过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1-图文

过表达慢病毒载体构建和包装手册Version1.0吉凯基因二零一一年五月目录简介……………………3第一部分过表达慢病毒载体的制备实验流程……………4实验材料…………5过表达克隆制备……………………6第二部分慢病毒包装与滴度检测实验流程……………17实验材料……………18Lentivirus病毒包装………………21病毒的收获及浓缩…………………22Lentivirus滴度测定………………24参考文献………………33简介慢病毒(Lentivirus载体是以人类免疫缺陷型病毒(HIV为基础发展起来的基因治疗载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒,即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险,吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒,除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性,否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper1.0载体和pHelper2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件,例如WRE(woodchuckhepatitisvirusposttranscriptionalregulatoryelement。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper1.0载体中含有HIV病毒的gag基因,编码病毒主要的结构蛋白;pol基因,编码病毒特异性的酶;rev基因,编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因,提供病毒包装所需要的包膜蛋白。吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装,获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒,以满足不同的实验需求。本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程,目的是为了方便大家交流使用,部分细节内容未能做到一一详述,敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题,提出宝贵的意见。第一部分过表达慢病毒载体的制备一、流程图从含有目的基因的质粒中,利用PCR方法钓取目的基因,将目的载体进行酶切,酶切产物电泳回收后进行交换,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的即为构建成功的目的质粒。二、实验材料描述a主要试剂试剂名称试剂来源cat.No.1kpDNAladderMarkerFermentas公司#SM0311250bpDNAladderMarker捷瑞公司DL250+,100T琼脂糖赛百盛公司GA4-100限制性内切酶NEB公司R0136VIn-Fusion™PCRCloningKitclontech639626TaqpolymeraseSinoBioE001-02BdNTPTakaraD4030APrimer捷瑞生物Plasmid抽提KitPromegaA1460b主要仪器仪器名称仪器来源cat.No.PCR仪AppliedBiosystems公司2720thermalcyclerpositiveclone测序美季生物技术ABI3730型稳压DNA电泳仪BioRad公司凝胶成像仪天能公司细菌摇床华利达实验设备公司HI-9211K细菌培养箱上海一恒科学仪器有限公司Gilson移液器吉尔森公司高速离心机日立公司TGL-16G-A三、过表达克隆制备——以STK39基因为例描述详细实验过程1.基因信息:Symbol:STK39Accession:Organism:HumanDescription:Homosapiensserinethreoninekinase39(STK39,mRNA.2.工具载体:3.载体酶切:酶切反应温度:37℃酶切反应时间:2h酶切反应体系:1.1.1载体酶切结果:1.2目的基因片段的获取1.2.1引物引物说明:含交换配对碱基、酶切位点(下划线标记的,表达增强序列(双下划线记的以及目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因1.2.2PCR扩增目的基因片段PCR反应体系:PCR反应条件:94℃5min94℃30sec55℃30sec72℃2min72℃10min4℃∞1.2.3PCR结果30cycle1.3重组质粒构建模式图1.3.1PCR产物交换入线性化表达载体反应条件:25℃30分钟→42℃15分钟反应体系:反应体系(µL:阳性对照自连对照实验组ddH2O17.5-X-Y17.5-X17.5-X-Y10×In-Fusion交换酶缓冲液222In-Fusion交换酶0.50.50.5线性化载体DNAXXX纯化后PCR产物片段Y0Y说明:a加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的摩尔数比例为:1:3~1:9之间b阳性对照加入的纯化的PCR产物为GAPDH基因(同样带有交换臂1.3.2制备感受态细胞:配置下述溶液:10.1MCaCl2溶液,以0.22µm过滤除菌。2250mMKCl2溶液。32MMgCl2溶液,高压灭菌。4SOB:1ml250mMKCl2溶液加入100mlLB,以5MNaOH调PH值至7.0,高压灭菌,临用前加入0.5ml2MMgCl2溶液。用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞1从于37oC培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落,转到一个含有100mlLB培养基的1L烧瓶中。于37oC剧烈振摇培养3小时(旋转摇床,300转/分。2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中,在冰上放置10分钟,使培养物冷却至0oC。3于4oC,以4000转/分离心10分钟,回收细胞。4倒出培养液,将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。5以10ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份沉淀,放置于冰浴上。6于4oC,以4000转/分离心10分钟,回收细胞。Total2020207倒出培养液,将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。8每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀。9将细胞分装成小份,放于-70oC冻存。(感受态细胞制备参考:分子克隆实验指南第二版55页1.3.3转化:1用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200µL转移到无菌的微量离心管中,每管加10µL连接液,轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30分钟。2将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上,恰恰放置90秒,不要摇动EP管架。3快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却l—2分钟。4每管加800µLLB培养基。用水浴将培养基加温至37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45分钟使细菌复苏。5将150µL已转化的感受态细胞转移到AMP抗性(100ug/ml的LB琼脂培养基上。6将平板置于室温直至液体被吸收。7倒置平皿,于37℃培养,16小时。8长出的克隆进行后续PCR鉴定。(转化操作参考:分子克隆实验指南第二版55-56页1.4阳性克隆的PCR鉴定1.4.1引物引物说明:本对引物一个位于目的基因中,一个位于载体上,用于菌落PCR鉴定转化子1.4.2PCR鉴定PCR反应体系:PCR反应条件:94℃3min94℃30sec60℃30sec72℃30sec72℃5min4℃∞1.4.3PCR结果30cycle样品说明:接种阳性转化子,37℃培养16小时后保存为甘油菌,分装200µL送测序1.5阳性克隆测序结果及结果分析:>ref|NM_016866.2|Musmusculusserine/threoninekinase39,STE20/SPS1homolog(yeast(Stk39,mRNAgb|BC064443.1|Musmusculusserine/threoninekinase39,STE20/SPS1homolog(yeast,mRNA(cDNAcloneMGC:69607IMAGE:6843981,completecdsLength=3268GENEID:53416Stk39|serine/threoninekinase39,STE20/SPS1homolog(yeast[Musmusculus](Over10PubMedlinksScore=3083bits(1669,Expect=0.0Identities=1669/1669(100%,Gaps=0/1669(0%Strand=Plus/PlusQuery84CATGGCGGAGCCGAGCGGCTCGCCTGTGCACGTCCAGCTTTCCCAGCAggcggccccggt143||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct104CATGGCGGAGCCGAGCGGCTCGCCTGTGCACGTCCAGCTTTCCCAGCAGGCGGCCCCGGT163Query144gacagcggcggcggcgacggccccggcggccgcgacatcagcaccagccccggccccggc203||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct164GACAGCGGCGGCGGCGACGGCCCCGGCGGCCGCGACATCAGCACCAGCCCCGGCCCCGGC223Query204cccggctccggcggcgtccgcagccccggccccggctccagctgctgctccagccccggc263||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct224CCCGGCTCCGGCGGCGTCCGCAGCCCCGGCCCCGGCTCCAGCTGCTGCTCCAGCCCCGGC283Query264cccGGCAGCTCAGGCGGTCGGCTGGCCCATCTGCAGGGACGCGTACGAGCTCCAGGAGGT323||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct284CCCGGCAGCTCAGGCGGTCGGCTGGCCCATCTGCAGGGACGCGTACGAGCTCCAGGAGGT343Query324TATCGGCAGCGGAGCAACTGCGGTGGTTCAGGCAGCCCTATGCAAACCCAGGCAAGAACG383||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct344TATCGGCAGCGGAGCAACTGCGGTGGTTCAGGCAGCCCTATGCAAACCCAGGCAAGAACG403Query384CGTAGCCATAAAGCGGATCAACTTGGAAAAATGCCAGACGAGTATGGATGAACTCCTGAA443||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct404CGTAGCCATAAAGCGGATCAACTTGGAAAAATGCCAGACGAGTATGGATGAACTCCTGAA463Query444AGAAATTCAAGCCATGAGCCAATGCAGCCATCCCAACGTAGTGACTTATTACACCTCCTT503||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct464AGAAATTCAAGCCATGAGCCAATGCAGCCATCCCAACGTAGTGACTTATTACACCTCCTT523Query504TGTGGTCAAAGATGAGCTGTGGCTGGTCATGAAATTACTAAGTGGAGGTTCCATGTTGGA563||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct524TGTGGTCAAAGATGAGCTGTGGCTGGTCATGAAATTACTAAGTGGAGGTTCCATGTTGGA583Query564TATCATCAAATACATCGTTAATCGAGGAGAACATAAAAATGGTGTCCTAGAAGAGGCGAT623||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct584TATCATCAAATACATCGTTAATCGAGGAGAACATAAAAATGGTGTCCTAGAAGAGGCGAT643Query624AATTGCAACAATTCTTAAGGAGGTTTTGGAAGGTTTAGACTATCTGCACAGAAACGGTCA683||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct644AATTGCAACAATTCTTAAGGAGGTTTTGGAAGGTTTAGACTATCTGCACAGAAACGGTCA703Query684GATCCATAGGGATTTGAAAGCTGGAAATATTCTTCTGGGTGAGGATGGCTCAGTACAAAT743||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct704GATCCATAGGGATTTGAAAGCTGGAAATATTCTTCTGGGTGAGGATGGCTCAGTACAAAT763Query744AGCAGATTTTGGAGTAAGCGCATTCTTAGCCACAGGGGGTGATGTTACACGGAATAAAGT803||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct764AGCAGATTTTGGAGTAAGCGCATTCTTAGCCACAGGGGGTGATGTTACACGGAATAAAGT823Query804CAGAAAAACATTTGTTGGTACCCCATGTTGGATGGCCCCTGAAGTCATGGAACAGGTGAG863||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct824CAGAAAAACATTTGTTGGTACCCCATGTTGGATGGCCCCTGAAGTCATGGAACAGGTGAG883Query864AGGCTATGACTTCAAGGCTGATATGTGGAGTTTTGGAATAACTGCCATTGAATTAGCAAC923||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct884AGGCTATGACTTCAAGGCTGATATGTGGAGTTTTGGAATAACTGCCATTGAATTAGCAAC943Query924CGGAGCAGCGCCTTACCACAAATACCCTCCAATGAAAGTGCTAATGCTGACTTTGCAAAA983||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct944CGGAGCAGCGCCTTACCACAAATACCCTCCAATGAAAGTGCTAATGCTGACTTTGCAAAA1003Query984TGACCCGCCCACTTTAGAAACTGGTGTAGAGGATAAAGAAATGATGAAAAAATACGGCAA1043||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1004TGACCCGCCCACTTTAGAAACTGGTGTAGAGGATAAAGAAATGATGAAAAAATACGGCAA1063Query1044GTCCTTCAGAAAGTTACTGTCACTGTGTCTTCAGAAAGATCCTTCCAAAAGGCCCACAGC1103||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1064GTCCTTCAGAAAGTTACTGTCACTGTGTCTTCAGAAAGATCCTTCCAAAAGGCCCACAGC1123Query1104AGCAGAACTTTTAAAATGCAAGTTCTTCCAGAAAGCCAAGAACAGAGAGTACCTGATCGA1163||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1124AGCAGAACTTTTAAAATGCAAGTTCTTCCAGAAAGCCAAGAACAGAGAGTACCTGATCGA1183Query1164GAAGCTGCTGACAAGAACCCCAGACATAGCCCAAAGAGCCAAGAAGGTAAGGCGAGTTCC1223||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1184GAAGCTGCTGACAAGAACCCCAGACATAGCCCAAAGAGCCAAGAAGGTAAGGCGAGTTCC1243Query1224TGGGTCGAGCGGTCACCTTCATAAGACTGAAGACGGCGACTGGGAGTGGAGCGATGACGA1283||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1244TGGGTCGAGCGGTCACCTTCATAAGACTGAAGACGGCGACTGGGAGTGGAGCGATGACGA1303Query1284GATGGATGAGAAGAGCGAGGAGGGGAAGGCAGCCGCCTCCCAAGAGAAGTCACGAAGAGT1343||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1304GATGGATGAGAAGAGCGAGGAGGGGAAGGCAGCCGCCTCCCAAGAGAAGTCACGAAGAGT1363Query1344AAAAGAAGAGAACTCAGAGATCTCGGTGAATGCTGGTGGCATCCCTGAGCAAATACAGTC1403||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1364AAAAGAAGAGAACTCAGAGATCTCGGTGAATGCTGGTGGCATCCCTGAGCAAATACAGTC1423Query1404TCTCTCTGTGCACGACTCTCAGGCCCAACCAAACGCTAATGAAGACTACAGAGAAGGTCC1463||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1424TCTCTCTGTGCACGACTCTCAGGCCCAACCAAACGCTAATGAAGACTACAGAGAAGGTCC1483Query1464TTGTGCAGTCAACCTTGTTTTAAGATTAAGAAACTCCAGAAAGGAACTTAATGACATACG1523||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1484TTGTGCAGTCAACCTTGTTTTAAGATTAAGAAACTCCAGAAAGGAACTTAATGACATACG1543Query1524ATTTGAGTTTACTCCAGGAAGAGATACAGCAGACGGTGTGTCTCAGGAGCTCTTCTCTGC1583||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1544ATTTGAGTTTACTCCAGGAAGAGATACAGCAGACGGTGTGTCTCAGGAGCTCTTCTCTGC1603Query1584TGGCTTGGTTGACGGCCATGATGTAGTTATAGTGGCTGCTAATTTACAGAAGATTGTAGA1643||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1604TGGCTTGGTTGACGGCCATGATGTAGTTATAGTGGCTGCTAATTTACAGAAGATTGTAGA1663Query1644TGACCCCAAAGCTTTAAAAACGTTGACATTTAAGTTGGCTTCTGGCTGCGATGGGTCGGA1703||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1664TGACCCCAAAGCTTTAAAAACGTTGACATTTAAGTTGGCTTCTGGCTGCGATGGGTCGGA1723Query1704GATTCCTGATGAAGTGAAGCTGATCGGGTTCGCCCAGTTGAGTGTGAGC1752|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1724GATTCCTGATGAAGTGAAGCTGATCGGGTTCGCCCAGTTGAGTGTGAGC1772比对说明:Query是我们得到的测序结果;Sbjct是目标基因序列;Identities=100%,说明测序结果与目标序列完全一致第二部分慢病毒包装与滴度检测一、实验流程制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染293T细胞,转染后8h更换为完全培养基,培养48h后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。在一定滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求,流程图见Fig.6。二、实验材料1.细胞株293T,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养基为DMEM(含10%FBS。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。2.菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。3.病毒载体1GV载体图谱:[具体结构请参考“第一部分过表达慢病毒载体的制备”]2pHelper1.0载体图谱:3pHelper2.0载体图谱:DNA溶液的制备:以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒DNA,质粒DNA溶于除菌的TE中,以紫外光吸收法测定其浓度及纯度,保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8~2.0之间。4.试剂试剂名称试剂来源Cat.No.台盼兰上海捷倍思基因技术有限公司胎牛血清FBS上海微科生化试剂有限公司A11-102DMSO上海生物试剂厂DMEMGIBCO12800-017胰酶上海化学试剂公司Lipofectamine2000Invitrogen11668-5005.仪器仪器名称仪器来源Cat.No.荧光显微镜奥林帕斯micropublisher3.3RTVCO2培养箱日本三洋SANYOMCO-175生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio1200-Ⅱ-A2Plus-20离心超滤装置MILLIPOREufc910024三、Lentivirus病毒包装1.转染前24h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2x107细胞/20ml,重新接种于15cm细胞培养皿,37℃、5%CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70%~80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要,因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。2.转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。3.向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg,pHelper1.0载体15μg,pHelper2.0载体10μg,与相应体积的Opti-MEM混合均匀,调整总体积为2.5ml,在室温下温育5分钟。4.将Lipofectamine2000试剂轻柔摇匀,取100lLipofectamine2000试剂在另一管中与2.4mlOpti-MEM混合,在室温下温育5分钟。5.把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合,轻轻地颠倒混匀,不要振荡。必须在5分钟之内混合。6.混合后,在室温下温育20分钟,以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物。7.将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中,混匀,于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。8.培养8h后倒去含有转染混和物的培养基,每瓶细胞加入20ml的PBS液,轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物,然后倒去。9.每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25ml,于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时。四、病毒的收获及浓缩1.收集转染后48小时(转染即可为0小时计起的293T细胞上清液。2.于4℃,4000g离心10min,除去细胞碎片。3.以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。4.把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml,盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。5.组合好后,做好平衡,放在转头上。6.在4000×g离心,至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。7.离心结束后,取出离心装置,将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。8.将过滤杯倒扣在样品收集杯上。9.离心力不超过1000g,时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把过滤杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。10.将病毒浓缩液移出,分装后保存在病毒管中,-80度长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。[详情登陆/网站,查看CentriconPlus-20,P31925信息]五、Lentivirus滴度测定1.荧光法测定滴度1测定前一天,为测定滴度所需的细胞(吉凯基因公司用的293T细胞:贴壁生长铺板,96孔板,每个孔加4×104个细胞,体积为100μl。2根据病毒的预期滴度,准备7~10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl的无血清培养基。3取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中,混匀后,取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。4选取所需的细胞孔,吸去90μl培养基,丢弃。加入90μl稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。524小时后,加入完全培养基100μl。小心操作,不要吹起细胞。64天后,观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少2.药筛法测定滴度1~5步骤与“1荧光法测定滴度”相同,感染后48小时加入抗性药物(puromycin,Sigma-Aldrich,Cat.P9620,维持药物浓度在5μg/ml。继续培养2天,观察细胞生长状况。样品说明:第一个Ep管中加入10ul病毒原液,记为1E+1μl;第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释,所得病毒原液为第一个Ep中的1/10,记为1E+0μl;第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释,所得病毒原液为第二个Ep中的1/10,记为1E-1μl;依次类推…第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释,所得病毒原液为第六个Ep中的1/10,记为1E-5μl;第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释,所得病毒原液为第七个Ep中的1/10,记为1E-6μl;滴度荧光照片:[仅供参考]样品组明视野100x荧光视野100x1E+0μl1E-1μl1E-2μl1E-3μl1E-4μl1E-5μl1E-6μl根据荧光图片中GFP表达情况,比如,在加入1E-6μl病毒原液的孔中观察到2个带有荧光的细胞,说明该孔中至少有2个病毒颗粒感染了细胞,则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量,就是2/(1E-6=2E+6,单位为TU/μl,也就等于2E+9TU/ml。如果是带有puromycin抗性的慢病毒,通过感染后的活细胞数量来判断滴度数值,如果在加入1E-5μl病毒原液的孔中观察到3个细胞存活,说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞,则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量,本例子中就是3/(1E-5=3E+5,单位为TU/μl,也就等于3E+8TU/ml。3.Realtime定量PCR法测定滴度1样品制备1.检测前一天,对293T细胞传代,每个24孔中加1×105个细胞,体积为500μl;2.次日,准备7~10个无菌的Ep管,在每个管中加入90μl的培养基(DMEM+10%FBS;3.取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中,混匀后,取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管;4.选取所需的细胞孔,吸去90μl培养基。加入稀释好的病毒溶液。放入37℃,5%CO2培养箱中培养;5.24小时后,加入新鲜培养基500μl。小心操作,不要吹起细胞,维持细胞正常生长;6.4天后,抽提RNA准备做RT-qPCR。说明:第一个Ep管中加入10μl病毒原液,记为1E+1μl;第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释,所得病毒原液为第一个Ep管中的1/10,记为1E+0μl;第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释,所得病毒原液为第二个Ep管中的1/10,记为1E-1μl;第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释,所得病毒原液为第六个Ep管中的1/10,记为1E-5μl;2总RNA抽提说明:根据Invitrogen公司的TRIZOL操作说明书进行,均为RNase-free操作。1.去细胞上清,每孔加入1mlTRIZOL吹打,室温静置5min,后转移至另一新的1.5mleppendorf管中。2.每管加入200µl氯仿,用力震荡15s,室温静置15min。3.4℃,12000rpm,离心15min。4.从每管中吸取上清至另一新的1.5mleppendorf管。加入等体积-20℃预冷的异丙醇,混匀后-20℃沉淀10min。5.4℃,12000rpm离心10min后,去上清。6.加入至少1ml4℃预冷的75%乙醇,洗涤沉淀及离心管壁。7.4℃,10000rpm离心5min,弃上清。8.4℃,10000rpm再次离心5min,吸去残液,室温干燥(不需完全干燥。9.加入20µlRNase-free水,至完全溶解,紫外分析测定所抽提RNA的浓度。3RNA逆转录获cDNAM-MLV逆转录酶和dNTP购自PROMEGA公司。OligodT购自上海生工。RNase-free的物品都购自Axygen。说明:根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行,均为RNase-free操作。Protocol:1.将1µlOligodT(0.5µg/µl和2.0µgTotalRNA加入到PCR小管中,补充DEPC-H2O至9µl。混匀后离心,70℃温浴10min。之后立即插入到0℃冰水浴中,使OligodT和模板退火。2.按下表的比例,根据反应管数算出所需的试剂量。将M-MLV酶等在冰上混匀,得到RT反应液。3.在每个反应管中加入的11µl的RT反应液,混匀后离心。试剂每管加入量5×RTbuffer4µl10mMdNTPs2µlRNasin0.5µlM-MLV-RTase1µlDEPCH2O3.5µl4.RT反应在42℃进行1hour后完成,之后用70℃处理10min使RT酶失活。5.得到的RT反应产物-cDNA可立即用于PCR,也可保存在-80℃以后使用。4Real-timePCR检测Real-timePCR在TAKARA的TP800上完成。SYBRMasterMixture来自TAKARA.1.按下列比例配置反应体系:试剂每管加入量SYBRpremixextaq:10µl上游引物(5µM:1.0µl下游引物(5µM:1.0µlcDNA1.0µl水7.5µl2.设定程序为两步法Real-Time定量。预变性95℃,15S,之后每一步变性95℃,5S,退火延伸60℃,30S,共进行40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。Cycle1:(1XStep1:95.0℃for00:15.Cycle2:(40XStep1:95.0℃for00:05.Step2:60.0℃for00:30.Datacollectionandreal-timeanalysisenabled.3.制作熔解曲线。PCR结束后,在95℃变性1min。然后冷却至55℃,使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃,每一步增加0.5℃,保持30S,同时读取吸光值。Cycle3:(1XStep1:95.0℃for01:00.Cycle4:(1XStep1:55.0℃for01:00.Cycle5:(81XStep1:55.0℃-95.0℃for00:30.Increasesetpointtemperatureaftercycle2by0.5℃示例:Real-time定量PCR法测定GFP-tagged慢病毒滴度引物信息:被扩增的片段位置:211bp-496bpTmGC%上游引物序列:TGCTTCAGCCGCTACCC57.464.7下游引物序列:AGTTCACCTTGATGCCGTTC57.350.0NM_001101被扩增的片段位置:932bp-1233bpTmGC%上游引物序列:GTGGACATCCGCAAAGAC52.655.6下游引物序列:AAAGGGTGTAACGCAACTA51.042.1Real-time定量PCR结果:下图为实时定量PCR曲线图:具体数值:样品ActinCt值GFPCt值GFPCt均值注:曲线颜色和样品颜色相同。加入不同病毒量的细胞样品，通过提取总RNA后反转录为cDNA，然后进行定量PCR检测，通过比较control组和试验组的Ct值差异判断滴度值。通常情况下，认为Ct值差异2以上存在显著差异。反转录反应所获得的20μlcDNA中只取了1μl用于实时定量检测，所以该结果仅表示1/20样品的情况，所以在滴度计算时应该乘以系数20。在本次滴度检测中，1.00E-03μl组样品和control组样品的Ct值