上海交大网络课程检验微生物讲义12(1)讲课教案

学习好资料第十真菌一

教大要、掌真菌的定义、主要生物学性状及主要病原性真菌的致病性、了浅部感染性真菌的种类和基本性状、掌深部感染真菌和条件致病性真菌的生物学性状和检验技术二

教内精(一)真菌概述真菌为真核细胞型微生物，不含叶绿素，无根、茎、叶的分化。具有细胞核和较为完善的细胞器。细胞壁含有几丁质β葡聚糖。真菌种类繁多，约万种。仅300余对人类致病。近年来真菌感染有所增加，与AIDS行、肿瘤和慢性消耗性疾病等导致人群免疫力下降、抗生素滥用引起菌群失调等有关。单细胞真菌又称酵母菌呈圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖。有酵母菌和类酵母菌，在固体培养基上生长的菌落与细菌菌落相似。临床常见的有隐球菌和假丝酵母菌。多细胞真菌由菌丝和孢子交织组成为丝状菌或霉菌子在适宜条件下发芽伸长成芽管，逐进延长呈丝状，称为菌丝。菌丝分枝交织成团形成菌丝体。有的菌丝向上生长，称为气生菌丝有的伸入培养基中为营养菌丝产生孢子的称为生殖菌丝的菌丝内可见隔膜，将菌丝分隔成多个细胞，隔膜上有小孔，容许细胞质流通，称为有隔菌丝。大多致病性真菌的菌丝为有隔菌丝些丝内无隔膜为无隔菌丝隔丝内有多个细胞核。菌丝有多种形态可以根据不同态鉴别真菌子是真菌的繁殖结构可分为有性孢子和无性孢子多病原性真菌形成无性孢子类型生孢子状孢子和孢子囊孢子。有些真菌在不同的环境条件下种形态可以互相转换如组织胞浆菌、孢子丝菌、球孢子菌等在含有动物蛋白的培养基上37培养时为酵母菌型，在25普通培养基上呈丝状菌。真菌对干燥、紫外线有较强抵抗力，紫外线须照射钟能杀死。不耐热℃小时即被杀死。对常用消毒剂有较强抵抗力，对石炭酸、升、碘酒较敏感。常用抗细菌的抗生素不敏感，两性霉素B、制霉菌素、克霉唑、酮康唑、伊曲康唑、灰黄霉素等具有抗真菌作用。近年来根据卡氏肺囊虫超微结其壁结构与真菌细胞相似大多数学者认为应将其归为真菌，并命名为卡氏肺孢菌。更多精品文档学习好资料根据致病性真菌的感染部位，通常分为深部或全身性感染真菌、条件致病性（饲机性）真菌、浅部感染性真菌。（二）常真菌实验技术真菌实的注意事项真菌的检验操作应在生物安全柜中进行。特别是粗球孢子菌、组织胞浆菌、皮炎芽生菌、新型隐球菌等的分离培养和鉴定操作必须在生物安全柜中进行。每天工作前后应对工作区域进行消毒。不可试着闻平板上培养物产生的气味。不可对组织胞浆菌、球孢子菌进行玻片培养，因为其孢子可在空气中散播。标本的色检查有些真菌如深部真菌需要染色后更清楚的观察，常用的染色方法有：革兰染色法所真菌均为革兰阳性，适用于白假丝酵母菌、孢子丝菌和新近感染的组织胞浆菌。美蓝-伊红或天青-红染色法适于组织胞浆菌。乳酸酚棉兰染色法真菌染成蓝，适用于所有真菌。糖原染色用过碘酸作氧化剂菌胞壁多糖物质被氧化而释放出醛基Schiff试剂中的亚硫酸复红及焦亚硫酸钠作用而显示红色用于标本直接涂片的染色织片的染色，也可对已进行苏木紫伊红染色的组织切片重染菌呈红色背淡绿色，细胞核蓝色。糖原、透明质酸、粘蛋白、透明蛋白、血纤维蛋白及胶质颗粒等都呈红色。嗜银染色法GMS法基本原理与染法相同，本法用铬酸代替过碘酸。真菌被染呈黑色或黑褐色，菌丝内部为灰紫色，糖原、粘蛋白为淡红色。粘蛋白-卡（MCS用于新型隐球菌的鉴别球菌细胞壁和荚膜染成红色，细胞核黑色，背景黄色。孢子丝菌和鼻孢子菌的胞壁也被染成红色。荧光染色用0.1%吖啶橙对标本涂片和组织切片进行染色光微镜下观察，白假丝酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌为黄绿色，新型隐球菌、鼻孢子菌为红色，组织胞浆菌红黄色，曲霉菌为绿色。真菌的离培养（1培养基真菌的营养要求不高，最适。一般细菌培养基上即可生长。在不同的培养基上真菌菌落形态变化很大，一般以沙保弱（sabouraud培养基为基准，描写菌落的形态常的培养基有选择性、选择性和鉴别培养基选性培养基有沙保更多精品文档学习好资料弱培养基、脑心浸液培养基和血琼脂培养基。选择性培养基是在无选择性培养基中根据细菌污染情况加入氯霉素.05mg/ml庆大霉素50~100mg/ml或霉素20U/ml和链霉素40U/ml或霉素和庆大霉素100mg/ml或氯霉素16mg/ml和大霉素4mg/ml等抑制细菌的生长。为抑制腐生性真菌的生长，加入0.5mg/ml放线菌酮，但对新型隐球菌、近滑念珠菌、热带念珠菌及曲菌有抑制作用。鉴别培养基有：马铃薯葡萄糖琼脂、酵母浸膏琼脂、米粉琼脂、蔡氏琼脂等。（2培养方法试培养法、大培养法和小培养法。4.培结果的观察真生长后要观察菌落的以下方面：生长速度、菌落大小、表面形态、菌落颜色、菌落边缘、菌落底部。菌落性质：可分为酵母型、酵母样型和丝状菌落。酵母型菌落外观光滑、质地柔软、呈乳酪样，与细菌菌落相似如隐球菌母样型菌落与酵母型菌落相似但成假菌丝伸培养基中假丝酵母菌状落是多细胞真菌的菌落形态棉状毛或粉末状，根据菌种的不同，菌落形态多变，是鉴定的重要依据。其他鉴诊断技术（1动物接种动接种可以有效的分离病原性真菌，确定真菌的致病性。常用小白鼠接种新型隐球菌、孢子丝菌、皮炎芽生菌、组织胞浆菌较敏感。巴西芽生菌、球孢子菌应接种豚鼠睾丸内。白假丝酵母菌、皮肤丝状菌对家兔比较敏感。病理组织检查病理组织检查是断深部真菌病的重要方法。用真菌染色后在组织内发现孢子或菌丝则具有诊断意义。免疫学检查真感染的诊断，主要取决于病原学诊断。但在某些情况不能获得病原学证据急组织胞浆菌霉支气管炎等要靠免疫学手段进行辅助诊断。与其它微生物相比真产生的体慢而滴度低态反应严重免血方法有皮肤试验和用胶乳凝集试验、酶联免疫试验、补体结合试验抗体试验放免疫试验测定血清中相应抗体的水平核酸检：应用分子生物学技术，如探杂交、PCR技检测组织标本中的真菌DNA行诊断，正在不断研究和试验中。（二）浅部染性真菌浅部感染性真菌包括皮肤表面感染性真菌、皮肤癣真菌和皮下组织感染性真菌。我国主要的皮肤表面感染性真菌是糠秕马拉癣菌要居在人体皮肤和毛干的最表层一种嗜脂性酵母样菌，为条件致病菌，可在健康人皮肤上分离到。更多精品文档学习好资料皮肤癣菌是寄生于皮肤角蛋白中引起皮肤浅部感染的真菌称皮肤丝状菌侵犯角化的皮肤、毛发和指（趾）甲等部位。共有种，其约有余种对人致病。分为毛癣菌属表癣菌属和小孢子癣菌我以红色毛癣菌为最多，其次为紫色毛癣菌、须毛癣菌、絮状表皮癣菌。引起皮下组织感染的真菌主要有着色真菌和孢子丝菌伤感染后下组织感染性真菌在局部真皮深层、皮下组织生长繁殖，并缓慢向周围组织扩散，还可经淋巴向全身扩散。在我国以卡氏枝孢霉为最多，其次为裴氏着色真菌。孢子丝菌广泛分布于土壤、尘埃上，属于腐生性真菌。常因外伤感染本菌引起孢子丝菌病。主要的感染菌是申克孢子丝菌。（三）深部感染真菌1.隐菌仅新生隐球菌及其变种有致病性，新生隐球菌广泛分布于自然界，也可存在于人体表、口腔和肠道中在粪中大量存过吸入鸽粪污染的空气而感染特别是在一些免疫低下者。新生隐球菌在组织中呈圆形或卵圆形，直径一般μ，菌体外有宽厚荚膜，荚膜比菌体大1倍，折光性强，一般染色不易着色。常用墨汁负染色法，在黑色背景下可见透亮菌体，内有一个较大的反光颗粒和数个小的反光颗粒。常见出芽现象，菌体外有透明的宽厚荚膜。经培养后菌体可变小。非致病性隐球菌无荚膜。新生隐球菌在沙保弱培养基和血平板上，℃37℃均能生长，形成白色至奶油色粘稠酵母型菌落，后转变为橘黄色最后成棕褐色。有的菌落可以液化。能分解尿素。根据新生隐球菌的荚膜多糖分为A、B、C、D等血清型，我国临床标本中主要是A。此外我国还发现了新生隐球菌上海变种。本菌属外源性感染经呼吸道侵人体由肺经血行播散时可侵犯所有脏器组织要侵犯肺、脑及脑膜，也可侵犯皮肤、骨和关节。新生隐球菌病好发于细胞免疫功能低下者，如AIDS恶性肿瘤、糖尿病、器官移植及大剂量使用糖皮质激素者。因此，临床上隐球菌性脑膜炎常在系统性红斑狼疮、白血病、淋巴瘤等病人中发生。在国外已成AIDS的常见的并发症，是死的首要原因。用病人脑脊液作墨汁负染色检查是诊断隐球菌脑膜炎最简便速的方法见透亮菌体内有一个较大的反光颗粒数个小的反光颗粒及出芽现象体外有透明的宽厚荚膜。常规细胞染色可发现隐球菌，如PAS染色后新生球菌呈红色。用氢氧化钾涂片可见发芽的菌体，不能看见荚膜，须与淋巴细胞、脓细胞等鉴别。更多精品文档学习好资料用乳胶凝集试验、和单克抗体法等免疫学方法检测隐球菌荚膜多糖特异性抗原，已成为临床的常规诊断方法，其中以乳胶凝集试验最为常用。将标本接种在沙保弱培养基，病原性隐球菌在℃和℃孵育均可生长，而病原性隐球菌在37℃时不生长。培后察菌落形态特点，并取菌落作墨汁负染色镜检。新生隐球菌酚氧化酶阳性，脲酶试验阳性，能同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖和肌醇，但不能发酵糖类、不同化硝酸盐。非致病性隐球菌则不能同化肌醇。新生隐球菌对小鼠接种敏感，注入腹腔、脑或静脉内，小鼠周内死亡。二相性菌组织胞浆菌球孢子菌芽菌及副球孢子菌均属二相性真菌在体内或3℃培养时呈酵母型，在室温下或人工培养时变为丝状型。（四）条件致病性真菌条件致病性真菌致病性不强大发生在机体免疫力低下或菌群失调时肿慢性消耗性疾病、器官移植后HIV患者、长期使用广谱抗生素、正在受放疗或化疗的患者容易发生感染。通常为内源性感染。常见的菌株有假丝酵母菌菌毛霉菌和卡氏肺孢子菌。1.假酵母菌俗称念珠菌属有81个中11种对人致病假酵母菌为最常见的致病菌，其次为热带假丝酵母菌，克柔假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌也较常见。白假丝酵母菌呈圆形或卵圆形。直径μ。革兰阳性。出芽方式繁殖，在组织内可见芽生孢子、假菌丝，在玉米粉培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。取标本直接涂片，革兰染色后镜检，见到革兰阳性（着色不均匀）、圆形或卵圆形菌体或孢子及假菌丝，可确认为假丝酵母菌感染。取病人血清ELISA、疫印迹法等检测白假丝酵母菌抗原。将标本接种在沙保弱培养基上，25℃7℃培养l4d后，培养基表面可现奶油色类酵母型菌落。镜检可见假菌丝和芽生孢子。此外，还可作以下试验加以鉴定：l芽管形成试验白丝酵母菌可形成芽管并非所有的白假丝酵母菌都形成芽管，其它假丝酵母菌一般不形成芽管。厚膜孢子形成试验：将假丝酵母菌接种于玉米粉培养基，仅白假丝酵母菌在菌丝顶端、侧缘或中间形成厚膜孢子。糖同化或发酵试验：不同的假丝酵母菌对糖类的发酵和同化能力是不同的。常用葡更多精品文档学习好资料萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖进行发酵试验，用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖进行同化试验。5试丝母菌悬液注射于家兔耳静脉或注射于白鼠尾静脉，观察5，意动物是否死亡。剖检时如发现脏器有多种小脓肿，即为白假丝酵母菌感染，其他假丝酵母菌对动物无致病性。2.曲曲霉广泛分布于自然界。曲霉有900种，对人致病的曲霉至少有0种，其中最常见的约有8种。曲霉是条件致病菌人免疫功能降低时致病长期使用广谱抗生素疫制剂、肾上腺皮质激素，放疗、化疗，各种恶性肿瘤、糖尿病可诱发曲霉病。曲霉可侵犯机体许多部位尤是呼吸系统身性曲霉病有增高的趋势曲霉除直接感染和产生变态反应引起曲霉病外可生毒素起食物中毒，黄曲霉毒素色霉素有致癌作用黄霉毒素可能与人类原发性肝癌的发生有关。取标本涂于载玻片上在镜下可见分枝的菌丝粗的分生孢子头顶端膨大形成顶囊，顶囊上有小梗，小梗上有许多小分生孢子的特征性结构。分离培养与鉴定

标本接种沙保弱琼脂，室温培养后形成黄绿色毛状菌落。涂片镜检可见特征性的分生孢子头和足细胞。根据不同的形态和菌落特征确定菌种。免疫学检测竞争性LISA测病人血清中曲霉抗原常用免疫扩散对流免疫电泳、ELISA、物素一亲和素酶联免吸附测定、放射免疫测定（RIA）间接免疫荧光法等检测病人血清中抗曲霉抗体。菌丝和培养滤液可ELISA抗原。3.毛目真菌毛霉目真菌有7个科，主要是毛科。毛霉科中的根霉属、梨头霉属、毛霉属、根毛霉属常引起毛霉病，其中根霉属中的少根根霉和米根霉两种最多见。免疫功能低下者如AIDS、性消耗性疾病如糖尿病、白血病等肿瘤患者长期应用化疗、器官移植和自身免疫性疾病患者长期应用免疫抑制剂和皮质类固醇激素最易感染起初多发于鼻粘膜或鼻窦，继而扩展则眼眶软组织、面腭及脑，还可发生于肺部、胃肠道、皮肤等处，也可全身性播散，临床上常见的是眼眶及中枢神经系统的毛霉病，死亡率高。更多精品文档学习好资料4.卡肺孢菌卡氏肺孢菌，曾称为卡氏肺孢子虫。可引起间质浆细胞性肺炎，近年以来卡氏肺孢菌肺炎已成为IDS患者最常见的机性感染，并是其致死的的主要原因。卡氏肺孢菌生活史有包囊和滋养体两种形态。包囊为感染型，分为成熟包囊和未成熟包囊。前者包囊壁较厚，直6~8，呈球形、圆形、椭圆形、瓢形，包囊内囊内小体，大l1.5μm，呈球形、半月形或阿米巴形，排列呈玫瑰花状或不规则形，单个核；后者大多为椭圆形3~5，囊内l~8个滋养体为繁型，壁较薄，单个核不规则，直径25μm姬氏染色后胞质呈蓝色，核呈紫红色。呈二分裂法繁殖。长期使用免疫抑制剂器移植肿艾滋病等引起宿主免疫力下降潜的卡氏肺孢菌在患者肺内大量繁殖扩散肺泡上皮细胞受损致间质性浆细胞肺炎称卡氏肺孢菌性肺炎。卡氏肺孢菌病AIDS常见、最严重的机会感染性疾病。将痰液或气管抽吸物涂片后用姬姆萨染色，在显微镜下可见包囊内8个囊内小体，囊内小体的胞质呈浅蓝色核个紫红色IFAELISACFT测人群血清中卡氏肺孢菌抗体，可用于流行病学调查。（五）真菌体外药物敏感试验常量稀法肉汤常量稀释法是广泛适用于抗真菌药敏试验的方法于所有抗真菌药物对所有真菌的测试。培养基无酸盐的RPMI1640加L-谷氨酰胺和指示剂℃用MOPS调培养基的至。适合5-FC和砒咯类抗假丝酵母菌和一些丝状菌的药敏试。药物原液抗菌药物的标准品从药品的鉴定机构和生产厂商处获得脉射和口服制剂不能用于药敏试验。抗菌药物的贮存液必须高于试验浓度的0倍（氟康唑和5-FC为1280μg/ml、康唑和其它任何水溶性的药物应用蒸馏水配成水溶液。对于多烯类或其它水溶性的药物，称取足够量的标准品用二甲亚砜、聚乙二醇等制成1600g/ml的溶液。二性霉素B应光。无菌的贮存液应分装成小容量-℃或以下贮存6个在20℃或以上将会失活。根据需要在使用当天取出。取出后未经使用的溶液应全被废弃。更多精品文档33333333学习好资料接种菌液的制备测试菌株接种在沙保弱培养基35培养至少传代二次培24小时后的假丝酵母菌和培养48小时上的新型隐球菌挑选直径1mm以上的菌落5个混悬在无菌的5ml0.85%Nacl中530nm下测量浊度无生理盐水调节浊度至0.5麦标准。悬液的菌数为1×至5