血液病分子病理诊断课件

血液病分子病理诊断临床应用北京海思特临床检验所

分子病理室2013.06血液病分子病理诊断临床应用北京海思特临床检验所1

多层次检测平台综合应用细胞遗传学形态学分子生物学流式细胞学

染色体核型分析

荧光原位杂交RT-PCR测序

多重荧光巢式PCR定量PCR直接测序GeneScan多层次检测平台综合应用细胞2血液病诊断分型

定量监测MRD

白血病预后靶向治疗

耐药及疾病进展监测

范可尼贫血嗜血细胞综合症等血液病分子病理检测

融合基因检测基因突变检测血液遗传病检测大多数情况下，某一患者只有一种融合基因阳性血液病诊断分型血液病分子病理检测融合基因检测大多3个案t(15;17)witht(9;22)46,XY,t(9;22)(q34;q11),t(15;17)(q22;q21)BMmorphology:APLFCM:M3QPCR:PML/RARA+BCR/ABL(190)+个案t(15;17)witht(94多重巢式RT-PCR

筛查

定性检测用于染色体断裂点跨越很大的区域的融合基因。

荧光定量RT-PCR定量检测

内参基因c-abl结果以比值表示，全程动态监测融合基因的拷贝数/内参基因c-ablPCR-测序血液病分子病理检测多重巢式RT-PCR血液病分子病理检测5筛查每月定量监测3-6月定量监测每月定量监测筛查每月定量监测3-6月定6CMPD-慢性骨髓增殖性疾病CML慢性粒细胞白血病Ph染色体t(9;22)(q34;q11)ET原发性血小板增多症JAK2V617F*PV真性红细胞增多症JAK2V617F*CIMF慢性特发性骨髓纤维化JAK2V617F*HES特发性高嗜酸性粒细胞白血病FIP1L1-PDGFRα4q12缺失CMML慢性粒单核细胞白血病TEL/PDGFRβ:t(5;12)(q33;p13)

*WilliamV,StefanN.AuniqueactivatingmutationinJAK2(V617F)isattheoriginofpolycythemiaveraandallowsanewclassificationofmyeloproliferativediseases.Hematology.2005,10-13:195-200

CMPD-慢性骨髓增殖性疾病CML慢性粒细胞白血病Ph染色体7CML—BCR/ABL约95%的CML5%的儿童ALL15%-30%的成人ALLCML—BCR/ABL约95%的CML8CMPD-慢性骨髓增殖性疾病BCR/ABLJAK2V617FPV(-)65%-97%(+)纯合子多见少数JAK2V617F(-)12Exon突变ET(-)50%(+)CIMF(-)50%(+)JAK2V617F(-)5%MPLW515L/K(+)MolecularPathology：themolecularbasisofhumandiseasebyWillamB.Coleman,GregoryJ.TsongalisCMPD-慢性骨髓增殖性疾病BCR/ABLJAK2V617F9激活JAK2基因使细胞对生长因子敏感性增高

PV、ET、CIMF

不是独立的诊断指标MDS、3%CMMLJAK2V617F缬氨酸苯丙氨酸激活JAK2基因使细胞对生长因子敏感性增高JAK2V617F10FISH内参缺失预后5q-5p15.25q31差7q-7p11.1-q11.17q31差20q-20q12好+88p11-q11MDS转AML的几率为50%-Yq11好MDS-骨髓增生异常综合症分子方面的理论有限，但发现有5q31,7q31，20q12的反复缺失，提示可能这些区域存在肿瘤抑制基因。FISH内参缺失预后5q-5p15.25q31差7q-7p1111.MLL/AFX2.MLL/AF43.MLL/AF64.MLL/AF95.MLL/ELL6.MLL/ENL7.CBFB/MYH118.BCR/ABL9.MLL/AF1P10.TEL/PDGFR11.MLL/AF1012.DEK/CAN13.MLL/AF1714.SET/CAN15.dupMLL16.PML/RARa17.E2A/PBX118.PLZF/RARa19.E2A/HLF20.NPM/ALK21.SIL/TAL122.NPM/MLF123.TEL/AML124.NPM/RARa25.AML1/ETO26.TEL/ABL27.AML1/MDS128.HOX1129.TLS/ERG30.EVI131.MLL/AF1Q白血病-31种融合基因筛查1.MLL/AFX2.MLL/AF43.MLL/AF64.M1255%L型5%

V型体外对ATRA的敏感度低40%

S型低分化M3其他融合基因M3:PML-RARAt(5;17)(q32;q21)t(11;17)(q13;q21)t(11;17)(q23;q21)t(15;17)(q22;q21)PML-RARaPLZF-RARaNPM-RARaNuMA-RARa95%<5%dup(17)(q21.3;q23)STAT5b-RARa55%L型M3:PML-RARAt(5;17)(q313AML1/ETO80-90%M2少数M1/M4/M5CBFβ-MYH11M4Eo化疗敏感预后较好AML1/ETO14TEL/AML1

前B细胞ALLE2A/PBX15-6%的儿童ALL3%的成人ALL大部分前B细胞ALL血液病分子病理诊断15同一患者可能同时存在多种基因突变可与融合基因或其它基因突变同时存在；预后判断；个体化用药基因突变在疾病发展过程中可能会变化AML患者常见基因突变及其预后意义基因位置发生率预后C-KIT4q1220-30%差NPM15q3525-35%好FLT3-ITD13q1220-30%差CEBPA19q13.112.80%好同一患者可能同时存在多种基因突变AML患者常见基因突变及其预16血液病分子病理诊断17AML其他突变AML其他突变18淋巴瘤分子检测IG重排

Ig受体基因重排MRDTCR重排T细胞受体基因重排BCL-1/JHt(11;14)(q13;q32)套细胞淋巴瘤（MCL）少数B细胞增殖性疾病如多发性骨髓瘤BCL-2/JHt(14;18)70-80%的滤泡性淋巴瘤(FL)，大部分为t(14;18)，30%DLBCL淋巴瘤分子检测IG重排Ig受体基因重排MRDTCR重排T细19IG和TCR基因重排不一定是谱系的标志

某些T、B淋巴瘤有基因重排的交叉淋巴瘤-TCR，IG重排IG和TCR基因重排不一定是谱系的标志淋巴瘤-TCR，IG重20多发性骨髓瘤（MM）探针名称位点异常率意义中位生存期（月）P53缺失17p1310-34%预后差24.7IGH重排(4;14)(14;16)50-70%预后差1q21扩增1q2135-45%预后差21.9RB1缺失13q1450%预后中等42.3D13S319缺失13q1445%预后中等IGH重排(11;14)50-70%预后尚可50.5多发性骨髓瘤（MM）探针名称位点异常率意义中位生存期（月）P21各细胞遗传学亚组MM患者生存期(n=351)24.742.350.5FonsecaR.Blood2003;101:4569-4575.

各细胞遗传学亚组MM患者生存期(n=351)24.742.322各细胞遗传学亚组MM患者生存期（n=159）FonsecaR.Leukemia2006;20,2034-2040.各细胞遗传学亚组MM患者生存期（n=159）Fonseca23慢性淋巴细胞白血病CLL探针名称位点及读取异常率意义中位生存期(月)p5317p13缺失7-8%预后很差

32ATM11q22.3缺失11-18%预后差

7912cen12p11.1-q11三体16-25%预后中等

114RB113q14缺失36-64%预后好133D13S2513q14缺失36-64%预后好

133慢性淋巴细胞白血病CLL探针名称位点及读取异常率意义中位生存24各细胞遗传学亚组CLL患者生存期（n=325）3279114111133DöhnerH,EnglJMed.2000;43:1910-1916.

各细胞遗传学亚组CLL患者生存期（n=325）327911425酪氨酸激酶抑制剂TKIBCR/ABL融合基因FIP1L1/PDGFRa融合基因基因检测个体化用药酪氨酸激酶抑制剂TKI基因26基因检测个体化用药2012NCCN基因检测个体化用药2012NCCN27ABL激酶突变检测ABL激酶区突变c.763G>A(p.E255K)和c.944C>T(p.T315I)。ABL激酶突变检测ABL激酶区突变c.763G>A(p.E228WT1表达量检测*约75%AML患者可检测到WT1高水平表达，WT1是AML患者常用的MRD检测标志融合基因定量检测MRD监测*CurrentOpinioninOncology2010,22:656–663WT1表达量检测MRD监测*CurrentOpinion29WT1(Wilm’stumorgene)1.WT1基因在各类型白血病中均能表达(ALL，AML，CML，MDS).2.表达水平与白血病的进程相关，可作为化疗和骨髓移植后MRD检测敏感指标。3.鉴别白血病与反应性白细胞增高。WT1(Wilm’stumorgene)1.WT130初诊B-ALL;MLL-AF4t(4;11)(q21;q23)WT1(Wilm’stumorgene)血液学复发FCMMRD+弟供姐异基因造血干细胞移植+14d白细胞植活+27d血小板植活初诊B-ALL;MLL-AF4t(4;1131嗜血细胞综合征相关基因突变PRF1、UNC13D、STXBP2、STX11、SH2D1A、XIAP

LYST、AP3B1、RAB27A范可尼贫血基因突变FANCA60%、FANCC

15%、FANCG

10%

WASP综合征纯红再障RPS19先天性角化不良

DKC1、NHP2、TERC、TERT、NOP10、TINF2血液遗传病分子检测嗜血细胞综合征相关基因突变血液遗传病分子检测32PRF110q21-10q22细胞杀伤功能缺陷

嗜血细胞综合征Perforin

PRF110q21-10q22细胞杀伤功能缺陷嗜血细33FANCA16q24.3FANCC9q22.3

范可尼贫血基因检测Exon1Itron4Exon5Exon6Exon14Q13XIVS4+4A>Tc.637_643delTACCGCCR185XR548XL554PFANCA16q24.3范可尼贫血基因检测Exon1Itr34RPS1919q13.2hotspotofmissensemutations-codons52and62常染色体1岁

女

Exon4发现点突变：c.184C>T(p.R62W)，其他外显子未发现突变纯红再障-RPS19基因检测RPS1919q13.2纯红再障-RPS19基因检35DKC1Xq28X-连锁隐性7岁男

DKC1基因Exon11发现错义突变：c.1058C>T(p.A353V)先天性角化不良DKC1Xq28先天性角化不良36

PCR

Secquence送检标本要求标本要求EDTA抗凝、快速送达实验室EDTA抗凝、DNAorcDNA灵敏度最高大于15-20%分辨率bpbp报告时间3-5天5-7天PCRS37MolecularplatformMolecularplatform38

谢谢！谢谢！39耐药位点伊马替尼尼洛替尼达沙替尼耐药位点伊马替尼尼洛4017P13-11q22-1213q14-17P13-11q41SimplegeneticdiagnosisofhairycellleukemiabysensitivedetectionoftheBRAFV600Emutation2012119:192-195Simplegeneticdiagnosisofha42血液病分子病理诊断43血液病分子病理诊断临床应用北京海思特临床检验所

分子病理室2013.06血液病分子病理诊断临床应用北京海思特临床检验所44

多层次检测平台综合应用细胞遗传学形态学分子生物学流式细胞学

染色体核型分析

荧光原位杂交RT-PCR测序

多重荧光巢式PCR定量PCR直接测序GeneScan多层次检测平台综合应用细胞45血液病诊断分型

定量监测MRD

白血病预后靶向治疗

耐药及疾病进展监测

范可尼贫血嗜血细胞综合症等血液病分子病理检测

融合基因检测基因突变检测血液遗传病检测大多数情况下，某一患者只有一种融合基因阳性血液病诊断分型血液病分子病理检测融合基因检测大多46个案t(15;17)witht(9;22)46,XY,t(9;22)(q34;q11),t(15;17)(q22;q21)BMmorphology:APLFCM:M3QPCR:PML/RARA+BCR/ABL(190)+个案t(15;17)witht(947多重巢式RT-PCR

筛查

定性检测用于染色体断裂点跨越很大的区域的融合基因。

荧光定量RT-PCR定量检测

内参基因c-abl结果以比值表示，全程动态监测融合基因的拷贝数/内参基因c-ablPCR-测序血液病分子病理检测多重巢式RT-PCR血液病分子病理检测48筛查每月定量监测3-6月定量监测每月定量监测筛查每月定量监测3-6月定49CMPD-慢性骨髓增殖性疾病CML慢性粒细胞白血病Ph染色体t(9;22)(q34;q11)ET原发性血小板增多症JAK2V617F*PV真性红细胞增多症JAK2V617F*CIMF慢性特发性骨髓纤维化JAK2V617F*HES特发性高嗜酸性粒细胞白血病FIP1L1-PDGFRα4q12缺失CMML慢性粒单核细胞白血病TEL/PDGFRβ:t(5;12)(q33;p13)

*WilliamV,StefanN.AuniqueactivatingmutationinJAK2(V617F)isattheoriginofpolycythemiaveraandallowsanewclassificationofmyeloproliferativediseases.Hematology.2005,10-13:195-200

CMPD-慢性骨髓增殖性疾病CML慢性粒细胞白血病Ph染色体50CML—BCR/ABL约95%的CML5%的儿童ALL15%-30%的成人ALLCML—BCR/ABL约95%的CML51CMPD-慢性骨髓增殖性疾病BCR/ABLJAK2V617FPV(-)65%-97%(+)纯合子多见少数JAK2V617F(-)12Exon突变ET(-)50%(+)CIMF(-)50%(+)JAK2V617F(-)5%MPLW515L/K(+)MolecularPathology：themolecularbasisofhumandiseasebyWillamB.Coleman,GregoryJ.TsongalisCMPD-慢性骨髓增殖性疾病BCR/ABLJAK2V617F52激活JAK2基因使细胞对生长因子敏感性增高

PV、ET、CIMF

不是独立的诊断指标MDS、3%CMMLJAK2V617F缬氨酸苯丙氨酸激活JAK2基因使细胞对生长因子敏感性增高JAK2V617F53FISH内参缺失预后5q-5p15.25q31差7q-7p11.1-q11.17q31差20q-20q12好+88p11-q11MDS转AML的几率为50%-Yq11好MDS-骨髓增生异常综合症分子方面的理论有限，但发现有5q31,7q31，20q12的反复缺失，提示可能这些区域存在肿瘤抑制基因。FISH内参缺失预后5q-5p15.25q31差7q-7p1541.MLL/AFX2.MLL/AF43.MLL/AF64.MLL/AF95.MLL/ELL6.MLL/ENL7.CBFB/MYH118.BCR/ABL9.MLL/AF1P10.TEL/PDGFR11.MLL/AF1012.DEK/CAN13.MLL/AF1714.SET/CAN15.dupMLL16.PML/RARa17.E2A/PBX118.PLZF/RARa19.E2A/HLF20.NPM/ALK21.SIL/TAL122.NPM/MLF123.TEL/AML124.NPM/RARa25.AML1/ETO26.TEL/ABL27.AML1/MDS128.HOX1129.TLS/ERG30.EVI131.MLL/AF1Q白血病-31种融合基因筛查1.MLL/AFX2.MLL/AF43.MLL/AF64.M5555%L型5%

V型体外对ATRA的敏感度低40%

S型低分化M3其他融合基因M3:PML-RARAt(5;17)(q32;q21)t(11;17)(q13;q21)t(11;17)(q23;q21)t(15;17)(q22;q21)PML-RARaPLZF-RARaNPM-RARaNuMA-RARa95%<5%dup(17)(q21.3;q23)STAT5b-RARa55%L型M3:PML-RARAt(5;17)(q356AML1/ETO80-90%M2少数M1/M4/M5CBFβ-MYH11M4Eo化疗敏感预后较好AML1/ETO57TEL/AML1

前B细胞ALLE2A/PBX15-6%的儿童ALL3%的成人ALL大部分前B细胞ALL血液病分子病理诊断58同一患者可能同时存在多种基因突变可与融合基因或其它基因突变同时存在；预后判断；个体化用药基因突变在疾病发展过程中可能会变化AML患者常见基因突变及其预后意义基因位置发生率预后C-KIT4q1220-30%差NPM15q3525-35%好FLT3-ITD13q1220-30%差CEBPA19q13.112.80%好同一患者可能同时存在多种基因突变AML患者常见基因突变及其预59血液病分子病理诊断60AML其他突变AML其他突变61淋巴瘤分子检测IG重排

Ig受体基因重排MRDTCR重排T细胞受体基因重排BCL-1/JHt(11;14)(q13;q32)套细胞淋巴瘤（MCL）少数B细胞增殖性疾病如多发性骨髓瘤BCL-2/JHt(14;18)70-80%的滤泡性淋巴瘤(FL)，大部分为t(14;18)，30%DLBCL淋巴瘤分子检测IG重排Ig受体基因重排MRDTCR重排T细62IG和TCR基因重排不一定是谱系的标志

某些T、B淋巴瘤有基因重排的交叉淋巴瘤-TCR，IG重排IG和TCR基因重排不一定是谱系的标志淋巴瘤-TCR，IG重63多发性骨髓瘤（MM）探针名称位点异常率意义中位生存期（月）P53缺失17p1310-34%预后差24.7IGH重排(4;14)(14;16)50-70%预后差1q21扩增1q2135-45%预后差21.9RB1缺失13q1450%预后中等42.3D13S319缺失13q1445%预后中等IGH重排(11;14)50-70%预后尚可50.5多发性骨髓瘤（MM）探针名称位点异常率意义中位生存期（月）P64各细胞遗传学亚组MM患者生存期(n=351)24.742.350.5FonsecaR.Blood2003;101:4569-4575.

各细胞遗传学亚组MM患者生存期(n=351)24.742.365各细胞遗传学亚组MM患者生存期（n=159）FonsecaR.Leukemia2006;20,2034-2040.各细胞遗传学亚组MM患者生存期（n=159）Fonseca66慢性淋巴细胞白血病CLL探针名称位点及读取异常率意义中位生存期(月)p5317p13缺失7-8%预后很差

32ATM11q22.3缺失11-18%预后差

7912cen12p11.1-q11三体16-25%预后中等

114RB113q14缺失36-64%预后好133D13S2513q14缺失36-64%预后好

133慢性淋巴细胞白血病CLL探针名称位点及读取异常率意义中位生存67各细胞遗传学亚组CLL患者生存期（n=325）3279114111133DöhnerH,EnglJMed.2000;43:1910-1916.

各细胞遗传学亚组CLL患者生存期（n=325）327911468酪氨酸激酶抑制剂TKIBCR/ABL融合基因FIP1L1/PDGFRa融合基因基因检测个体化用药酪氨酸激酶抑制剂TKI基因69基因检测个体化用药2012NCCN基因检测个体化用药2012NCCN70ABL激酶突变检测ABL激酶区突变c.763G>A(p.E255K)和c.944C>T(p.T315I)。ABL激酶突变检测ABL激酶区突变c.763G>A(p.E271WT1表达量检测*约75%AML患者可检测到WT1高水平表达，WT1是AML患者常用的MRD检测标志融合基因定量检测MRD监测*CurrentOpinioninOncology2010,22:656–663WT1表达量检测MRD监测*CurrentOpinion72WT1(Wilm’stumorgene)1.WT1基因在各类型白血病中均能表达(ALL，AML，CML，MDS).2.表达水平与白血病的进程相关，可作为化疗和骨髓移植后MRD检测敏感指标。3.鉴别白血病与反应性白细胞增高。WT1(Wilm’stumorgene)1.WT173初诊B-ALL;MLL-AF4t(4;11)(q21;q23)WT1(Wilm’stumorgene)血液学复发FCMMRD+弟供姐异基因造血干细胞移植+14d白细胞植活+27d血小板植活初诊B-ALL;MLL-AF4t(4;1174嗜血细胞综合征相关基因突变PRF1、UNC13D、STXBP2、STX11、SH2D1A、XIAP

LYST、AP3B1、RAB27A范可尼贫血基因突变FANCA60%、FANCC

15%、FANCG

10%

WASP综合征纯红再障RPS19先天性角化不良

DKC1、NHP