新型重组类人胶原蛋白医学及其应用

新型重组类人胶原蛋白及其应用┃Human-likeCollagen类人胶原蛋白胶原蛋白传统提取方法的问题国内外重组胶原蛋白概况类人胶原蛋白研发背景胶原蛋白传统提取方式和面临的问题[1]He|ckeT．Gelatin，Thefoodtechnologist’sfriendorfoe．InternationalFoodIngredients．2000．1，6-8．病毒隐患动物源疾病(如瘟疫、禽流感等)或人体传染病(如病毒性肝炎和艾滋病等)病毒的传染危险[2]排异反应异种或异体排斥反应,导致植入部位无菌性炎症以及细胞数量和形态改变细胞毒性不溶于水，加工过程中所用的酸、碱、盐溶剂很难脱除完全,产生细胞毒性，并降低细胞粘附性制备方法：○酸水解法○碱水解法○酶解法原料来源：猪/牛/驴/鱼等动物的结缔组织123类人胶原蛋白研发背景FDA、欧盟对

动物源胶原蛋白医学应用的限制[2][3][4]Cooperman,L.andMichaeli,D.,1984,Theimmunogenicityofinjectablecollagen.I.A1-yearprospectivestudy.JAmAcadDermatol,10:638-646.

Lee,C.H.,Singla,A.andLee,Y.,2001,Biomedicalapplicationsofcollagen.IntJPharm,221:1-22.Olsen,D.,Yang,C.L.,Bodo,M.,Chang,R.,Leigh,S.,Baez,J.,Carmichael,D.,Perälä,M.,Hämäläinen,E.R.,Jarvinen,M.andPolarek,J.,2003,Recombinantcollagenandgelatinfordrugdelivery.AdvDrugDelivRev,55:1547-1567.寻找一种安全、有效并具有良好生物功效的胶原蛋白类材料在组织工程、医药美容等领域受到越来越广泛的关注国外重组胶原蛋白的研究现状2000年MyllyharjuJ等人使用甲基酵母表达生产准人纤维胶原蛋白Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型[5]1998年NokelainenM等用两种杆状病毒转染昆虫细胞生产类人特异性软骨胶原II型[6]2001年NokelainenM等使用四种人类基因报道了使用甲基酵母高水平表达I型前胶原[7]UittoJ等从人皮肤细胞体外培养中得到了Ⅰ，Ⅲ型前胶原[8]VaughnPR等在啤酒酵母中表达出了携带有羟基化片断的类人Ⅲ型胶原蛋白[9]由于哺乳动物细胞和昆虫细胞培养成本高,周期长,重组胶原蛋白表达量极低(1%左右)，培养只能限于实验规模,不可能满足产业化、大批量的需求[5]MyllyharjuJ，NokelainenM，Vuorela人KividkkoKI．ExpressionofrecombinanthumantypeI-IIIcollagensintheyeastpichiapastoris．BiochemSocTrans．2000．28(4)，353-7．[6]NokelainenM，TuH，Vuorela^NotbohmH，KivirikkoKI,MyllyharjuJ．High-levelproductionofhumantypeIcollagenintheyeastPichiapastoris．Yeast．2001J蚰30．18(9)．797-806．[7]NokelainenM，HelaakoskiT，MyllyharjuJ，NotbohmH，PihlajaniemiT'FietzekPP，KivirikkoKI．ExpressionandcharacterizationofrecombinanthumantypeIIcollagenswithlowandhighcontentsofhydroxylysineanditsglycosylatedforms．MatrixBi01．1998Jan．16(6)，329-38．[8]UittoJ，BoothBPolakKL．CollagenbiosynthesisbyhumanskinfibroblastsIIIsolationandfurthercharacterizationoftypeIandtypeIIIprocoUagenssynthesizedinculture．BiochimBiophysActa．1980Aug21．624(2)，545—61．[9]VaughnPR，GalanisM，RichardsKM，TebbTA，RamshawJA，WerkmeisterJA．Productionofrecombinanthydroxylatedhumantype1IIcollagenfragmentinSaccharomycescerevisiae．DNACellBi01．1998Jun．17(6)，511—8．中国巨子生物率先实现重组胶原蛋白规模化生产的突破在中国,西北大学的范代娣等[10,11]采用PCR(聚合酶链式反应)扩增，得到数段人胶原蛋白基因段，接着进行拼接重复,转化E.coli(大肠杆菌)，并通过高密度发酵培养生产人源性胶原白，所得重组胶原蛋白表达量高达29.4%[12][10]AdaehiT.,etal.GenerationofhybridtransgenicsilkwormsthatexpressBombyxmoriProlyl-hy-droxylasea-subunitsandhumancollagensinposteriorsilkglands:Productionofcocoonsthatcontainedcollagenswithhy-droxylatedpralineresidues[J].JournalofBiotechnology2006,126(2):205~219[11]骆艳娥,范代娣,花秀夫,张兮.重组大肠杆菌高密度发酵生产类人胶原蛋白的过程研究.西北大学学报2005,35(2):180~183[12]胶原蛋白与重组胶原蛋白的研究进展陈光徐珍珍吴铭明胶科学与技术第31卷第1期2011年3月Vol.31.No.1Mar.2011.科技部对类人胶原蛋白的评价世界首创全球唯一国际领先类人胶原蛋白的来源和制备类人胶原蛋白的创新性类人胶原蛋白的实验研究类人胶原蛋白介绍质粒载体人胶原蛋白基因构建原始菌(不具胶原合成能力)重组菌(胶原蛋白生产菌)基因工程菌的构建反馈补料压力脉冲饥饿胁迫定向调控高密度发酵离心除杂除杂蛋白除内毒素类人胶原蛋白蛋白质分离纯化类人胶原蛋白的来源和制备类人胶原蛋白的基本生物学功能通过基因重组和生物工程技术得到的，一种水溶性高分子生物胶原蛋白在结构、特性方面与人类胶原蛋白极为相似，命名它为类人胶原蛋白具备胶原蛋白基本生物学功能：生物相容性生物吸收性细胞粘附性促新细胞形成ECM示意图类人胶胶原蛋蛋白的创新新性无细胞毒性基因工程单细胞蛋白从根本上杜绝隐患保证医学应用安全低排异反应无病毒隐患来源于人类基因结构最大程度相似修饰过程去除端肽溶于水没有酸碱溶剂残留避免影响细胞代谢类人胶胶原蛋蛋白的创新新性单螺旋线性结构pH值6.5-7.5保持皮肤酸碱平衡维持细胞粘附性变性温度高酸碱度中性变性温度72℃动物胶原37℃-40℃易于储运保存使用分子量90kD利于皮肤渗透利用均质结构稳定性强类人胶胶原蛋蛋白的安全全性评评价实实验安全全身毒性实验细胞毒性实验皮肤刺激实验眼部刺激实验皮肤过敏实验亚慢性毒性实验遗传毒性实验皮下植入实验由“中中国食食品药药品检检定研研究院院”完完成的生物学学评价价试验验植入实实验评评价:小鼠、、家兔兔皮下下植入入，90天无不不良反反应类人胶胶原蛋蛋白透皮与与吸收收实验验小白鼠鼠背部部去毛毛清洁洁后，，涂抹抹荧光光染料料(tritc)标记过过的明明胶和和类人胶胶原蛋蛋白溶液；；于4h，8h分别在在涂抹抹试样样区域域取1cm×2cm大小的的皮肤肤，进进行冰冰冻切切片，，采用用荧光光显微微镜观观察；；结果表表明：：类人人胶原原蛋白白具有有较强强的透透皮吸吸收行行为，，而明明胶的的透皮皮吸收收较差差。[14][14]TheTransdermalAbsorptionStudyofHuman-LikeCollagen.AdvancedMaterialsResearch,415-417:1781-1985明胶涂抹8h后明胶涂抹4h后类人涂抹8h后类人涂抹4h后皮下真皮表皮皮下真皮表皮类人胶胶原蛋蛋白促细胞胞生长长实验验[15]程宁,范代娣

类人胶原蛋白对BHK-21细胞生长的影响，西北大学学报(自然科学版)，35(5):581-584,20050.1%类人胶原蛋白可促进成纤维细胞和上皮细胞的生长，其作用明显优于0.1%的维生素C和0.1%的明胶，其促进细胞生长的速度，是对照组的1.4-1.6倍。类人胶胶原蛋蛋白促细胞胞生长长实验验[15]程宁,范代娣娣类人胶胶原蛋蛋白对对BHK-21细胞生生长的的影响响，西西北大大学学学报(自然科科学版版)，35(5):581-584,2005结果显示：应用类人胶原蛋白溶液培养细胞，细胞数量有大幅度增加，细胞形态正常、透亮饱满。类人胶胶原蛋蛋白细胞亲亲和性性实验验结果显显示：：14天时成成纤维维细胞胞大量量贴附附在类类人胶胶原蛋蛋白海海绵表表面，，且生生长良良好。。反映映了类类人胶胶原蛋蛋白具具有良良好的的细胞胞亲和和性和和相容容性。。类人胶胶原蛋蛋白海海绵表表面2BS培养14天后扫扫描电电镜观观察[15]程宁,范代娣娣类人胶胶原蛋蛋白对对BHK-21细胞生生长的的影响响，西西北大大学学学报(自然科科学版版)，35(5):581-584,2005类人胶胶原蛋蛋白组织相相容性性实验验试验方方法：：将类人胶胶原蛋蛋白海海绵、动物物胶原原蛋白白海绵绵和可可吸收收明胶胶海绵绵分别别植入入兔子子肝脏脏，4周后开开腹观观察植植入处处的肝肝组织织。[16]类人胶胶原蛋蛋白生生物相相容性性实验验研究究《西北大大学学学报（（自然然科学学版））》2004年2月第32卷第1期作作者：：西北北大学学范范代娣娣，米米钰，，惠俊俊峰等等类人胶原蛋白细胞核形态正常明胶海绵细胞核皱缩动物胶原海绵细胞核皱缩变形类人胶胶原蛋蛋白组织相相容性性实验验结果表表明：：明胶海海绵和和动物物胶原原蛋白白海绵绵植入处处造成成细胞胞形态态和数数量改改变，，组织织肿胀，，大量量炎性细胞胞浸润润类人胶胶原蛋蛋白海海绵对植入入处肝肝细胞胞形态态几乎乎不造造成影影响，，细胞胞器的的形态态较好好；组组织相相容性性好，，优于于供试试的其其他产产品类人胶原蛋白植入处组织形态正常少量炎性细胞浸润明胶海绵植入处大量炎性细胞浸润组织增生，细胞肿胀动物胶原海绵植入处大量炎性细胞浸润组织增生，细胞肿胀[16]类人胶胶原蛋蛋白生生物相相容性性实验验研究究《西北大大学学学报（（自然然科学学版））》2004年2月第32卷第1期作作者：：西北北大学学范范代娣娣，米米钰，，惠俊俊峰等等皮肤美美容止血材材料骨修复复材料料人工血血管皮下注注射填填充类人胶胶原蛋蛋白的的应用用类人胶胶原蛋蛋白在皮肤肤美容容领域的应用皮肤美容:眼膜、面膜膜、喷雾、、原液等系系列；用于于衰老性肌肌肤紧致抗抗衰；日常常的肌肤养养护；皮炎炎、痤疮、、敏感肌肤肤等问题肌肌肤的修护护。生产环境为万级条件下的局部百级，等同于手术室的洁净要求亲和层析+凝胶过滤层析+超滤

的纯化工艺，可满足体内植入的要求所采用的为注射用水，无菌、无内毒素真正不含防防腐剂类人胶原蛋蛋白在皮肤美容容领域的应用类人胶原蛋蛋白在医学领域的应用研究究可降解止血海绵:主要用于腔腔内、颅内内的外科手手术止血可吸收明胶海绵动物胶原蛋白海绵进口可吸收纱布类人胶原蛋白止血海绵可降解止血海绵:主要用于腔腔内、颅内内的外科手手术止血马茂，范代娣

壳聚糖-类人胶原蛋白对兔肝创面的止血效果及组织相容性观察，第四军医大学学报，2007，28(12):1122-1124专利成果：一种可生物物降解止血血海绵材料料及其制备备方法。专专利号：ZL200610041913.3一种规模制制备类人胶胶原蛋白止止血海绵的的方法。申申请号：200910218514.3类人胶原蛋蛋白在医学领域的应用研究究骨修复材料料:仿生矿化，，制备骨修修复材料，，用于骨缺缺损的修复复类人胶原蛋蛋白在医学领域的应用研究究类人胶原蛋蛋白在医学领域的应用研究究人工血管：模拟人体血血管结构，，仿生制备备，用于血血管修复类人胶原蛋蛋白在医学领域的应用研究究注射填充水凝胶应用领域采用皮下注注射或填充充，可用于于去皱、丰丰唇、面部部矫形、凹凹陷填充等等。产品特点生物相容性性优异；降解时间可可控；产品可促进进注射部位位细胞活性性和胶原蛋蛋白纤维的的再生研发团队研发成果产业化之路路类人胶原蛋蛋白的科研研和产业化化类人胶原蛋白的研发团队队范代娣：新世纪“百百千万人才才工程”国国家人选获“中国青青年女科学学家”提名名享受“国务务院特殊津津贴”博士生导师师研发团队：：博士研究生生20余人硕士研究生生50余人类人胶原蛋蛋白的专业水准准XiaoxuanMa,DaidiFan,Long-anShang,QiangCai,LeiChi,ChenhuiZhu,YuMi,Yan-eLuo.Oxygentransferratecontrolintheproductionofhuman-likecollagenbyrecombinantEscherichiacoil.BiotechnologyandBiochemistry.2010,55,4：169-174(SCI)WenjiaoXue,DaidiFan,LonganShang.Effectsofaceticacidanditsassimilationinfed-batchculturesofrecombinantEscherichiacolicontaininghuman-likecollagencDNA.JournalofBioscienceandBioengineering.2010.109（3）：257-261(SCI)Xiao-JunWang,Dai-DiFan,Yan-ELuo.BreakthroughModelofRecombinantHuman-LikecollageninImmobilizedMetalAffinityChromatography.AppliedBiochemistryandBiotechnology,2009,158(2),262-276.(SCI)WenJXue,DaiDFan,LonganShang,ChenHZhu,XiaoXMa,YuanYYu.Productionofbiomassandrecombinanthuman-likecollageninEscherichiacoliprocesseswithdifferentCO2pulses.BiotechnologyLetters.2009,31:221-226.(SCI)DaiD.Fan，L.-H.Wang，L.-A.Shangetal.AMicrocalorimetricMethodforStudyingtheBiologicalEffectsofMg2+IononRecombinantEscherichiacoli.ChemicalBiochemicalEngineering,2008,22(3):363-368.(SCI)DAIDFAN,LIHWANG,LONGASHANG,HUIJSHI,XIAOXMA,YUMI,LIFGU,KANGZXU.AmicrocalorimetricmethodtostudytheeffectofkanamycinonthemetabolismofrecombinantEscherichiacoliChemicalEngineeringCommunications,2007，194:1127-1137.(SCI)YanELuo,DaiDFan,LongAShang,HuiJShi,XiaoXMa,YuMi,GuiFZhao.AnalysisofmetabolicfluxinEscherichiacoliexpressinghuman-likecollageninfed-batchculture,Biotechnologyletters,30(4):637-643,2008.(SCI,EI)DaiDFan,YaneLuo,YuMi,XiaoXMa,LonganShang.Characteristicsoffed-batchculturesofrecombinantEscherichiacolicontaininghuman-likecollagencDNAatdifferentspecificgrowthrates.BiotechnologyLetters,2005,27:865–870.(SCI,EI)LUOYane,FANDaidi,MAXiaoxuan,WANGDewei,MIYu,HUAXiufuandLIWenhong.ProcessControlforProductionofHuman-likeCollageninFed-batchCultureofEscherichiacoliBL21.ChineseJ.Chem.Eng.,2005,13(2):276-279.(SCI,EI)HUAXiufu,FANDaidi,LUOYane,HANGXI,SHIHuijuan,MIYu,MAXiaoxuan,SHANGLong'an,ZHAOGuifang.KineticsofHighCellDensityFed-batchCultureofRecombinantEscherichiacoliProducingHuman-likeCollagen.ChineseJ.Chem.Eng.,2006,14(2):242-247.(SCI,EI)……60余篇SCI文献报道类人胶原蛋蛋白的专业水准准国家自然科科学基金：：工程控制制策略有效效解除大肠肠杆菌培养养过程中乙乙酸抑制机机理探索（（21076169）国家自然科科学基金：：周期性饥饥饿协迫对对重组大肠肠杆菌高密密度培养的的影响（31000019）国家自然科科学基金：：重组类人人胶原蛋白白大肠杆菌菌表达体系系高密度发发酵的代谢谢调控及动动力学（20606026）国家自然科科学基金：：重组E.coli类人胶原蛋蛋白表达体体系多聚体体现象研究究(20476085)国家高技术术产业化示示范工程发发展计划：：基因工程程技术生产产类人胶原原蛋白生物物材料高技技术产业化化示范工程程[发改高计(2004)2563]国家科技部部863计划：重组组类人胶原原蛋白Ⅱ可降解材料料制造关键键技术及应应用(2006AA02Z246)国家科技部部创新基金金：重组基基因工程菌菌生产类胶胶原蛋白(01C26216110599)国家火炬计计划：类人人胶原蛋白白(2002EB021307）利用重组类类人胶原矿矿化仿生制制备骨修复复材料及应应用(2007AA03Z456)类人胶原蛋蛋白人工血血管体外构构建过程的的工程学（（20776119）新型有机无无机杂化纳纳米生物功功能材料复复合制备及及控制机理理（21006079）……13项国家级科研项目类人胶原蛋蛋白的专业水准准一种类人胶胶原蛋白及及其生产方方法。专利利号：ZL01106757.8胶原蛋白敷