碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理.碱性磷酸酶的分离纯化. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP.比活性测定.比活性的定义米单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。米通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。米用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。.测定样品的比活性必须测定：米每毫升样品中的酶活性单位数。米每毫升样品中的蛋白质毫克数。优质范文3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理H+HO-P-ONaNa

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+H£—NC=0KjMCNnH£—N-C—N%《一氨基安替比林H+HO-P-ONaNa

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+H£—NC=0KjMCNnH£—N-C—N%《一氨基安替比林H.C-N(3),米氏常数测定Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度*如上式表示，米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度，因此，米氏常数的单位为1^14。当反应速度等于最大速度一半时，即V=1/2Vmax,Km=[S]*吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。优质范文

图双倒数作图法图双倒数作图法二.器材721分光光度计 台式离心机 恒温水浴锅 微量移液器托盘天平 匀浆器 试管三.试剂0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中，稀释至50ml.0.1mol/L醋酸钠溶液0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸镭水优质范文中，稀释至10ml.0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液 取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液101^,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.丙酮（分析纯）.95%乙醇（分析纯）.Tris缓冲液（Ph8.8）称取Tris6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/LTris液，取0.1mol/LTris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.0.01mol/L基质液 称取磷酸苯二钠（c6H5PO4Na2.2H2o）0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中；两液混合并蒸馏水稀释至501^,加0.2ml氯仿防腐，盛于棕色瓶中，冰箱内保存，可用一星期；临用时与等量0.1mol/LpH10的碳酸盐缓冲液混合即可.0.1mol/LpH10的碳酸盐缓冲液 称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.碱性溶液 量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.优质范文0.5%铁氧化钾溶液 称取铁氧化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中，溶解后两液混合均匀，再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.0.1mol/L醋酸镁溶液 称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中，稀释至10ml.酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤. “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作优质范文

21兔肝剪碎置于玻璃匀浆管巾，加0.01m』L醋酸镁anniol/LMV酸纳溶液6血,在匀浆器上匀浆J0000甲明1分机肝匀聚倒人刻度离心管.记录体网A液）（约8ml）0吸出A液0Jml置于另一试管中，在此试管中加4.9mlpH&81昧缓冲液（fV管），待测比活性用。然后在A液中加2ml正丁醇，用玻棒充分搅拌34分钟.随后室温放置30分钟弹层握纸过滤,取漉液，加等体积等丙酮，混匀,2000rpm离心5分钟.上清液（弃去）沉淀I加05moVL解假铁4ml（B液）,记录体积0取B液（）.1nil置于另1一试管中，加4.9mlpH8.8Tris缓冲液（B噌），待测比活性用。rn沉淀（弃去）上清液+95%冷乙醒至60%（狗43nJ）,混匀,2500ipm离心5分钟口i~~}上清液（弃去）沉淀加05moVL错酸镁3加溶解，记录体积（C液）口取C液0」ml置于另一试管中，加2.0mlpH8.8Tris一冲液（C噌），待侧血活性用：加冷丙嗣至33%（约L5n）l）2000卬川离心5分钟口沉淀（弃去）上清液加冷丙隅至50%（约L5ml）.3500rpm离心10分钟.上清液（弃去）沉淀加5mlpH