基因诊断课件

第十六章基因诊断第一节概述一、

什么是基因诊断所谓基因诊断，就是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断，它包括产前诊断，是一种新的临床诊断方法。是以DNA和RNA为诊断材料，利用分子生物学技术，通过检查基因的结构或表型来诊断疾病的方法和过程；其临床意义在于能检测DNA或RNA的结构变动与否，量的多少及表达情况等，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊或进行基因治疗的依据。第十六章基因诊断第一节概述1二、基因诊断的概念界定以下6个方面内容：

（一）诊断水平基因水平（二）诊断技术从方法学来说，没有特殊的基因诊断方法，就是分子生物学技术在临床上的应用。

（三）诊断材料DNA和RNA。（四）诊断内容1、对于内源性基因来说：基因结构和表达是否异常。2、对于外源性基因来说：入侵基因的种类，是病毒核酸、细菌质粒还是寄生虫DNA.

（五）诊断途径

1、直接检查基因结构是否存在：DNA点突变、缺失插入、基因重排、染色体畸变、mRNA剪接缺失错位或结构变化等。

2、检查基因转录产物mRNA：1）已经转录还是没有转录？2）应该转录还是不应该转录？3）

转录正常、过量还是过少？3、检查基因表型：正常还是异常，进行分析研究。

（六）诊断目的1、

确诊相应疾病或得出相应结论。2、

是防治疾病或基因治疗的根据。二、基因诊断的概念界定以下6个方面内容：2三、基因诊断的思路（一）基因是随便能诊断的吗？总不能乱诊断吧？（二）基因诊断和传统的疾病诊断方法有什么区别和联系？（三）基因诊断的理论基础和技术能不能诊断诊断学基础怎样诊断？为此，作下述讨论。希望对大家有所帮助。三、基因诊断的思路3四、基因诊断方法和传统的疾病诊断方法

表1表型诊断（传统方法）基因诊断（一）诊断依据疾病表型变化基因结构异常和表达异常（二）分类临床诊断（病因、病解、病生）DNA诊断血清学诊断RNA诊断生化学诊断（三）特异性表型改变在很多情况下是非特以探测基因为目标，只要异性的，往往难以明确诊断，有特异性探针，利用分子延误病情如FOU?杂交原理即可诊断，具有很高的特异性。

（四）敏感性探针可用“放标”或“非放诊断灵敏度高，标本只需微量，DNApg水平即可。

（五）早期诊断因为表型改变往往出现较晚，在表型改变之前，基因难以早期诊断结构或表达已发生改变，故往往可以早期诊断。

四、基因诊断方法和传统的疾病诊断方法4（六）基因诊断范围广因为：①探针可为任何来源和种类，序列可为已知或未知，目标可为特定基因或特定基因组合，外源性或内源性基因，所以适应性强，诊断范围广。②被检查基因是否处于活化状态并不重要，故可对分化阶段表达特异性基因及其异常进行检测和诊断，这对肿瘤（如CML）疗效及预后尤为重要。③在感染性疾病的诊断，能检查正在生长或潜伏病原体，能明确既往感染或现行感染，对不易诊断（如产毒性E.coli）和不能安全培养（如立克次体）进行基因诊断，扩大了实验室诊断范围。（六）基因诊断范围广5（七）二者关系1.基因诊断必须建立在临床一般检查的基础上，它必须是临床检查的第二步或第三步手段。（不是随便诊断）2.基因诊断是分子生物学和医学遗传学发展到今天人们的一种设想，现在逐步走向临床，变成现实。3.尽管实验研究和临床应用技术原理相同，但诊断对象是人的时候应该慎重！（不能乱诊断）4.同临床诊断一样，忌不独立思考，人云亦云（举例）。（七）二者关系6

细胞膜

细胞核DNAmRNA转录翻译（protein）临床表现基因诊断生化诊断血清学诊断临床诊断图一基因诊断与表型诊断细胞核7（五）基因诊断与诊断学（一）诊断是用医学科学的方法对疾病的表现所作出的辩证逻辑的结论。诊断目的：为了防御疾病和进健康。（二）诊断学是论述诊断疾病的基本原则和方法的一门课程。其基本原则就是研究症状体征发生的基本规律和机理以及建立诊断的思维程序。基本诊断方法包括：询问病史、体检、实验室检查、以及其他检查如：心电图、超声检查、内窥镜、CT、核磁共振等等。（三）基因诊断是诊断学的续写，是诊断学的新篇章，从这个意义上来说：基因诊断遵循诊断学的基本原则；基因诊断的基础是医学基础，专业基础是医学分子生物学和医学遗传学，不同的是我们在基因水平上，学习和研究：基因解剖（结构）、基因生理（转录翻译等）、基因病解（结构异常），基因病生（表达异常），然后主要应用分子生物学技术手段进行基因诊断。（五）基因诊断与诊断学8（六）基因诊断的思维程序：第一套：逆向遗传学（reversegenetics）思维程序1.

提取人类基因组（总）DNA；2.建立DNA文库（DNABANK）；3.克隆任一DNA片段作为探针。4.确立该探针在基因组中的位置；这种探针在基因组中的位置一旦被确定下来，就可以成为遗传标记（geneticmarker）.5.大量应用此类新的遗传标记(用染色体步移法或染色体跳跃法)建立各条染色体的连锁基因图谱，最终建立整个人类的基因图谱。6.筛选遗传病病人或疑有与基因有关的疾病的病人；7.克隆病变基因8.比较正常基因和异常基因的差别推测正常异常基因产物（蛋白质）在细胞中定位以及生理病理效应。（六）基因诊断的思维程序：9第二套拿来主义1.您诊断/研究的疾病是否：与/有/知道1）基因有关；2）该基因的正常/异常序列；3）该基因结构/表达异常的类型；4）特异性探针/PCR引物；5）转录物；6）表达产物/表达产物功能/表达产物功能测定方法。2.

据1设计基因诊断方案。第二套拿来主义10第二节基因诊断的分子生物学基础一、基因诊断的理论（一）生物大分子结构和功能（二）基因组结构和功能（三）遗传信息的复制和表达（四）基因表达的调控（五）细胞通讯与细胞信号转导的分子机制（六）癌基与抑癌基因（七）基因与疾病第二节基因诊断的分子生物学基础11二、基因诊断的技术

（一）核酸分子杂交，在这些方法中，1.Southern印迹法是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。2.Northern印迹法可用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。3.斑点杂交

可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。4.原位杂交

可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原为杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。二、基因诊断的技术12(二）聚合酶链式反应（PCR）PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中，PCR常与其它技术如分子杂交，限制酶酶谱分析，单链构象多态性检测，限制性片段长度多态性分析，DNA序列测定等联合应用。（三）单链构象多态性

单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,sscp）检测是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法，常与PCR联合应用，称为PCR—SSCP技术。(二）聚合酶链式反应（PCR）13（四）限制酶酶谱分析基因突变可能导致基因上某一限制酶位点的丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。（五）DNA序列测定DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位的突变的性质。（六）DNA芯片技术应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。（四）限制酶酶谱分析14三、基因诊断的内容

（一）基因结构异常（基因突变检测）１、点突变1）已知的点突变2）未知的突变2、少数核首酸的缺失或插入3、大片段丢失或插入4、基因重排（染色体易位）5、基因扩增（二）基因表达异常（基因转录物探测）1、mRNA相对定量2、mRNA绝对定量3、mRNA长度分析（三）连锁分析（了解内容）1、限制性片段长度2、性家系连锁分析3、连锁不平衡（四）病原体的诊断入侵基因的种类三、基因诊断的内容（三）连锁分析（了解内容）15四、基因诊断的途径（一）内源性基因诊断的途径主要有3种：即：基因突变的检测mRNA的探测连锁分析采取哪一条途径主要取决于：对致病基因及其分子病理学的了解程度；致病基因本身突变类型的复杂性。四、基因诊断的途径16（二）外源基因的入侵的病原体的诊断1.入侵基因组DNA具有特异的DNA序列，以区别于别种生物体DNA序列。2.能把这种特异的DNA序列制成具有特定信号的探针。五、基因诊断的基本方法（一）点突变

1、已知点突变PCR/ASO探针斑点（或缺缝）杂交法（1）据突变（位点序列：）a.设计一对引物，b.合成一对寡核苷酸探针（正常/突变序列杂合子）（2）提取患者基因组（总）DNA→PCR扩增（突变序列）DNA片段→（与ASO）斑点（或狭缝）杂交洗脱条件：完全配对（牢）不洗脱；不完全配对（不牢）易洗脱。（二）外源基因的入侵的病原体的诊断17（3）结果分析：①与正常探针杂交，而不和突变探针杂交表示受检者不存在这种基因；②只与突变探针杂交，说明突变基因是纯合子；③与正常/突变，探针都可杂交，说明突变基因是杂合子；④与正常/突变探针都不杂交说明不是已发现的突变。2、未知点突度SSCP—PAGE法、测序法

提取DNA→DNA变性→SSCP—PAGE→测序确证（二）少数较苷酸缺失或插入的诊断方法可以用（一）的方法（3）结果分析：18

（五）基因扩增限制酶酶切待测基因的DNA或CDNA片段作为探针（位置改变）法光密度扫描（定量）。基因扩增→拷贝数增加（分子量）→电泳行为改变→杂交条带位置改变→与标准/正常对照定性/量扫描。（四）基因重排（染色体易位）多次/重PCR电泳分析、其前提是已知重排基因和重排位点的序列。（三）大片段丢失多次多重失PCR电泳分析设计引物使获得产物序列长短不同，有固定大小，据不同长短序列存在与否，检测是否有某些基因片段的缺失与突变（注意正常对照）。5′3′引物1引物3致病基因引物4引物25′3′引物1引物3（四）基因重排（染色体易位）多次/重PCR电泳分析19（六）多态性分析

1、RFLP（１）基本方法：①PCR产物酶切产物电泳分析。②基因连锁分析（PCR/RFLP连锁分析法）。人群个体核苷酸序列的差异性、称为DNA的多态性。由此影响限制酶切部位点而致RFLP（限制性片段长度多态性）。RFLP按照孟德尔方式遗传。故：①可检测人群中个体间存在的RFLP（限制酶酶谱分析）②遗传病的基因诊断（连锁分析）。如果一特定家庭（系）中，某一致病基因与特异性的多态性片段紧密连锁（连锁—是指同一条染色体上相邻近的基因一起被被遗传），就可以用这种多态性片段作为“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿基因组中是否携带有致病基因。对于某一限制酶来说：酶切位点在人群中存在共性（可能一样对核酶谱来说存在多态性（不一样）。（２）DNA多态性位点普遍存在整个人类基因组，估计每100个核苷酸便有一个发生突变，出现多态性。如果建立起一套以20CM间隔平均分布于整个基因的RFLP位点，选用合适的探针，理论上可以对所有的遗传病进行基因诊断。（六）多态性分析20（3）关于基因连锁分析①多数遗传病诊断途径，因为：经基因突变检测途径，适用病种有限，原因是：a、致病的基因可在任何位点上产生突变，致使同一疾病有不同的突变类型。b、不少致病基因仅仅知道在哪一号染色体位置，尚未克隆出来，对其结构和分子机制毫无能知。c、有的致病基因尚未确定。

②基因连锁分析必须具备的先决条件：a、家系中的关键成员（父母）为RFLP的杂合子，才能区分两条同源染色体。连锁遗传病只要母亲为某一RFLP的杂合子即可。b、子代存在患病的纯合子，这样才能确定致病基因与哪条染色体RFLP共同遗传。c、任何一种遗传病、单独使用一种RFLP、均有相当一部分父母染色体无法区分、所以要联用若干种RFLP及相当探针，提交诊断。d、待检亲代必须为生物学意义亲代。（3）关于基因连锁分析21③连锁不平衡并不多见：指某一个多态性位点在基因和等位突变基因中的分布频率有显着差异。因此可用与特异等位基因连锁这一多态性进行基因诊断。如：正常人酶切图谱有9/9、22/9、22/22kb型，β-地贫纯合子只有9/9kb型（kan发现撕工岛人β-珠蛋白基因3’BamHI的多态性位点）故不经家系分析，仅以这一多态性即可用产前诊断。④RFLP连锁分析可能常是可靠的。连锁分析存在一定的错误原因是：a、人为差错。b、RFSP连锁分析方法本身的差错程度（方法本身局限性。）因为在减数分裂中间传染色体的某些区域可以发生重组和交换，从而使得原先共同遗传的DNA突变与RFLP发生分离，这样情况下作出连锁分析结果就会发生错误。诊断的错误率可以从DNA标志与疾病的共同遗传度来估计，重组率高于5%的连锁探针不宜采用，事实表明，除个别情况外，由于染色体重组所致的错误诊断小于1%，因此，RFLP连锁分析通常是可靠的。③连锁不平衡并不多见：222、微小重复序列（如CA序列）多态性分析。（１）基本方法：PCR/PAGE家系分析法（教材P146）。①重复单位和重复次数不同具有高度的遗传多态性，对他们和等位基因进行家系分析，说明他们遵照孟德尔遗传规律、是一套新的遗传标记系统（２）应用举例：产前基因诊断杜氏肌营养不良（突变类型未明）。2、微小重复序列（如CA序列）多态性分析。23（七）基因表达异常的诊断。1、mRNA相对定量（1）点杂交（或狭缝杂交）光密度扫描法；（2）RT—PCR；2、mRNA绝对定量RT—PCR/竞争性PCR3、mRNA长度分析Northern杂交法，RT—PCR产物电泳分析（八）病原体的诊断PCR法第十六章基因诊断课件24第三节基因诊断的应用一、遗传病的基因诊断（一）血红蛋白病血红蛋白病是由于血红蛋白合成异常所致的遗传性血液病。习惯上分为异常血红蛋白病和地中海贫血２类。1.异常血红蛋白病是珠蛋白肽链结构的改变变导致主要功能部位氨基酸的置换，影响Hb的溶解度、稳定性及生物学功能。分子基础：单碱基替代，缺失、插入……

２.地中海贫血（α地中海贫血和β地中海贫血）是珠蛋白合成速率降低，导致链和非链合成的不平衡→多余的珠蛋白链沉积在Rbc膜上→改变了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。第三节基因诊断的应用254.诊断要求HbPunjabα地中海贫血（α珠蛋白合成↓）β地中海贫血（β珠蛋白合成↓）占我国新疆异常Hb病55.6%（1）产前诊断为主要目的。每一民族或群体有特突变类型谱中国人主要突变类型有6种（P30）分子基础Hbβ链121密码单个碱基替代：GAA（Glu)→CAA（Gln）→改变了EccRI一个识别位点大多数是α珠蛋白基因缺失所致。点突变、缺失或插入往往不涉及限制酶识别位点。DNA诊断：PCR扩增（β珠蛋白第3个外显子和基因3´端DNA序列、全长144bp）EcoRI酶切电泳分析。（3）液体分子杂交C1限制酶谱分析，或PCR扩增电泳分析PCR/ASO探针法（主要方法）结果正常对照40/104bp两个片段HbPuNJob144bp,40/104bp两种类型杂合子（同理扩增β珠蛋白DNA片段MnlI酶谱分析诊断HbE（β26Glu→Lys))正常对照有正常杂交信号（C1）酶切片段不缺（C2）PCR产物有（C3）α地贫与正常结果反之。PCR/RFLP连锁分析法RNA诊断：异常Hb病人mRNA的RT/PCR产物测序知编码区碱基变化—推导相应氨基酸变化。RT-PCR介导的α珠蛋白mRNA定量↓。①PCR介导的mRNA定量法。②mRNA的剪切缺陷检测（自学）4.诊断要求HbPunjabα地中海贫血（α珠蛋白合成↓26（二）杜氏肌营养不良症（DMD）和贝克营养不良症（BMD）

1.DMD和BMD是常见的性连锁隐性遗传病，2.主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，XP21.21—21.3区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同。DMD多在5岁发病，在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其发病率为活产男婴的1/3500。BMD症状较DMD为轻，寿命较长，并有生育能力，发病率为1/30000。3.分子基础：抗肌萎缩蛋白基因内（1）DNA片段缺失（60%的病例→导致阅读框移码→移码实变→致DMD，整码缺失→BMD）。（2）部分重复（病例的5%）（3）缺失或重复的2个热点区①该基因5’端处②45~55外显子范围内。（二）杜氏肌营养不良症（DMD）和贝克营养不良症（BMD）274.DMD、DNA诊断因DMD（及BMD）大多数为基因缺失所致，该病DNA诊断主要是抗肌萎蛋白基因缺失的检测。诊断技术：（1）基因组探针法用XP21区分离得到的不同探针如（P20）来接进行相应内切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。（2）cDNA探针法抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失、外显子拼接改变和基因内部分重复。（3）多重PCR法如有人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因的9个易发缺失“热点区”DNA片段，可检出80%有基因缺失的DMD患者。（4）多态性分析法基因内及其旁侧探针进行RFLP连锁分析或CA多态性分析适用于非缺失型DMD。5.DMD、RNA诊断：诊断技术RT—PCR扩增该基因外显子（全长2.4MB、外显子起来全长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。联用测序：可定位基因缺失的起始和终止。4.DMD、DNA诊断因DMD（及BMD）大多数为基因缺失所28（三）苯酮尿症（PKU）

1、苯尿症是一种常见的隐性患传性氨基酸代谢病。2、主要特征：（1）苯丙氨酸酪氨酸→多巴→儿茶酚胺苯丙酮酸酪胺黑色素

（2）患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗，否则发生不可逆大脑损害和严重智力发育障碍。3、分子基础：（1）迄今约3/4的导致中国人经典型重PKU的突基因已被查清，它们分属11种基因PAH基因点突变。体外研究表明，这些突变导致PAH活力↓或丧失。（2）PAH第11外显子的第399密码GTA（val）→GTT（val）中性突变：①不改变任何限制酶识别位点，故又称“序列多态性”。②这一“序列多态性”在PKU患者和正常人中存在着连锁不平衡性，故可作为一种“遗传标记”应用于产前诊断。苯丙氨酸羟化酶↓（肝、PAH）（三）苯酮尿症（PKU）苯丙氨酸羟化酶↓（肝、PAH）294、DNA诊断：①PCR/ASO探针法。若待诊断的PKU家系的基因突变类型尚属“未知”或无RFLP信息。②PCR/SSCP—直接则序法→不定期出导PKU的点突变。5、序列多态性连锁分析前提是该家系存在述第399密码子序列多态性用于产前诊断：（不知基因实变类型，也无RFLP信息。）病案—某孕妇曾生育一例PKU患者，现妊娠第二胎8周，要求对胎儿进行产前诊断。诊断：（1）PAH基因的RFLP分析：该家庭除ECORI外，其它酶切点都不具有杂合性，而丈夫、患儿、孕妇、胎儿双均为ECORI11/17kb片段的杂合子，因此胎儿可能正常，可能为PKU患者。据RFLP分析无法对胎儿作出产前诊断（为什么？缺乏基因连锁分析先决条件。（2）序列多态性：PCR/ASO探针DNA片段点杂交法。①PCR扩增父亲、孕妇/患儿、胎儿PAH基因片段。②合成ASO（相应于第399密码子中性实变序列的一对等位基因的特异ASO探针。③杂交：说明：①患儿扩增DNA片段与正常/中性突变ASO探针杂交;②父亲;③胎儿扩增a、患儿的1个PKU，基因与密码子399A→T中性突变相偶（连锁），这个PKU基因来自母方。a.孕妇。b、胎儿没有这一中性实变，可以排除胎儿为PKLL患者，结合ECLRI位点RFLP资料，可产和的诊断胎儿完全正常。c、胎儿出生后基因分析和随方证实诊断正确。DNA片段中能与正常的ASO探针杂交。4、DNA诊断：①PCR/ASO探针法。若待诊断的PKU家系30四、血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，由于正常凝血过程中血浆凝血的活力有缺陷所致。患者常因出血不止或继发病而夭折，治疗主要靠替代疗法，输入缺乏的血浆因子。重型血友病甲和乙的男性发病率为1/5000~1/50000。为甲型血友病和乙型血友病。

主要特征：①是一组X连锁遗传凝血缺陷疾病。②缺乏Xq远端的FⅧ（凝血因子Ⅷ）所致。③基因突变具极为异质性，与β地贫不同。（因子占X染色体全长0,1%，共186kb包括26个外显子）不存在存族和群体特异性，几乎每一种不同的甲型血友病家系都具有自已独特的突变类型。（所以该病基因诊断不宜用PCR/ASO探针直接检测点突变，而主要依赖RFLP连锁分析）①也是X连锁遗传的凝血缺陷疾病。②约1%左右乙型血友病人FIX基因缺失（因而在用替代疗法过程中会产生FIX的抑制物）。③在非缺失（FIX基因）型中，已发现398种不同的基因突变。（FIX基因定位在Xq26→q27，全长34kb包括8个外显子）。四、血友病①是一组X连锁遗传凝血缺陷疾病。31①已克隆化FIXcDNA和DNA片段，鉴定了FIX基因的5个限制者多态性位点，故可用RFLP连锁分析进行产前诊断和携带者检测。②病倒：乙型血友家系分析FIX基因发现某患者缺失该基因5kbDNA序列（第2~3外显子+第2内含子全部+部分第1，第3内含子）a、对该家系一例乙型血友病变高危妊娠产前基因诊断，诊断胎儿为男性乙型血友病患者。b、对该孕妇第二胎产前诊断为女性乙型血友病基因携带者。（上海医遗传所淅江乙型血友病家系）4、诊断情况（报道）：①应用克隆化FⅧcDNA与VIII基因连锁DNA片段和DX18、St14等分析了基因或旁侧的限制酶酶切位点多态性，并采用PCR/BCLI或XbaIRFLP连锁分析法进行了甲型血友病的产前诊断和携带者检测。②用PCR/SSCP法检查了FVIII内含子18处BCLI的多态性。（终止妊娠对胎儿作凝血子测定和DNA分析、证实产前诊断正确。）①已克隆化FIXcDNA和DNA片段，鉴定了FIX基因的5个32类别基因特征诊断方法1、病毒性肝炎①甲型肝炎（HAV）①甲肝病毒基因是线状分子、约含于7500个核苷酸。②已获HAV几个毒株cDNA克隆。①CDNA探针杂交（RNA）法。②SSRNA探针杂交（RNA）法有报道。②乙型肝炎（HBV）①HBVDNA约3.3kb，是非共价闭合的环状结构。①PCR斑点杂交法。②PCR电泳EB染色法③丁型肝炎（HDV①HDV基因为环状SSRNA长约1678个核苷酸①DNA或cDNA探针杂交（RNA）法②RT/PCR单抗ELISA法2、细菌引起的疾病（1）产毒性Ecoli、侵袭性Ecoli;(2)霍乱弧菌；（3）痢蒺杆菌；（4）淋球菌基因诊断用PCR扩增斑点杂交法。3、疟疾、寄生虫基因诊断用PCR或结合探针技术。二、传染病的基因诊断类别基因特征诊断方法1、病毒性肝炎①甲肝病毒基因是线状分33三、肿瘤的基因诊断（一）基因重排的生理和病理基因重排—指某些基因片段改变原来存在的顺序，通过调整有关基因片段的连接顺序，再重排为一个完整的转录单位1.生理（1）基因表达DNA水平的调控方式之一。（2）免疫球蛋白分子多样性的分子机理之一。2.病理重排和重组位点之间DNA片段移除，会使在恒定区两侧的某些限制酶切位点的位置发生改变。可用：（1）限制性片段长度改变；（2）分子杂交（恒定区域连接区基因为探针）。确定基因重排的存在与否，以对肿瘤进行基因诊断。三、肿瘤的基因诊断34免疫球蛋白重链基因探针（J）和轻链基因探针（k，入）对B细胞淋巴瘤DNA的杂交图谱。说明：1、正常对照2、B细胞淋巴瘤，入基因无重排，重排后杂交端的位置实验：提取瘤细胞DNA→酶切（至少2组以上）杂交（至少两种以上）→结论（看到2组以上的杂交图谱改变时，即可下诊断结论）。12J1212k入（二）基因内部重排与B细胞淋巴瘤免疫球蛋白重链基因探针（J）和轻链基因探针（35（三）基因间重排（染色体易位）淋巴样肿瘤细胞的染色体易位癌基因肿瘤染色体易位发生频率C-myc……………………bc1-2囊性淋巴瘤t（14;18)(q32;qI1)85%……两个重要事实：1、囊性淋巴瘤染色体易位频率最高；2、所有易位都涉及到C-onc的易位。这对于诊断，分型和预后具有重要的意义。（三）基因间重排（染色体易位）361.图：22号染色体和9号染色体易位导致慢性粒细胞白血病（CML）易位结果22号染色体长臂丢失，形成微小的ph（费城首次发现的）染色体。（CML中90—95%的病例具有ph染色体）。（四）基因重排与CML的诊断9229q+22q-1.图：22号染色体和9号染色体易位导致慢性粒细胞白血病（C372.说明：1.ph染色体是染色体易位t（9;22）2.C-oncC-ab和c-sis分别位于第9号和第22号染色体长臂上，易位涉及到两个癌基因的互换（基因间重排，但通常不涉及它们的基因内部重排，故一般认为重排后它们的基因结构并无改变）。3.CMLDNA分子中最具有结构特点并可以用于诊断的序列区域是bcr，研究发现，第9号染色体断裂点位置变化很大，多半出现在c-abl5’端100kb区间内；第22号染色体断裂点较集中，基本上存在于一个5.8kb区域内。这个区域叫断裂点簇区即bcr。4.CML发生染色体易位时，先在各自的断裂点处断开，然后进行基因间重排，使c-abl/bcr形成融合基因，此基因可转录和翻译自己特异的mRNA和蛋白质。5.为了准确测定bcr重排，须：①选择适当的探针；②选择两个以上的限制酶酶解产物作杂交分析。③CML具有bcr重排（多数）和bcr未重排型（少数）④Bcr重排等同ph阳性；⑤Bcr重排与CML缓解期复发有正性关系，与预后有关系，与ALL，AML有关系。PCR技术检测bcr/abl转录产物也可用作CML的诊断，预后和判断治疗效果等用途。2.说明：38（五）肿瘤异质性的分子基础：基因表达图谱分析用于肿瘤分类分期（六）基因扩增与乳腺癌的预后（七）原位杂交技术在肿瘤病理诊断中的应用（自学）。四、基因诊断方法在法医学上的应用（一）DNA指纹（基因指纹）

概念——在人体基因组DNA中存在高度可变的小卫星区域，在同一酶解物的Sou-thern印迹图上同一个体的不同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同个体之间（除非同卵双生）谱带都不相同，如同人的指纹具有高度个体特异性一样，这种southern印迹图被称为DNA指纹。（五）肿瘤异质性的分子基础：基因表达图谱分析用于肿瘤分类分期391.Jeffreys据珠蛋白基因座近处出现的RFLP频率及测定的核苷酸总数，推算出人基因的异质性是非常大的，约100bp中就有一个差异，但并不完全均一，有的顺序（核心序列）比较稳定，有的区域变动很大（超变区）它们都是一些很短的重复顺序。2.对这些重复顺序酶切时，可产生16，17、32、33、3F、4、62和3F6bp长度不等的限制性片段。3.人工合成很短的重复序列作为探针，与酶切的人体DNA作southernblot，可得出长度不等的杂交带，杂交带的数目和分子大小，几乎不可能有两个人是完全相同的，因此，把这种杂交图形称为DNA指纹，它是基因特异诊断有力的根据。4.DNA指纹按孟德尔方式遗传。（二）DNA指纹分析在法医学的应用于个体识别和亲子鉴定。1.Jeffreys据珠蛋白基因座近处出现的40自测题一、单项选择题1、1976年简悦威采用液相DNA分子杂交技术在世界上首次完成了（）A、α－地中海贫血的基困诊断B、β－地中海贫血的基困诊断C、血红蛋白病M的基因诊断D、疟原虫的基因诊断2、基因诊断是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断，它包括（）A、血清学诊断B、生化学诊断C、产前诊断D、病理学诊断3、在核酸分子杂交的基因分析方法中，最经典的是（）A、NorthernblotBWesternblotCdotblotD.Southernblot4、聚合酶链式反应（PCR）又称为基因体外扩增，它与基因体内扩增不同的是（）A、反应体系模板不同B、聚合酶辅基不同C、聚合反应方向不同D、反应体系所需温度差异自测题415、检测长度相同而构象不同的单链DNA需要进行（）A、琼脂糖凝胶电泳B、聚丙烯酰胺凝胶电泳C、琼脂粉电泳D、圆盘电泳6、限制酶酶谱分析中，常用的限制酶是指（）A、Ⅰ型限制酶B、Ⅱ型限制酶

C、Ⅲ型限制酶D、Ⅰ型和Ⅲ型限制酶7、限制酶酶切图谱经常被人们称作（）A、DNA的遗传图谱B、DNA的连锁图谱C、DAN的消化图谱D、DNA的物理图谱8、核酸序列测定方法始建立于（）A、20世纪50年代初期B、20世纪60年代初期C、20世纪70年代后期D、20世纪80年代后期5、检测长度相同而构象不同的单链DNA需要进行（）429、Sanger双脱氧末端终止测序法的链终止剂是（）A．2、3－二脱氧核糖核苷酸B、2、4－二脱氧核糖核苷酸C、3、4－二脱氧核糖核苷酸D、3、5－二脱氧核糖核苷酸10、20世纪90所代初，适应“后基因组时代”的到来，基因芯片技术率先（）A、在美国启动B、在日本启动C、在欧洲启动D、在以色列启动11、基因芯片的实质是一种（）A、高密度的单克隆抗体列阵B、高密度的多肽列阵C、高密度的核酸列阵D、高密度寡核苷酸列阵12、对于突变位点已被阐明的一些遗传病，可以采用基因诊断的方法是（）A、PCR/ASO探针法B、PCR/SSCP/sequencing法C、RT/PCR法D、RFLP分析法9、Sanger双脱氧末端终止测序法的链终止剂是（）4313.α-珠蛋白质基因蔟定位于（）A、6P13.3-Pter，B、17P13.3-Pter，C、18P13.3-Pter，D、19P13.3-Pter，14、α-地中海贫血患者的分子缺陷主要有（）A、2种基因型B、3种基因型C、4种基因型D、5种基因型15、地中海贫血是一种（）A、巨幼红细胞贫血；B、营养性缺铁性贫血；C、遗传性溶血性贫血；D、障碍性贫血16、B-地中海贫血患者的基因缺陷主要有（）A、少数核苷酸的缺失或插入；B、大片段丢失或插入；C、基因重排或染色体易位；D、点突变或阅读框易位

13.α-珠蛋白质基因蔟定位于（）4417、杜氏肌营养不良症（DMD）患者基因缺失的主要热点区位于DMD基因的（）A、起始区；B、尾区；C、中央部位；D、中央部位的内含子区域18、甲型血友病的基因缺陷是（）A、

凝血因子Ⅷ片段缺失，点突变或插入；B、

凝血因子Ⅸ片段缺失，点突变或插入；C、

PAH的严重缺乏；D、CK的水平升高19、用基因诊断的方法对感染性疾病进行诊断的主要优点是：A、

诊断过程对人体没有损伤；B、可以进行病因诊断；C、方法简便，费用较低；D、可以早期诊断20、目前普遍采用SOUTHERN印迹杂交进行DNA指纹分析，用于法医案检工作中的个体识别和亲子鉴定，其分子基础是（）A、

DNA的多态性；B、RNA的多态性；C、蛋白质的多态性；D、氨基酸的多态性17、杜氏肌营养不良症（DMD）患者基因缺失的主要热点区位于45二、多项选择题1、人类疾病的发生常常涉及到（）A、

内源基因的突变；B、外源基因的入侵；C、基因重组；D、姐妹染色体交换2、机体对外源性病原体入侵的防御体现在（）A、整体水平；B、细胞水平；C、分子水平；D、基因水平3、基因诊断的目的是为了（）A、

确诊相应的疾病；B、得出相应的结论C、作为防治疾病的依据D、开展基因治疗4、从基因诊断的发展史来看，具有代表性的分子生物学技术有（）A、核酸分子杂交；B、PCR；C、DNA芯片技术；D、限制性酶切图谱分析技术二、多项选择题465、基因诊断的技术和方法按原理大致可分为（）A、DNA探针技术；B、PCR技术C、DNA探针和PCR结合的技术D、DNA测序技术6、基因诊断的途径有：A、直接探测基因结构是否存在突变；B、检测基因转录产物mRNA是否表达异常；C、检测基因表达产物蛋白质结构的变化；D、根据临床诊断的初步结论进行基因诊断7、对感染性疾病进行基因诊断的分子生物学依据是：A、DNA或者RNA是生物遗传信息的载体；B、所有生物使用相同的构件分子；C、每种生物大分子在细胞中有特定功能D、每个物种的特性是通过它具有的一套与众不同的核酸和蛋白质而保持的8、基因突变存在以下共同特点，即（）A、稀有性B、随机性C、可逆性D、有害性5、基因诊断的技术和方法按原理大致可分为（）479、目前常用的基因探针有（）A、cDNA探针B、基因组探针C、人工合成DNA探针D、RNA探针10、常用的基因探针标记的方法有（）A、地戈辛标记B、生物素标记C、放射性P标记D、放射性35S标记三、名词解释1、基因诊断2、

DNA指纹3、RFLP四、答题1、简述你对基因诊断的概念的理解2、简述基因诊断的基本途径3、简述基因诊断的基本技术和方法4、简述基因指纹在法医案检工作中个体识别与亲自鉴定的分子生物学基础五、

论述题1、试论基因诊断方法与传统疾病诊断方法的区别与联系？2、论基因诊断与医学诊断学的辨证关系3、试论遗传性疾病基因诊断的思维程序4、试论感染性疾病基因诊断的思维程序9、目前常用的基因探针有（）48参考答案与题解一、单项选择题1、A、液相杂交是指在溶液中进行的杂交反应，杂交反应后需将杂交分子（双链）与未杂交分子（单链）分开，再判断杂交程度，通常灵敏度较低。1976年简悦威定成α-地贫的基因诊断为基因诊断的饿发展作出了开创性贡献。2、C．产前诊断关系到优生优育和胎儿质量。有遗传病生育夫妇中有一方为常染色体显性或者父方为X连锁隐性遗传病的携带者及凡可进行产前基因诊断的疾病，妊娠确立后应在适当时间接受产前诊断。血清学诊断、生化学诊断和病理学诊断均为表型诊断（进一步参考论述题1）参考答案与题解493.Dsouthernblot是经典的核酸分子杂交基因分析方法，其余核酸分子杂交基因分析方法均由此发展或派生而来。4.D核酸体内扩增核酸体外扩增（1）模板DNA或RNADNA或RNA（2）酶DNA聚合酶或逆转录酶DNA聚合酶或逆转录酶（3）酶的辅基Mg+等Mg+等（4）引物RNADNA（5）PH7.2±7.2±（6）温度37℃94℃（变性）、55℃（退火）、72℃延伸3.Dsouthernblot是经典的核酸分子杂交基因分505、B．PAGE分辨率高，适合于SSCP分析，琼脂糖凝胶用于一般核酸电泳，琼脂粉一般用于细菌固体培养基配制。圆盘电泳是PAG一种古老形式，已逐渐被淘汰。6、B．型限制酶能够识别DNA分子特异序列，并在该部位切割，故能获得特异的DNA片段。I型和III型限制酶不具备上述特性。7、D．标明限制酶在DNA分子上的限制位点数限制片段大小以及排列顺序的图谱通常称为DNA的物理图谱或者是限制性图谱，遗传图、连锁图请参考人类基因组计划相关知识8、C由 Sanger等开始建立。5、B．PAGE分辨率高，适合于SSCP分析，琼脂糖凝胶用于519、Aα—脱氧核糖核苷酸分子戊糖环第三位脱氧，则无法与下一个脱氧核苷酸形成3`5`磷酸二酯键，多核苷酸链无法延伸，故为链终止剂。是否存在天然或人工的2、4—二脱氧核糖核苷酸和3、4—二脱氧核糖核苷酸及其作用尚不得而知。核苷酸戊糖环第五位连接磷酸无氧可脱。10、A11、C受人类基因组计划的促进和计算机芯片技术的启发，基因芯片技术首先在美国启动，在对开发利用基因组计划的研究成果有着深远的意义。（进一步参考第十五章基因芯片技术）。12、A诊断已知的点突变的遗传性疾病，可以首选 PCR/ASO探针法，扩增DNA片段与相应ASO（等位基因特异性寡核苷酸）探针杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是化合子还是杂交子。诊断未知的点突变可用PCR/SSCP/SEQUENCING方法，通过确证性测序可以得知点突变的位置。RT/PCR法用于基因表达异常的诊断，RFLP法则适用于多态性分析。9、Aα—脱氧核糖核苷酸分子戊糖环第三位脱氧，则无法与下一5213、A14、B15、C地中海贫血是一种由于珠蛋白合成障碍遗传性溶血性贫血。其病理机制及巨幼红细胞贫血，营养性缺铁性贫血和障碍性贫血进一步参考内科学。16、D17、C18、A19、D内源性基因突变，与基因型改变没有引起表型改变或不足以引起表型改变或感染性疾病早期，外源入侵基因，不足以引起机体表型变化（如感染量极少），用基因诊断方法则可以进行早期诊断。基因诊断属于病因诊断，但不是其主要优点。诊断是用医学科学的方法对疾病的表现所作出的辨证逻辑的绪论。临床诊断过程对人体都有一定的影响。基因诊断正逐步走向临床。20、A1985年Jeffreys等人在人体基因组DNA中发现了高度可变的小卫星区域，在同一酶解物的Southerblot图上，不同个体之间除非同卵双生谱带都不同，原因是小卫星的高可变区形成的DNA的多态性。属于蛋白质、氨基酸和RNA尚没有多态性这一说法。13、A14、B53一、

多项选择题1、

AB人类疾病的发生往往涉及内源性基因突变，如遗传病和外源性基因入侵，如感染性疾病（细菌、寄生虫感染等）。基因重组和姊妹染色体交换是基因“生理”的过程，可能产生疾病，但是从遗传学上来说是希有事件。2、ABCD机体抵御外源性病原体体现在整体水平，表现为机体调动自身免御系统的整体防御。在细胞水平如Mφ吞噬异物，分子水平则有抗原抗体反应。基因水平则表现为限制修饰系统对入侵DNA的水解作用。3、ABCD4、ABC5、ABC6、ABD检测基因表达产物蛋白质结构的变化属于表型诊断。基因诊断必须建立在临床诊断的初步结论的基础上，不是随意诊断。AD根据生命状态基本逻辑原理每个物种都有一套与众不同的核酸，此为感染性疾病诊断的分子学依据。一、

多项选择题547、AD据生命状态基本逻辑原理，每个物种都有一套与众不同的核酸，此为感染性疾病诊断的分子生物学依据。8、ABCD从遗传学上来说，基因突变有如下特点：（1）希有性基因突变在任何一种生物都是一种希有事件，对人类来说，其突变频率约为10-5~10-6/细胞代，细菌为10-7~10-8/细胞代；（2）随机性基因突变不论对细胞、个体或是对基因或是对基因表型影响的方向来说，都是随机事件；（3）可逆性基因可以发生正突变，也可发生回复突变，只不过二者频率不一样，这意味着只是基因分子结构的改变，并非基因的丢失；（4）有害性大部分基因突变的表型效应都是有害的，人类的各种遗传病都是在进化过程中经突变而产生的。9、ABCD10、ABC7、AD据生命状态基本逻辑原理，每个物种都有一套与众不55三．名词解释1、基因诊断(genediagnosis)是在基因水平上对疾病或人体状态进行诊断的一种新的诊断疾病的方法，它包括产前诊断。2、DNA指纹（DNAfinger--printing）1985年英国学者发现人类基因组中存在高度可变的小卫星区域，在同一酶降解物的Southern印迹图上同一个体的不同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同个体之间（除非同卵双生）谱带都不相同，如同人的指纹一样具有高度个体特异性，因此这种Southern印迹图称为DNA指纹或基因指纹。三．名词解释56四．简答题1．基因诊断的概念界定以下6个方面内容。（1）诊断水平是基因水平，不是分子、细胞、器官或整体水平。（2）诊断技术是分子生物学技术，从方法上来说，没有特殊的基因诊断方法，就是分子生物学技术在临床上的应用。（3）诊断材料是DNA或RNA。（4）诊断内容对内源性基因来说，基因结构和表达是否异常；对外源性基因来说：入侵基因的种类，是病毒核酸，细菌质粒还是寄生虫DNA。（5）

诊断途径①直接检查基因结构，是否存在：DNA点突变、缺失、插入、基因重排或染色体畸变；mRNA剪接缺失、错位、结构变化等。②检查基因转录产物mRNA:a.已经转录还是没有转录？

应该转录还是不应该转录？

转录正常，过量还是过少？③检查基因表型：正常还是异常，进行分析研究。（6）诊断目的①确诊相应疾病或得出相应结论。②

是防治疾病或基因治疗的根据。四．简答题572、据临床诊断的初步结论进行基因诊断，可以：⑴直接探测基因结构是否存在突变；⑵检测基因转录产物mRNA是否表达异常。3、DNA探针技术，PCR技术及DNA探针和PCR结合的技术。4、1985年英国遗传学家等人在人体基因组DNA中发现了高度可变的小卫星区域，在同一酶解物的印迹土上同一个体的不同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同个体之间（除非同卵双生）谱带都不相同，如同人的指纹具有高度个体特异性，因此这种印迹图称为基因指纹，是法医察检工作中个体识别与亲子鉴定的分子生物学基础。2、据临床诊断的初步结论进行基因诊断，可以：58五、

论述题1.传统疾病的诊断方法可以称为表型诊断。表型诊断与基因诊断的区别如下表型诊断基因诊断诊断依据疾病表型变化基因结构异常和表达异常分类临床诊断、血清学诊断、 生化学诊断DNA诊断RNA诊断特异性表型改变在很多情况下是非特异性往往难以明诊断延误病情,如FOU。以探测基因为目标，属病因诊断，只要有特异性的探针，用分子杂交原理，即可诊断,具有特异性。敏感性难以评估.。探针可用“放标”或“非放标”,诊断灵敏度高，标本只需微量，DNApg水平即可早期诊断因为表型改变往往出现较晚难以早期诊断。在表型改变之前，基因结构或表达已发生改变，故可早期诊断.诊断范围难以评估原因参下述五、

论述题表型诊断基因诊断诊断依据疾病表型变化基因结构异常59（1）基因探针可以为任何来源，任何种类；序列可以为未知或已知；目标可为特定基因或特定基因组合，或是内源性基因或是外源性基因，所以适应性强，诊断范围广。（2）被检查的基因是否处于活化状态并不重要，故可对分化阶段表达特异性基因及其异常进行检测和诊断，这对肿瘤（如CMI）疗效及预后尢为重要。（3）在感染疾病的诊断，能检查正在生长或潜伏生长的病原体，既能明确现行感染，又能明确既往感染。对不易诊断（如产毒性大肠杆菌和不能安全培养（如立克次体）者进行基因诊断，扩大了实验室诊断范围。（1）基因探针可以为任何来源，任何种类；序列可以为未知或已知602、诊断是用适当科学的方法对疾病的表现所作出辩证逻辑的结论。诊断学是论述诊断疾病的基本原则和方法的一门课程。其基本原则就是研究症状，体征发生的基本规则和机理，以及建立诊断的思维程序。基因诊断是诊断学的读写。从这个意义上来说基因诊断遵循诊断和诊断学的基本原则。基因诊断必须建立在临床诊断基础上。2、诊断是用适当科学的方法对疾病的表现所作出辩证逻辑的结论61第一套逆向遗传学(reversegenetics)思维程序：（1）取人类基因组DNA；（2）建立DNA文库；（3）克隆位任一DNA片段作为探针；（4）确定该探针在基因组中的位置；这种探针在基因组中的位置一旦被确定下来，就可以成为有用的遗传标记（geneticmark）;（5）大量应用此类新的遗传标记，用染色体“步移法”或染色体“跳跃法”，建立各条染色体的连锁基因图，最终建立整个人类基因图谱；（6）筛选遗传病人或怀疑与基因有关疾病的病人；（7）克隆病变基因；（8）比较正常和异常基因的差别，推测正常，异常基因产物在细胞中的定位及其生理病理效应。第一套逆向遗传学(reversegenetics)思维程序62第二套“站在巨人的肩膀上”（1）你诊断/研究的疾病是否：与/有/知道

①

基因有关或相关的基因；②

该基因的正常/异常序列；③

该基因结构/表达异常的类型；④

特异性探针/PCR引物；⑤

转录物；⑥

表达产物/表达产物功能/表达产物功能测定方法。（2）

据（1）设计基因诊断方案。4、参3答案。第二套“站在巨人的肩膀上”63第十六章基因诊断第一节概述一、

什么是基因诊断所谓基因诊断，就是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断，它包括产前诊断，是一种新的临床诊断方法。是以DNA和RNA为诊断材料，利用分子生物学技术，通过检查基因的结构或表型来诊断疾病的方法和过程；其临床意义在于能检测DNA或RNA的结构变动与否，量的多少及表达情况等，以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作为疾病确诊或进行基因治疗的依据。第十六章基因诊断第一节概述64二、基因诊断的概念界定以下6个方面内容：

（一）诊断水平基因水平（二）诊断技术从方法学来说，没有特殊的基因诊断方法，就是分子生物学技术在临床上的应用。

（三）诊断材料DNA和RNA。（四）诊断内容1、对于内源性基因来说：基因结构和表达是否异常。2、对于外源性基因来说：入侵基因的种类，是病毒核酸、细菌质粒还是寄生虫DNA.

（五）诊断途径

1、直接检查基因结构是否存在：DNA点突变、缺失插入、基因重排、染色体畸变、mRNA剪接缺失错位或结构变化等。

2、检查基因转录产物mRNA：1）已经转录还是没有转录？2）应该转录还是不应该转录？3）

转录正常、过量还是过少？3、检查基因表型：正常还是异常，进行分析研究。

（六）诊断目的1、

确诊相应疾病或得出相应结论。2、

是防治疾病或基因治疗的根据。二、基因诊断的概念界定以下6个方面内容：65三、基因诊断的思路（一）基因是随便能诊断的吗？总不能乱诊断吧？（二）基因诊断和传统的疾病诊断方法有什么区别和联系？（三）基因诊断的理论基础和技术能不能诊断诊断学基础怎样诊断？为此，作下述讨论。希望对大家有所帮助。三、基因诊断的思路66四、基因诊断方法和传统的疾病诊断方法

表1表型诊断（传统方法）基因诊断（一）诊断依据疾病表型变化基因结构异常和表达异常（二）分类临床诊断（病因、病解、病生）DNA诊断血清学诊断RNA诊断生化学诊断（三）特异性表型改变在很多情况下是非特以探测基因为目标，只要异性的，往往难以明确诊断，有特异性探针，利用分子延误病情如FOU?杂交原理即可诊断，具有很高的特异性。

（四）敏感性探针可用“放标”或“非放诊断灵敏度高，标本只需微量，DNApg水平即可。

（五）早期诊断因为表型改变往往出现较晚，在表型改变之前，基因难以早期诊断结构或表达已发生改变，故往往可以早期诊断。

四、基因诊断方法和传统的疾病诊断方法67（六）基因诊断范围广因为：①探针可为任何来源和种类，序列可为已知或未知，目标可为特定基因或特定基因组合，外源性或内源性基因，所以适应性强，诊断范围广。②被检查基因是否处于活化状态并不重要，故可对分化阶段表达特异性基因及其异常进行检测和诊断，这对肿瘤（如CML）疗效及预后尤为重要。③在感染性疾病的诊断，能检查正在生长或潜伏病原体，能明确既往感染或现行感染，对不易诊断（如产毒性E.coli）和不能安全培养（如立克次体）进行基因诊断，扩大了实验室诊断范围。（六）基因诊断范围广68（七）二者关系1.基因诊断必须建立在临床一般检查的基础上，它必须是临床检查的第二步或第三步手段。（不是随便诊断）2.基因诊断是分子生物学和医学遗传学发展到今天人们的一种设想，现在逐步走向临床，变成现实。3.尽管实验研究和临床应用技术原理相同，但诊断对象是人的时候应该慎重！（不能乱诊断）4.同临床诊断一样，忌不独立思考，人云亦云（举例）。（七）二者关系69

细胞膜

细胞核DNAmRNA转录翻译（protein）临床表现基因诊断生化诊断血清学诊断临床诊断图一基因诊断与表型诊断细胞核70（五）基因诊断与诊断学（一）诊断是用医学科学的方法对疾病的表现所作出的辩证逻辑的结论。诊断目的：为了防御疾病和进健康。（二）诊断学是论述诊断疾病的基本原则和方法的一门课程。其基本原则就是研究症状体征发生的基本规律和机理以及建立诊断的思维程序。基本诊断方法包括：询问病史、体检、实验室检查、以及其他检查如：心电图、超声检查、内窥镜、CT、核磁共振等等。（三）基因诊断是诊断学的续写，是诊断学的新篇章，从这个意义上来说：基因诊断遵循诊断学的基本原则；基因诊断的基础是医学基础，专业基础是医学分子生物学和医学遗传学，不同的是我们在基因水平上，学习和研究：基因解剖（结构）、基因生理（转录翻译等）、基因病解（结构异常），基因病生（表达异常），然后主要应用分子生物学技术手段进行基因诊断。（五）基因诊断与诊断学71（六）基因诊断的思维程序：第一套：逆向遗传学（reversegenetics）思维程序1.

提取人类基因组（总）DNA；2.建立DNA文库（DNABANK）；3.克隆任一DNA片段作为探针。4.确立该探针在基因组中的位置；这种探针在基因组中的位置一旦被确定下来，就可以成为遗传标记（geneticmarker）.5.大量应用此类新的遗传标记(用染色体步移法或染色体跳跃法)建立各条染色体的连锁基因图谱，最终建立整个人类的基因图谱。6.筛选遗传病病人或疑有与基因有关的疾病的病人；7.克隆病变基因8.比较正常基因和异常基因的差别推测正常异常基因产物（蛋白质）在细胞中定位以及生理病理效应。（六）基因诊断的思维程序：72第二套拿来主义1.您诊断/研究的疾病是否：与/有/知道1）基因有关；2）该基因的正常/异常序列；3）该基因结构/表达异常的类型；4）特异性探针/PCR引物；5）转录物；6）表达产物/表达产物功能/表达产物功能测定方法。2.

据1设计基因诊断方案。第二套拿来主义73第二节基因诊断的分子生物学基础一、基因诊断的理论（一）生物大分子结构和功能（二）基因组结构和功能（三）遗传信息的复制和表达（四）基因表达的调控（五）细胞通讯与细胞信号转导的分子机制（六）癌基与抑癌基因（七）基因与疾病第二节基因诊断的分子生物学基础74二、基因诊断的技术

（一）核酸分子杂交，在这些方法中，1.Southern印迹法是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。2.Northern印迹法可用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。3.斑点杂交

可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。4.原位杂交

可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原为杂交的结果是显示有