动物细胞工程

关于动物细胞工程第一页，共六十二页，2022年，8月28日动物细胞工程第二页，共六十二页，2022年，8月28日动物细胞工程常用技术动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体制备胚胎移植核移植动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。第三页，共六十二页，2022年，8月28日(一）动物细胞培养

阅读：动物细胞培养，思考回答下列问题：

（1）动物细胞培养液成分？（2）动物细胞培养过程？（3）动物细胞培养的应用？第四页，共六十二页，2022年，8月28日培养液的主要成分：无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素和动物血清等。特点是：（1）液体培养基（2）含有动物血清第五页，共六十二页，2022年，8月28日1、无菌、无毒

2、适宜的温度和PH值

3、必要的气体条件（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）36.5+（-）0.5度O2和CO2（95%空气和5%CO2）其他条件：第六页，共六十二页，2022年，8月28日一、动物细胞培养1、过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。（分解弹性纤维，使细胞分散）10代细胞原代培养50代细胞50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系第七页，共六十二页，2022年，8月28日一、动物细胞与组织培养1、过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶10代细胞原代培养50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系剪碎第八页，共六十二页，2022年，8月28日

应用大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）移植皮肤肿瘤防治生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据第九页，共六十二页，2022年，8月28日细胞的全能性细胞株、细胞系植株培养结果获得细胞或细胞产物快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目植物组织和动物细胞培养的比较第十页，共六十二页，2022年，8月28日第十一页，共六十二页，2022年，8月28日第十二页，共六十二页，2022年，8月28日第十三页，共六十二页，2022年，8月28日第十四页，共六十二页，2022年，8月28日能否通过体细胞杂交来培养杂种动物或动植物杂种呢？第十五页，共六十二页，2022年，8月28日思考：本实验证明了什么?第十六页，共六十二页，2022年，8月28日

思考：1、什么叫动物细胞融合？2、促进细胞融合的方法有哪些?

3、细胞融合技术最大的优点是什么？4、动植物细胞融合有哪些异同？物理法化学法生物法

离心、振动、电刺激聚乙二醇（PEG）

灭活的病毒（灭活的仙台病毒）链接:病毒促融细胞(一)动物细胞融合第十七页，共六十二页，2022年，8月28日主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株物理、化学方法灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞膜的流动性细胞膜的流动性、应用诱导方法细胞融合的方法原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目总结：植物、动物细胞融合的比较第十八页，共六十二页，2022年，8月28日

回顾1、抗体的化学本质？2、抗体由什么细胞产生？3、抗体的作用特点？4、抗体的分布？（二）单克隆抗体的制备思考：如何获取某种特定抗体？第十九页，共六十二页，2022年，8月28日1、抗体的传统生产方法再从动物血清中分离抗体该法制备抗体的特点：产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。输入浆细胞动物体内

某抗体

某抗原第二十页，共六十二页，2022年，8月28日一个B淋巴细胞——只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞——能无限增殖杂交瘤细胞既能分泌一种特异性抗体又能无限增殖1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒设计想：

思考与探究：如何获得大量化学性质单一、特异性强的抗体？第二十一页，共六十二页，2022年，8月28日2、单克隆抗体的制备过程

自学与思考：1）在从小鼠体内取B淋巴细胞前应对小鼠作何种处理？为什么要这样处理？2）从小鼠何处获取B淋巴细胞？3）两类细胞在一起可能出现哪些融合类型？4）是否所有杂交瘤细胞都能产生某一特定抗体？5）由特定的B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合成的杂交瘤细胞具有什么特点？6）最后可以可通过哪些途径大量获取抗体？第二十二页，共六十二页，2022年，8月28日2、单克隆抗体的制备过程第二十三页，共六十二页，2022年，8月28日细胞融合小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞杂交瘤细胞第一次筛选用特定的选择性培养基体外培养液中培养注射到小鼠腹腔经免疫的小鼠（注射抗原）提取第二次筛选能产生特定抗体、并能无限增殖的杂交瘤细胞提取单克隆抗体第二十四页，共六十二页，2022年，8月28日例题1：1975年，英国剑桥大学分子生物学实验室的科勒和米尔斯坦，把小鼠的淋巴细胞（脾细胞）和小鼠的骨髓瘤细胞融合起来，成为杂交瘤细胞，实现在体外大量生产抗体的目的。实验过程如图所示。(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合”在一起，说明细胞膜

。(2)单克隆抗体的准确定义应为()A．一类特殊抗体B．无性繁殖系

C．单一抗体细胞的无性繁殖系D．单一抗体细胞的有性繁殖系(3)杂交瘤细胞繁殖进行的是_______分裂。(4)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪原(病原体或癌变细胞等)并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生命导弹”这是利用了

_____________

。第二十五页，共六十二页，2022年，8月28日

[变式练习]右图为细胞融合的简略过程，请据图回答：⑴若A、B是植物细胞，在细胞融合之前已用

处理，除去了

；A、B到细胞C的过程中，常用的物理方法是

。⑵若A、B是植物细胞，则形成的D细胞还要应用

技术把D培养成植株。⑶若A、B是动物细胞，一般取自

，然后用

，使其分散开来，A、B到C的过程中，常用的不同于植物细胞的手段是

，所形成的D称为

。⑷若该过程是制备单克隆抗体，A为小鼠，那么，在获得此细胞之前，小鼠已被注射了

。注射后小鼠身体产生了相应的

。图中B为

。⑸若该过程仍是制备单克隆抗体，在A、B到C的过程中，所形成的C有

种，用来培养的D细胞应该是

。从中选择出它的方法是

培养。获得D后，常用的培养方法是

。第二十六页，共六十二页，2022年，8月28日单克隆抗体：特异性强、纯度高、灵敏度高，产量大、容易标准化生产。3、单克隆抗体的优点第二十七页，共六十二页，2022年，8月28日4、单克隆抗体的应用１、可用于作为诊断试剂：有准确，高效，简易、快速的优点２、可用于疾病治疗３、可用于运载药物（作为运载对应疾病的药物的“生物导弹”。）“生物导弹”＝单克隆抗体＋药物第二十八页，共六十二页，2022年，8月28日[例题2]（1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时，将抗原注射到小鼠体内，可获得（）

A．T淋巴细胞B．效应B淋巴细胞

C．抗体D．记忆细胞（2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中，正确的是（）

A．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台病毒或聚乙二醇诱导

B．融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克隆抗体

C．体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不能无限增殖

D．单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性明显

BCD

ABCD第二十九页，共六十二页，2022年，8月28日大家都在奔跑不进则退第三十页，共六十二页，2022年，8月28日第三十一页，共六十二页，2022年，8月28日

［拓展提高题］已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答：（1）试管中除融合的杂种细胞外，还有

种融合细胞。（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂种细胞，并说原理。方法：

。原理：

。第三十二页，共六十二页，2022年，8月28日[例题3]右图是某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。据图回答：(1)该方案能达到预期效果吗？原因是什么？

(2)图中②为什么过程？常用什么诱导剂？该细胞的特点？(3)图中③进行细胞培养，目的是什么?(4)图中④的细胞培养目的是什么?(5)破伤风杆菌的抗体最终可从什么中提取?(6)该方案的目的是什么?第三十三页，共六十二页，2022年，8月28日第三十四页，共六十二页，2022年，8月28日第三十五页，共六十二页，2022年，8月28日（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？思考：（2）单克隆抗体制备过程中应用哪些细胞工程技术手段？（3）制备过程为何要经过两次筛选？第三十六页，共六十二页，2022年，8月28日单克隆抗体的制备抗原小鼠B淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞细胞融合，筛选细胞培养筛选，继续培养体外培养体内培养单克隆抗体第三十七页，共六十二页，2022年，8月28日单克隆抗体有何应用？

主要用于疾病的诊断、治疗和预防。与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高的优点。如；各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫等数百种疾病的诊断；在疾病治疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士，能识别“自己”与“异己”，一旦发现致病因素便与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗癌药物制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。第三十八页，共六十二页，2022年，8月28日

绝大多数的单克隆抗体(mAb)是用小鼠开发的，虽然可作为研究和诊断的工具，但它们至少在一定程度上不是理想的治疗剂，：因为它们在人类中有免疫原性。也就是说，小鼠抗体引入到病人体内，将被病人的免疫系统识别为外源物质，并将发生有损治疗抗体利用的人抗鼠抗体(HAMA)应答。已经通过将这些鼠的抗体人源化或直接制备人的mAb来解决。第三十九页，共六十二页，2022年，8月28日直接制备人的mAb

通过人的B细胞与骨髓瘤细胞融合，已经制成了人的抗体，虽然这曾是十分困难的，并且通常在融合前需要用EB病毒感染以无限增殖B细胞。这种方法由于使用病毒而不理想，产生的mAb的特异性是有限的，抗体的产量也很少。最近，通过用人免疫球蛋白基因取代小鼠免疫球蛋白基因创建了产生人抗体的小鼠。因此，当小鼠被免疫时它直接制造出对该抗原的人的抗体，并且产生这些抗体的B细胞可与骨髓瘤细胞融合，产生制造人mAb的杂交瘤。第四十页，共六十二页，2022年，8月28日因为B淋巴细胞具有分泌特异性抗体的能力，而骨髓瘤细胞具有在体外培养条件下大量增殖的本领，所以由某种B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞，能够在体外大量繁殖，并且产生特定的单克隆抗体。第四十一页，共六十二页，2022年，8月28日细胞融合技术、细胞培养技术。第四十二页，共六十二页，2022年，8月28日第一次筛选得到杂交瘤细胞，第二次筛选先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞下培养筛选出特异抗体的细胞群。第四十三页，共六十二页，2022年，8月28日动物细胞培养技术的应用（1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。（3）用于检测有毒物质（4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据这只老鼠身上的“人耳”是由我国科学家曹谊林教授利用细胞工程技术复制出来的。第四十四页，共六十二页，2022年，8月28日拓展：聚乙二醇处理后，培养液中存在哪几种细胞？脾-脾脾-瘤瘤-瘤未融合的脾细胞未融合的瘤细胞第四十五页，共六十二页，2022年，8月28日已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断，人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂交瘤细胞，请回答：

（1）试管中除融合的杂交瘤细胞外，还有_____________种融合细胞。

（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂交瘤细胞，并说明原理。

方法：原理：试试身手第四十六页，共六十二页，2022年，8月28日解析：

（1）试管中有人的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞，在促溶剂的作用下，可能出现以下3种细胞的融合情况，人的淋巴细胞和淋巴细胞融合，小鼠的骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞融合，人的淋巴细胞和小鼠的骨髓瘤细胞融合，实验需要的是第3种细胞，即杂交瘤细胞；

（2）要将杂交瘤细胞分离出来，可以在培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞；加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞中可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。第四十七页，共六十二页，2022年，8月28日变式训练生产单克隆抗体时，要在培养液中加入某种试剂才能筛选出杂交瘤细胞，因为该试剂A．能抑制淋巴细胞和杂交瘤细胞的DNA复制B．能阻止淋巴细胞的原癌基因被激活C．选择性抑制骨髓瘤细胞的DNA复制D．能阻止杂交瘤细胞核糖体上所有蛋白质的合成第四十八页，共六十二页，2022年，8月28日（3）将分离出的杂种细胞在不同的条件下继续培养，获得A、B、C三细胞株，各细胞株内含有的人染色体如下表所示（“＋”有，“－”无）

细胞株人染色体编号12345678A株＋＋＋＋－－－－B株＋＋－－＋＋－－C株＋－＋－＋－＋－第四十九页，共六十二页，2022年，8月28日测定各细胞株内人体所具有的5种酶的活性，结果是：①B株有a酶活性；②A、B、C株均有b酶活性；③A、B株有c酶活性；④c株有d酶活性；⑤A、B、C株均无e酶活性。若人基因的作用不受鼠基因影响，则支配a、b、c、d和e酶合成的基因依次位于人的______、_______、_______、_______和_______号染色体上。第五十页，共六十二页，2022年，8月28日解析：（3）B株有a酶活性，通过表格可以看出B株有6号染色体而A、C株没有，说明控制a酶活性的基因位于6号染色体上。控制其它酶的基因所在的染色体位置以此类推。答案：6；1；2；7；8。第五十一页，共六十二页，2022年，8月28日获得细胞细胞的全能性细胞株、细胞系植物体培养结果或细胞产物快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理