C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定

-C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定广东学药学院报ournJaIfoGuangdngoParmhceutiaalcUnievrstyiunJ2.14,030（3）C75胚小胎神经鼠干胞的分离、培细与养定鉴12万丽1易，林，桦贝伟剑（1广.药学院东中医药研究/广东省院代性谢病疾中医防治药重实点室验，家国中医药理局管脂高血调肝降脂症重研点究室/国家中药管理医局代谢脂级实三室验，东广广5州10006;.2中大学山生科命学院干学胞研究细室，广广州东510006）培养神经干胞细（NSCs）并，对其行进鉴定方。采法用动手法胰蛋白酶消化及法摘：要的体外分目离分离、鼠脑细胞胎，用化的无优血清NSC培s养基行进养培。细胞疫免光荧检法测NCSs特异性标记子3d分左获右得大未分量化巢呈悬浮状生的长表的达结。果分离脑的细体胞培外养48h已部分大壁贴神，经干胞细团第3代时，。少很见到贴细壁胞，几乎是神全球，经神经球周围在存较多刺微。细表胞达一中种间丝蛋白，即巢蛋白(nesti)n。论结成功分、离鉴定出C57小鼠NSsC,并在体外可件条进下行传扩增培代养。关键词：C57胎小胚；鼠经干细胞；神胞细培；养蛋巢白中分图类：号R392文献志标码A:di:10.o3969j/.sin.1s060873.8214003.0.22878(3214)000354340章文编号：0016-Islaoion,tculurteandiedtifnciaitnoofeunalrstemcelslrfmoC5e7bmyorinmccieWNAi1L,IYHualn2,iBEIWejia1n1.(uGnagdognTMCKeyLabratoryofroMtaboelciisDaees,sKyeLbarotorayoModfluaintgLievrtoTratHepeyripemlaiSATM，anCLdeev3lLabraotroyofLiidMpteboaismSAlTM，CInstiuteoftChineseedMciinlaSicneec，GsuagnongdPharacemtucailUinvesrtyiGuan,gzohu51006,0hCin;a2.StmeCleRlseeacrhDepratmne,tchoSloofifLSceeicens,uSnYtasnUeinersivyt,Guagnzhou,50006,1China)bsArtatcObejtivcToeislotaecuturlaneddeitnfiyhteeunarlstemcllse(SCN)s.MethodNSsCsformftaleimceeweirslotedabydisesticonadnnzeyatmidcgiestoina，nductlrudeniheopttimaslreufreemSCNmdeimuheTpesifcicbioamkerorfSNCwssadetetedbycmiumnocyotluoresfectassan.yesuR1sthTeislatedoNSsCdahreedtothceutlruelptaewihitn48,andhnstelikclesuetrofsNCSweresobtaiednintheulcturesuspnseoininabout3.dOnte3hthasspgeasfNoSC,asherendcetlslarearelyrseen，andnealryallerwenerusohpereswthspiinlueNstenwasiexprsseeidntehculutrdceels.ClncoulisnoNCSsarsecucesfuslylsilaotedandcutlreudfomrfetlCa75miec,adncoludpolifrertaenivitroeyKworsdC:57mbeyoricnmci;enerulsteacemll;scelcluturel;nestinNCSs具分有化为经干细胞神（neuarstemlcle,l神经元、星形质胶细胞少和胶突质细的能胞，力能自。更我新，并足提以供量大脑组细胞织细的群，，胞SCsN现发已现多种型类的中神经系枢损统后伤激活并被利于有组的损织伤修和功能复复恢。因400收2日稿：期201[421]止匕，研究NSCs的物学生于对神经统损系修复伤和34[]o临床用中应，退行病变的性疗治具重有意义要NSsC的来源数量和限是有前存目在的主要题问。NSsC体的培养外和增对扩实于其现在潜价值止匕，［因65］。SCsN的体获外取可过直接通具有从重要用作金项目：基广东省育部产学教研结项目(合202109B1011039);州广科技市计助划项目资(11C21307338)3359607,2Emal:107i515171@9qq.cm；o通信作要从事中主药药理究研电，：02话0作简介：者万丽198(8-),女，士研硕究生，maiE:lbiwje200@a0iyun.lco。m者贝伟：剑(169-)3,研究，主员要事中从药理研究和新药研发，药男博，士，0519:655络网版由间：时2140网由版络地址ht:pt/www./nkcine.t/cmk/details4/.4141.3R20.4051160.55.091.htm0l3期第等.C57胚胎鼠小神经干细的分离、培胞养鉴与定丽，万355神经组分织离培、养他来其源细干的胞诱分导、永化主要过悬通浮长生贴和生的化SNCs3种径实途，现壁培养2种方式进行体外扩增。悬浮神经球(nuerspheroaessya,SNA)是NCS体外s培养最中常用的方，式该基于N法SsC在生长、外无体血清培养中基可依有丝赖裂原分的系维、悬浮成球生长、维自持我[7]更新和分未化态的状特发点建立展来起。尽管神球经法对相简易单，行不同验室提实由各自的操开腹腔,露两侧暴子，宫用科眼镶住钳宫头子端，顺宫分离至子宫角子剪下处，放入有冰PSB溶液培养皿，中依次去子宫壁除和膜，胎细仔分离得到组脑织，手动得法到胎鼠脑细。胞冰D的MMEF12洗涤1遍，加入0.1%（0小）的胰蛋酶白，在恒培温摇床养MDEM/F21终消化。用止010上37C消化30min,1000r/mni目筛子，过滤收，集于心离中，管离心3imn,去上，清加入已配制的好NCS培养基s（含NCsS2B27、%02gn/LEGF、20mgn/m基L础培养、基FGF?制成单胞悬细液细，计数胞后，之加入6孔板。31。中原培代养每换天次1液..22C5胚7胎小鼠NSCs的培养和纯化相差显在镜微每下观察天鼠小SCsN的贴壁悬及、浮生长作程序但,NSCs培养对件条和作技术操求要高，不同发育较段脑组织阶的择、细选胞分消化和接种离代方传式、培基成分等细节的养变都会影改NS响C的s培养果，结因而如何得获稳、体定增外能力殖和低度成球密力强、能能反复传代的N够Cs是NSCsSW[8究]的基本问题本研究。从定特育阶发脑段织获取细胞组通过分，离培方养的不法优化断，立从建2.51dC57的孕胚胎鼠脑分中离养培NSCs方的法。情和况形变化。态待细生胞密度达长>XX%SU长满时，贴壁对分部和浮部分分悬用别0.12%5的蛋胰白消化3酶inm,开分培，养至第代3P3(,)可以到较纯且活得较性好的神干细经胞球。1..213..321.5C胚7胎鼠的小SNs的鉴定C光观察镜倒置微镜显下察不观同间点时神经细胞和干经神球的形态O11.1料与材方法材料试齐I」.11.1NSCs基培础养(基山中学生大科干院细胞中心张雁教授惠赠)；B27(Gico公b司)；FbF(GroSPecpaTnyTechoGenneLt.公d司)；EF(GPrSopecTnayTehcnoeGenLtd.公司)；胰蛋白酶、1.2.32N.CSs志标蛋n白sten表达i的检测将P神3经转移至用球L聚多氨酸包被赖盖的片玻，养培DME/M1F（2Hylcoen公司）；PBS、4%L多赖聚酸、氨（）小的聚多甲、醛riTonX100t（国鼎物技术生有限公司）；山羊清血博奥森（生技物术限有公）司；兔抗巢蛋（n白etsn）i克多抗隆（体美国SnataruzC公）司；抗羊兔Dylgith94（5aErthxo）;Hocehs33t58、2片液（封Beyotime公）司。1.1.2主仪要器高速冷冻离心机（德国Eppndore）f;水式套CO2养培（美箱国ShelLa公司b）;荧倒光置微镜（显国德eZsis司公）倒；相置差显镜微日（本Oylmusp公司；）BT224S分天析平［赛多利斯Sa（troiru）s科学仪（器北京）有限司公］;PUERLABPURLAEBULTARGEMK超2Option纯7s纯机水、5全0自高压动消毒水锅机ELGA）（;HVEH（rayiaam）;CB499WDXK箱（Haer）i;HT10Z3B恒培养摇温床（上一恒科学海仪有限器公司）。.1.21实动物验C57B/L6小鼠，180,d雌，性自购中山学大实验动中心，生物产可许证号SCKX（粤201）10029o.21法方1.2.C157胎小鼠胚SNC的s离分孕将21.5d的57C鼠断颈处孕，用死酒精消毒后，之腹沿正中线[9打]至胞大细分部贴壁。去弃胞培细液，养用PBS洗3。遍加4族聚甲醛定固3m0in,力口PBS冲洗5minx3;0.2%Tirtxo100室温膜破10inm,PS洗B涤5min3;X5%的羊山血室温封清闭03minP,SB涤洗5mnx3;i一抗nestni1(5：0)4C孵育过夜、抗二yDLihtg945AffiniPurGoatenAtiRabbitgIG(+HL)(：1100)室温避光孵lh,育oeHcsh33t52(18以gm/)L室温避光复核染15mni,PSB冲洗2遍，封片，显微镜察观。22.1结果57C胚小胎鼠SCNs的离、分培与纯化养分离得到的5C7胚小鼠胎的NSsC镜光下见，原代细可接种后，胞部分细胞渐逐降沉贴附于6孔板面，表体较小，有光胞晕，悬部浮可分看到以亮很圆的形细组成的细胞胞。团第2以后天看可到细胞大分贴部壁，悬浮细胞较亮且较，很圆多细团块胞。成辐射状贴壁长生浮部分可悬看到一以些十几个由细组成的桑黄胞神经状球小浮生长悬如图1A。接，种3第天之后，经小球直神径逐渐增大贴，的壁胞细块颜色逐团渐变暗原。代养中可见培神经球围周无明显刺突，在明显存胞聚集细，如图1Bo356广东学院药学报30第卷3讨论NSC箱自我更新倾向能在体外培并养件下条“神经球,”成形可其能为枢神中系统损经伤脑缺如血缺、、氧颅脑伤的神经修复外提供策略新多。年来研者们究直一寻求用细胞进干行胞替代治细，疗治.A代原第2天B.;代第原3天。1图原神经干细代球胞100()xPrimrynaerualstemclesIspeherFguriel中疗神枢经系统神的功经能陷缺疾病，如外伤肿瘤、除切术功能障碍后、中、风经神化退疾病性老年如痴症呆帕、森金、病多发性硬化[1等10]O4原代以材神经取球培养NS法C的s势优在能于原将代胞细壁部分传代，第贴3天显镜微观察，下见细胞可有一些贴壁，而也有且较多神的球经悬生浮。长经球形神较原状规代则央色淡中无明，显沉暗如，图2oP将1代细胞悬的部浮分代，传第3天观察，现与P象代1类似，是贴只细胞更少壁。P2代细胞继传续，代第3观天，察可到神经见球第较代2,小而数目显增多，明光折更强，性且状形加更规则，少见到贴壁细胞。神很经球周存围较在多刺微表，传代明后SCNs同的性增加，质处活跃的增于殖状。如态3。较图保好持胞原细有生物的学性特，体与内神发经生有好的良关性，相又能分为化不同特的神性细胞，经有能反效正映生理常过程干预和素因的作用，有助分于析SNCs增的殖自、更我能力和多向新化能分NSC研s为究神发经育程过提了良供好的。因力，此型模。统传鼠大NSs的体C培外养多采D用EMM/F12和2N/B27基础养基，培辅一定以浓度的bGF和F/或EG。F该培养在中基SCs必N以较高须密度种才能接成，球可不免地导致避了过的多经球聚神，集影响胞正细常生学特物的观察，性不合N适Ss自C更新的研究。我本研使用究的鼠大SCsN殖基础培养增,基是在统DM传EM/F21和N2/2B7基上础改的进优化配方。本研表明，究从孕1.25d的C57小中分鼠离NSsC采手动法和酶用消法分化离NSs,C及优化以A无.第1代经神干胞细（01X0;）B.第代神经3干细胞10（X0;）C.第3代神干经细胞（200X）。图2代传神干细胞经SucbltuurefonuerlastecmellsiFgure2血清培基，获养的N得SCs力活和产生率，有高强较的增殖力能，后为神经再续的生验研实和究枢中经神系统疾新药研病提供良好发了实的模验型基础。参和文献考[:1]AGEGRH.Mammliaannuerlatsmeclel[J]s.Sicncee,2000,287(545):743314318.：2]RYNELOSBADWISESS.Gneratienoofeunrnosndastracoteysromifosatledclesoftheladlumtmmalianacneralnertvousystsme[J.]Sciecen1,99,2525(5052):17077101.[3]HANZGZ,CGOHPP.MNeuorrsteoraivteterhaiespforstorek:nderluingymehcniasmsantrdasnltioantthoecliinc[J]LncateeurNl,o009,825():91405.04：]SNATAAJMMHUNCKGFVU,IKCVICV,etEa.Isolaltoin,hcarcaerizttaino,naddiffeentiartinoofpogreitonr2.2神经细干标志胞蛋ne白tsin达表检的测3代神经P贴壁后球，免荧光疫学化染发色，现神经球细中间胞丝蛋白nstei表n达阳性，呈胞浆着色，同样，核染料Heocsth33285将细核着胞，色图如3示所。神干细胞经标志物nsetni的达表(040x,细免胞荧光疫)法xprEessonofinetsinsathNSCsmarkere(004x,cellsforhummnaadUtadrenalmeulladJ].[SemtCelsTlarnslMd,e20xx,1(1)1783:917.[5]LXiIagnqinLI,UiaTninq,gSONGKdeong,ealt.Cultueornefuraltesmelclsniacliumclaginatebeds[a]J.iBtoechnloiFguer3immnucytofluoorsceetnasays)第期3.C5等胚胎7鼠神经小细胞干分离的、养培与鉴定万丽，357Por,g006222,(6):1631886.96]：MCIAHINALL,OAHLANNAUR.Rcoebminnatspdireisklmtricesforaneuraltesmcellcultuesr[J]Biomaeriatsl2,120,3331)(771277:1.77][SNUTa,WoAGXaioijgnXIE,Shansah,etnla.Acopmriaosnforpliferatiovecpaaicyantdpassainggpotnetailetbweneneuraltsemanprodgeinortcleslinaderhnetndnaureopherscelutrus[Je].InJtevDNerosci,u210129,7():72371.[38]IXNGOFanlging,GAOHasonguZENYaHneta.lOptialtmmieorfpsasgangineuospherrsebaedsnoprimryaenrualtsmceellultucrs[eJ].Ctytoechonlgy,o2011,163()6:216613.口9JSSEIAC,LJHOANANELA,CHRISTINASetal,ptimOistaoinofulcurectodntiinofsrodiffeerntitaoinfoC172.neralustmecelstloeubsdeorfinitvoroxitcittyetssMJ.TxociloinitVro,210,32(7)5:1651556.910]A[VIDSSONARCLLONI,KTRIIKD,eal.Netrouanlerlpaecemntformednogeonupsecrusorsrnithedualtrbaniatefrtrose[Jk]Na.Met,20d20,8(9:)96397.0[11]APRNTEJMEXLEVRZS,ONGCGetalR.tafroeabranieurngoeesinasdnstritalanuernorepaclementafterfcalotroks[Je]nAnNerolu,2020,52():6828031.[1]2ENGDWAIOMENJ,GBGEAHF.eNweuronsnnanedwmmeoier:shwodosaeultdhppiocmaplaneuroegneissafecflteanrngaidnemory[m]JN.atRevNeurosic,200,111():339553.0：3]KI1MHJ,UAREACHJMBVEALCOSIeta1.oDaminenpeurnodesirvefrdomebrmonyicstmeclelsfuntconiiannanmilamodleopafkrisnons/idsasee[J.]Naurte20,0,4108:0565：14.CA]EVJ,WWANMBA,KRE.AHdlusutbentviruclraozneneraustlmcellsaseapoettinlasoruecfodpaomneriicgeplraemectneurons[J]n.FrontNeruosc,i210,8(416):11.4(责编辑：幸任建华)?????????????????????????????????????????????353页)参考献文：1]国家药[委员典会.中人民华共国药和典20:0年1版一210:60126.部M[[.北：京人民生由卫社版，：2]继刘，王英平永，洪章.刘五味化子成学分药及研理进究J].特产研，究205,03(12):953.展4][3]海吴，星晓节，徐希妮，等侯.味子五素抗乙肿的瘤种多.吉林医药学院学，2报021,33()2:107用机制作[J11]0.：4]秦艳.纳米黄混悬雄液诱导卵巢癌KSV3O胞凋亡及细2/Bxa表的达影响[D].贵州遵：医义学院,其对cBl2021.：5LIU]iaoXi,ZnHANCheCgnu,yJNIXiduog,etnal.InihbiorytffeectfoschsianrdinBnogsartccinceraelclsnivitr[oJ]orsWGaJtrosnterole,0207,13(48):6056651[16]HANGUinMJ,NIJig,nSUNuH,LaUIGegtan.RevoeralsoPfg-lyocrpotiemenidtademultidrugesistranecofcanecrcelslbyivefschizndriasnislaotderomtfeChinehsherbeFurctuSscihzadnrea[J]Ca.ncreChemtohhPar,m00286(26):101510