。结构域一般由100~200个氨基酸残基组成，但大小范围可达40~400个残基。氨基酸可以是连续的，也可以是不连续的．结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上．④结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。⑤在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性．２、结构域（Edelman,1970)④结构域之间由“铰链区95（三）蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构(TertiaryStructure)是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。(TertiaryStructure)磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶的三级结构（三）蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构(TertiaryS96新编-第3章蛋白质课件97

a盐键（离子键）b氢键c疏水相互作用力d范德华力e二硫键f酯键abcecdda维系这种特定结构的力主要有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。a盐键（离子键）b氢键c疏水相互作用力98（四）蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构(QuaternaryStructure)是由两条或多条具有三级结构的多肽链按一定的空间排列方式，通过非共价键缔合在一起形成的蛋白质大分子，通常称为寡聚蛋白。寡聚蛋白分子中的每一个三级结构单位称为一个亚基（或亚单位，subunit）。它一般由一条肽链构成，无生理活性；连接亚基的非共价键主要为：疏水键、氢键和离子键。四级结构分为均一的（含有相同的亚基）和不均一的（含有不同的亚基）两类。维持亚基之间的化学键主要是疏水力。由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白；(QuaternaryStructure)（四）蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构(Quaternary99血红蛋白(hemoglobin)的四级结构血红蛋白(hemoglobin)的四级结构100两个亚基的结构两个亚基的结构101蛋白质分子中的共价键与次级键

一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→亚基→四级结构蛋白质分子中的共价键与次级键102共价键次级键化学键肽键一级结构氢键二硫键二、三、四级结构疏水键盐键范德华力三、四级结构蛋白质分子中的共价键与次级键离子键氢键范德华力疏水相互作用力共价键次级键化学键肽键一级结构氢键二硫键二、三、四级结构疏103稳定蛋白质的作用力稳定蛋白质的作用力1041、共价键蛋白质分子中的共价键有肽键和二硫键。是生物大分子分子之间最强的作用力，化学物质（药物、毒物等）可以与生物大分子（受体蛋白或核酸）构成共价键，共价键除非被体内的特异性酶催化断裂以外，很难恢复原形，是不可逆过程，对酶来讲就是不可逆抑制作用。1、共价键蛋白质分子中的共价键有肽键和二硫键。是生物大分子分1052、非共价键

生物体系中分子识别的过程不仅涉及到化学键的形成，而且具有选择性的识别。共价键存在于一个分子或多个分子的原子之间，决定分子的基本结构，是分子识别的一种方式。而非共价键（又称为次级键或分子间力）决定生物大分子和分子复合物的高级结构，在分子识别中起着关键的作用。2、非共价键生物体系中分子识别的过程不仅涉及到化学键的形成1061),静电作用

静电作用是指荷电基团、偶极以及诱导偶极之间的各种静电吸引力。酶、核酸、生物膜、蛋白质等生物大分子的表面都具有可电离的基团和偶极基团存在，很容易与含有极性基团的底物或抑制剂等生成离子键和其它静电作用1),静电作用静电作用是指荷电基团、偶极以及诱导偶极之间的107①离子键

生物大分子表面的带电基团可以与药物或底物分子的带电基团形成离子键。这种键可以解离。①离子键生物大分子表面的带电基团可以与药物或底物分子的带电108②偶极-偶极相互作用

两个原子的电负性不同，产生价键电子的极化作用，成为持久的偶极两个偶极间的作用。偶极—偶极相互作用的大小，取决于偶极的大小、它们之间的距离和相互位置。这种相互作用在水溶液中普遍存在。它的作用强度比离子—偶极作用小，但比偶极—诱导偶极作用大。这种作用对药物—受体相互作用的特异性和立体选择性非常重要②偶极-偶极相互作用两个原子的电负性不同，产生价键电子的极1092)，氢键

氢键的形成氢键是由两个负电性原子对氢原子的静电引力所形成，是一种特殊形式的偶极—偶极键。它是质子给予体X-H和质子接受体Y之间的一种特殊类型的相互作用。氢键的大小和方向氢键的键能比共价键弱，比范德华力强，在生物体系中为8.4～33.4kj/mol(2-8kcal/mol)。键长为0.25～0.31nm，比共价键短。氢键的方向用键角表示，是指X—H与H…Y之间的夹角，一般为180～250。2)，氢键氢键的形成氢键是由两个负电性原子对氢原子的静电1103)，范德华力

这是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子核吸引另一个原子外围电子所产生的作用力。它是一种比较弱的、非特异性的作用力。这种作用力非常依赖原子间的距离，当相互靠近到大约0.4～0.6nm(4～6A)时，这种力就表现出较大的集合性质。范德华力包括引力和排斥力，其中作用势能与1/R6成正比的三种作用力（静电力、诱导力和色散力）通称为范德华引力。3)，范德华力这是一种普遍存在的作用力，是一个原子的原子1114),疏水作用

疏水作用是指极性基团间的静电力和氢键使极性基团倾向于聚集在一起，因而排斥疏水基团，使疏水基团相互聚集所产生的能量效应和熵效应。蛋白质和酶的表面通常具有极性链或区域，这是由构成它们的氨基酸侧链上的烷基链或苯环在空间上相互接近时形成的。高分子的蛋白质可形成分子内疏水链、疏水腔或疏水缝隙，可以稳定生物大分子的高级结构。

4),疏水作用疏水作用是指极性基团间的静电力和氢键使极性基112三、蛋白质分子结构与功能的关系（一）蛋白质一级结构与功能的关系

蛋白质一级结构的改变有可能影响它的功能，有些改变甚至引起其功能的完全丧失。而一级结构的改变能否影响其生物功能，关键是看这种改变是否引起了构象的改变。进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。三、蛋白质分子结构与功能的关系（一）蛋白质一级结构与功能的113例1镰刀形贫血病（sick-cellanemia）患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-S），它与正常的血红蛋白（Hb-A）的差别：仅仅在于β链的N-末端第6位残基发生了变化。（Hb-A）第6位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性的缬氨酸残基，使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，输氧能力下降，易发生溶血。这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性。例1镰刀形贫血病（sick-cellanemia）114体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子.例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽.信号肽被切去，剩下的是胰岛素原。胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.例2一级结构的局部断裂与蛋白质的激活(酶原的激活）例2一级结构的局部断裂与蛋白质的激活(酶原的激活）115例3同源蛋白同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近.例：细胞色素C60个物种中，有27个位置上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基.可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）.例3同源蛋白116（二）蛋白质空间结构与功能的关系

1、蛋白质的变性

一些物理因素（如加热、加压、射线等）和化学因素（如强酸、强碱和有机溶剂等）会破坏蛋白质的空间结构，导致蛋白质生物活性的丧失，同时引起某些物理化学性质的变化，如溶解度降低、发生沉淀等，这类现象叫蛋白质的变性。变性蛋白质和天然蛋白质在一级结构上相同，只是空间结构发生改变，因而生物活性随之丧失。

在有些情况下，变性作用是可逆的，只要除去变性因素，蛋白质的空间结构还可逐渐恢复，重新恢复其生物活性。变性蛋白质分子恢复其天然形式，称为复性。

蛋白质空间结构的改变会引起功能的改变！（二）蛋白质空间结构与功能的关系1、蛋白质的变性117蛋白质的热变性是因为在较高的温度下，保持蛋白质空间结构的次级键断裂，破坏了肽键特定的空间排列，原来在分子内部的一些非极性疏水侧链暴露到分子表面，因而降低了蛋白质分子的溶解度，促进蛋白质分子间相互结合而凝聚，继而形成不可逆的凝胶而凝固沉淀。

蛋白质热变性的机理：蛋白质的热变性是因为在较高的温度下，保持蛋白118变性蛋白质的特性溶解度显著减小。不溶于水，在中性溶液中可沉淀或凝固，但溶于酸碱溶液。结晶及生物学活性皆消失。黏度和旋光性负值及分子的不对称性增加，等电点提高。反应基团如SH-基、-S-S-基等数目增加。易被酶氧化。变性蛋白质的特性溶解度显著减小。不溶于水，在中性溶液中可沉淀119蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固—天然蛋白质变性后，变性蛋白质分子互相凝聚或互相穿插缠结在一起的现象。凝固作用分两个阶段：

第一阶段：变性。

第二阶段：失去规律的肽链聚集缠结在一起而凝固或结絮。例：鸡蛋加热。热杀菌。思考题：如何辩证的看待蛋白质的变性和凝固作用（从生命现象、人类生活和生产各方面考虑）？蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固—天然蛋白质变性后，变性蛋白质分1202、蛋白质的变构效应（别构效应，allostericeffect）

多亚基蛋白质（四级结构）中的一个亚基空间结构的改变会引起其它亚基空间结构的改变，从而使蛋白质功能和性质发生一定的改变，叫蛋白质的变（别）构效应。蛋白质空间结构与功能的关系举例：1、折叠病。2、疯牛病。

α-螺旋β-折叠正常蛋白质朊病毒未知因素疯牛病侵入牛脑蛋白质构象改变2、蛋白质的变构效应（别构效应，allostericeff1213.4蛋白质的理化性质一、分子质量蛋白质相对分子量在10000~1000000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。1、最准确可靠的方法---超离心法（Svedberg于1940年设计）蛋白质颗粒在60000～80000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动，用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度。蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关。沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。一个S单位，为1×10-13秒相对分子质量越大，S值越大蛋白质的沉降系数：1～200S3.4蛋白质的理化性质一、分子质量蛋白质相122

s=

————vω2xv=沉降速度（dx/dt）ω=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系：M=——————RTsD（1－Vρ）R——气体常数（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——绝对温度D——扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）V——蛋白质的微分比容（m3·g-1）ρ——溶剂密度（20℃，g·ml-1）s——沉降系数s=————vω2xv=沉降速度（dx/dt）蛋1232.凝胶过滤法凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构。一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex。测得几种标准蛋白质的洗脱体积。从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量。2.凝胶过滤法1243.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂。普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）。用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理，蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物。不同蛋白质分子的均带负电（SDS带负电）；且荷质比相同（蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少）不同蛋白质分子具有相似的构象。用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图。测出待测样品的迁移率。从标准曲线上查出样品的相对分子质量。3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法125★影响迁移率的主要因素凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会产生不同的阻力〔主要因素〕凝胶的浓度和交联度同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小★优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品缺点：误差大，约为±10％（误差主要来源于迁移距离的测量误差）★此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量+—-+1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。★影响迁移率的主要因素+—-+1）圆盘电泳：玻璃管中进行的126等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。++－－－－+－－－－－5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再127二、渗透压和透析

由于蛋白质的分子量很大，蛋白质溶液的摩尔浓度一般是很小的。所以蛋白质溶液的渗透压很低。

将混有小分子化合物（如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、短肽以及表面活性剂等）的蛋白质溶液盛入半透膜内放入透析液（通常为蒸馏水或缓冲液）中，由于蛋白质分子体积大，不能透过半透膜，而溶液中的其他小分子物质则能透过半透膜进入透析液中，从而使蛋白质与小分子物质完全分开，这个分离过程叫透析（Dialysis）。常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料。此法是蛋白质分离纯化中常用的简便方法之一。二、渗透压和透析由于蛋白质的分子量很大，蛋128三、胶体性质

由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）；2）带相同电荷（双电层）。三、胶体性质由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶129四、两性解离和等电点蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在碱性介质（pH>pI）中，蛋白质分子带负电荷；在酸性介质（pH<pI）中，蛋白质分子带正电荷。当蛋白质分子处于某一pH值的环境时，所带正、负电荷恰好相等，即净电荷为零，呈两性离子状态，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时(pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。四、两性解离和等电点蛋白质与多肽一样，能够发生两130五、蛋白质的电泳带电的蛋白质胶粒，在电场中向与自身所带电荷相反的电极泳动的现象，称为蛋白质的电泳。电泳的速度取决于蛋白质颗粒大小和所带电荷的多少。在一定的pH条件下，各蛋白质所带电量不同，在电场中就会以不同速度泳动，根据这一原理可将混合蛋白质予以分离。五、蛋白质的电泳带电的蛋白质胶粒，在电场中向与自身所1311.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。（1）纸上电泳：用滤纸作支持物。（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。1.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。2.区带132六、蛋白质的沉淀因此，蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，水膜和电荷一旦被除去时，蛋白质就会聚集在一起而形成较大的蛋白质团，最后从溶液中沉淀出来。

通过向蛋白质溶液中加电解质中和电荷，加脱水剂破坏水化层，或调节溶液pH值到蛋白质的等电点，都可以引起蛋白质的沉淀。蛋白质在溶液中靠水化层和双电层保持其稳定性。六、蛋白质的沉淀因此，蛋白质胶体溶液的稳定133在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。可逆沉淀在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶134在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。不可逆沉淀在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破1351.盐析向蛋白质溶液中加入大量中性盐如NaCl、KCl、Na2SO4等时，可产生两种现象：⑴盐溶：在盐浓度很低的范围内，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度也随之增加，这种现象称为盐溶。

机理：蛋白质表面电荷吸附盐离子后，增加了蛋白质和水的亲和力，促进了蛋白质的溶解。⑵盐析：与盐溶作用相反，当溶液中盐浓度提高到一定的饱和度时，蛋白质溶解度逐渐降低，蛋白质分子发生絮结，形成沉淀析出，这种现象称为盐析。

机理：在高浓度的中性盐作用下，蛋白质胶粒的水化层被破坏，其电荷也被异性离子所中和，蛋白质胶粒失去这两种稳定因素后便发生聚集沉淀。

1.盐析⑴盐溶：在盐浓度很低的范围内，随着盐浓度的增加，蛋1362.有机溶剂沉淀

有机溶剂也可以使蛋白质发生沉淀。机理：水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇等与水亲和力大，能与水以任何比例互溶。当蛋白质水溶液中加入适量这类有机溶剂时，它能夺取蛋白质颗粒表面的水化膜，同时还能降低水的介电常数，增加蛋白质颗粒间的静电相互作用，导致蛋白质分子聚集絮结沉淀。

2.有机溶剂沉淀有机溶剂也可以使蛋白质发生1373.重金属盐沉淀

当溶液pH值大于蛋白质的等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，易与带正电荷的金属离子如Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等结合，生成不溶性盐类，沉淀析出。4.酸类沉淀

当溶液的pH值低于蛋白质的等电点时，蛋白质分子以阳离子形式存在，易与一些生物碱试剂如苦味酸、鞣酸、磷钨酸、磷钼酸及三氯醋酸等酸类作用，生成不溶性盐沉淀，并伴随有蛋白质变性发生。

5.热凝固沉淀

蛋白质受热变性后，再加少量盐类或将pH值调至等电点，则很容易发生凝固沉淀。变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固。3.重金属盐沉淀当溶液pH值大于蛋白质的等电点时，蛋白质颗138七、蛋白质的颜色反应反应名称试剂颜色反应有关基团有此反应的蛋白质或氨基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应HgNO3、HgNO2HNO2及HNO3红色

Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色橘色

Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色

Trp坂口反应(Sakaguchi反应)α-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基α-氨基酸七、蛋白质的颜色反应反应名称试剂颜色反应有关基团139大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。蛋白质的紫外吸收大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。蛋白质140本章结束！本章结束！141血红素在蛋白中的位置血红素在蛋白中的位置142免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的结构143免疫球蛋白G人的免疫球蛋白可分为五大类，其分子量范围从150000到950000道尔顿。免疫球蛋白M(IgM)是对一个抗原作出反应时产生的第一个抗体。免疫球蛋白G(IgG)是一类最简单的免疫球蛋白。IgG含有两条相同的高分子量的重链(heavychain)和两条相同的低分子量的轻链(lightchain)。四条链通过二硫键共价联接成Y字形结构。每一免疫球蛋白分子含有二个抗原结合部位，它们位于Y形结构的二个顶点。

免疫球蛋白G人的免疫球蛋白可分为五大类，其分子量范围从150144立体结构模型立体结构模型145抗体的特点抗体具有两个最显著的特点，一是高度特异性，二是多样性。高度特异性就是一种抗体一般只能与引起它产生的相应抗原发生反应。抗原—抗体复合物往往是不溶的，因此常从溶液中沉淀出来，此即“沉淀反应”。在体外，沉淀反应已被广泛用于研究抗原—抗体反应，并成为免疫学的基础。多样性就是它们可以和成千上万的各种抗原(天然的和人工的)起反应。—般说来，一个抗原与接受该抗原的动物关系愈远，则产生抗体所需的时间愈短，抗体反应也愈强。抗体的特点抗体具有两个最显著的特点，一是高度特异性，二是多样146抗原抗体的作用抗原抗体的作用147抗原某些低分子量的物质可以与抗体结合，但它们本身不能刺激抗体的产生。如果它们与大分子紧密结合，则能刺激抗体的产生。这些小分子物质称为半抗原(hapten)。几乎所有外来的蛋白质都是抗原，并且每种蛋白质都能诱导特异抗体的产生。一个人得体内在任一个给定时刻大约有10000种抗体存在。

抗原某些低分子量的物质可以与抗体结合，但它们本身不能刺激抗体148第一篇物质篇第3章蛋白质第一篇物质篇第3章蛋白质1493.1蛋白质的化学组成与分类3.2氨基酸与肽3.3蛋白质的分子结构3.4蛋白质的理化性质3.5蛋白质的功能性质及其在食品加工中的应用3.1蛋白质的化学组成与分类3.2氨基酸与肽3.3150蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。蛋白质是食品的主要营养成分，除保证食品的营养价值外，在决定食品特征上也起重要作用。蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和151早在1878年，思格斯就在《反杜林论》中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。”

可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断。早在1878年，思格斯就在《反杜林论》中指出：“生命是蛋白体152蛋白质的生物学意义1.生物体的组成成分2.酶3.运输4.运动5.抗体6.干扰素7.遗传信息的控制8.细胞膜的通透性9.高等动物的记忆、识别机构木瓜蛋白酶蛋白质的