分子系统学与分子鉴定

关于分子系统学与分子鉴定第一页，共六十七页，2022年，8月28日内容什么是分子系统学什么是系统发育树建树方法如何建树第二页，共六十七页，2022年，8月28日分类学与系统学分类学通常被分为分类学(taxonomy)和分类学(taxonomy)等不同阶段。分类学:对于多样性的生物进行分类、描述，按照各类群生物的国际统一命名法规进行不同等级和类群的命名

分类学:通常也被称之为系统学，即将生物的分类群或分类单位按照生物演化顺序排列成一定的系统系统学是研究各等级、各类群之间的演化关系，按照生物演化顺序将它们排列成一定的“系统”(英文system，拉丁文systema)。第三页，共六十七页，2022年，8月28日系统发育树AtreeisamathematicalstructurewhichrepresentsamodelofanactualevolutionaryhistoryofagroupofsequencesororganismsInotherwords,itisanevolutionaryhypothesis第四页，共六十七页，2022年，8月28日Phylogenetictrees第五页，共六十七页，2022年，8月28日TopologyofATreeAtreeconsistsofnodesconnectedbybranchesOneuniqueinternalnodeistherootofthetree:theancestorofallthesequencesInternalnodesrepresenthypotheticalancestorsTerminalnodesrepresentsequencesororganismsforwhichwehavedata.Eachistypicallycalleda“OperationalTaxonomicalUnit”orOTU.第六页，共六十七页，2022年，8月28日RelatedTermsTheingroupisthegroupactuallystudiedbytheinvestigator.Thatis,itisthegroupofinterest.第七页，共六十七页，2022年，8月28日Asistergroupisthetaxonthatisgenealogicallymostcloselyrelatedtotheingroup.Theancestorofthegroupcannotbeitssisterbecausetheancestorisamemberofthegroup.RelatedTerms第八页，共六十七页，2022年，8月28日Anoutgroupisanygroupusedinananalysisthatisnotincludedinthetaxonunderstudy.Itisusedforcomparativepurposes,usuallyinargumentsconcerningtherelativepolarityofapair(orseries)ofhomologouscharacters.Themostimportantoutgroupisthesistergroup,andconsiderablephylogeneticresearchmaybeneededtofindthesistergroup.Usuallymorethanoneoutgroupisneededinananalysis.RelatedTerms第九页，共六十七页，2022年，8月28日RelatedTerms第十页，共六十七页，2022年，8月28日目前用蛋白质和核酸序列进行系统发育关系分析的方法有：距离法（DistanceMethods）其中邻接法（NeighborJoining,NJ）最受欢迎最大简约法（MaximumParsimony,MP）最大似然法（MaximumLikelihood,ML）Bayesian法MethodsforConstructingPhylogenies第十一页，共六十七页，2022年，8月28日用最大简约原则（MaximumParsimony,MP）来推断最好的系统树理论依据：解释一个过程的最好假说应是假设条件最少的假说。因此，对于分子数据（DNA序列数据），该方法计算在最少的碱基替换条件下能够解释整个进化过程的拓扑结构（系统进化树）。简约原则在逻辑上的要求是在多种解释中选取最简单的。在分析系统发育关系时，最简约的树是对数据集进化途径最短的解释（即从祖先分类单元到现生单元性状变化的数目最少）MethodsforConstructingPhylogenies第十二页，共六十七页，2022年，8月28日Thestepsinvolvedincreatingaphylogenetictreefrommoleculardataare:IdentifyaproteinorDNAsequenceofinterestIdentifyothersequencesthatarerelatedtothesequenceofinterestandobtainelectronicfilesofthosesequencesAlignthesequencesUsingtheresultsofalignment,generateaphylogenetictreePrint(andperhapspublish)theresultsHowtoCreateaTree?第十三页，共六十七页，2022年，8月28日

获取相关基因序列数据DownloadfromGenBankSequencedbyinvestigator第十四页，共六十七页，2022年，8月28日输入/网址

Eurytomidae28SribosomalRNAgene

第十五页，共六十七页，2022年，8月28日第十六页，共六十七页，2022年，8月28日第十七页，共六十七页，2022年，8月28日第十八页，共六十七页，2022年，8月28日自行扩增后获得的新序列从研究的样本直接提取DNA，扩增测序，得到序列文件用Sequencher（版本3.1.1）、SeqScape或BioEdit软件对测得的序列进行校对和编辑，确保序列的准确性保存成FASTA或纯文本格式。获取相关基因序列数据第十九页，共六十七页，2022年，8月28日创建输入文件

由GenBank下载的序列创建运行MacClade软件，在“File”菜单中选择“NewFile”命令在“Taxa”下拉菜单“ImprotSequences”选择子菜单“FASTAFile…”打开下载的序列文件batchseq.cgi将输入的矩阵保存成NBRF格式（File下拉菜单中的子菜单“ExportFile”中的“NBRF…”选项）第二十页，共六十七页，2022年，8月28日创建输入文件由自行扩增的序列创建运行MacClade软件，在“Taxa”下拉菜单“ImportSequences”选择“FilewithOnlySequence…”命令；然后逐条地输入目的序列；将输入的矩阵保存成NBRF格式（File下拉菜单中的子菜单“ExportFile”中的“NBRF…”选项）。第二十一页，共六十七页，2022年，8月28日创建输入文件第二十二页，共六十七页，2022年，8月28日Positionalhomolog(点同源)序列数据首先必需进行比对,以便能够对同源位点（比较的单位）进行比较和分析目前应用得最多的关于序列排序的软件是ClustalX1.81

序列的比对（Alignment）第二十三页，共六十七页，2022年，8月28日利用ClustalX软件进行序列比对

用ClustalX软件打开以上保存的NBRF格式的文件，进行多序列的比对（Multiplealignment）。在“Alignment”菜单的下拉菜单“AlingmentParameters”中选择“MultipleAlignmentParameter”进行多序列比对的参数设置。参数设置是GapOpening=10，GapExtension=0.2第二十四页，共六十七页，2022年，8月28日利用ClustalX软件进行序列比对第二十五页，共六十七页，2022年，8月28日在“Alignment”下拉菜单“OutputFormatOptions”中选中“NEXUSformat”选项；然后做“DoCompleteAlignment”比对后，用MacClade4.0软件打开排序后产生的“.nxs”文件。手工校对排序的结果，并删除那些难以比对的高变区（hypervariableregions）Swofford等(1996)认为排除这些区域，可以提高系统发育关系结果的可靠性。利用ClustalX软件进行序列比对第二十六页，共六十七页，2022年，8月28日系统发育关系分析调用目的文件：运行PAUP软件；在“File”下拉菜单中选择“Open”命令，找到从ClustalX排序后产生的“.nxs”文件；点击“Execute”命令排除非信息位点：选中“Data”下拉菜单中的“Include-ExcludeCharacters”选项，排除“uninf”位点选择分析原则及搜索最佳树的参数设置：在“Analysis”菜单中选中“Parsimony”；然后进行“Heuristic”搜索；其参数设置是：GeneralSearchOptions=BesttreesonlyStartingtreesforbranch-swapping=GetbystepwiseStepwise-AdditonOptions=random,#reps=1000Swappingalgorithm=TBR第二十七页，共六十七页，2022年，8月28日系统发育关系分析

第二十八页，共六十七页，2022年，8月28日合意树：在“Trees”菜单中，点击“ComputeConsensus…”，选中“Strict”，点击“OK”，获取严格的合意树。系统发育关系分析

第二十九页，共六十七页，2022年，8月28日第三十页，共六十七页，2022年，8月28日

系统发育关系分析赋根：在“Options”的下拉菜单中选中“Rooting”，为树赋根；有两种方案，①是Outgrouprooting；②是Midpointrooting第三十一页，共六十七页，2022年，8月28日系统发育关系分析输出树：在“Trees”下拉菜单中选择“Printtrees…”以打印树。参数设置如下：Plottype=RectangularCladogramLinewidth=1.5Font=HelveticaSize=14Styles=Bold&Italic。第三十二页，共六十七页，2022年，8月28日评价结果的可靠性

在得到树（或树集）后，必需做的是评价结果的可靠性。主要有Bootstrapping方法。Bootstrapping（Felsenstein，1985）用于评价系统树各节点的支持率，通常支持率在90％以上是最可信的。在测试中共重复1000次。第三十三页，共六十七页，2022年，8月28日选中Bootstrap；Numberofreplicates=1000Typeofsearch=FullheuristicConsensustreeoptions=Retaingroupswithfrequency>50%评价结果的可靠性

第三十四页，共六十七页，2022年，8月28日评价结果的可靠性点击Continue；在HeuristicSearch的Stepwise-AdditionOptions中的random的#reps的值改为1000；点击Search运算结束后，点击Trees下拉菜单中的PrintBootstrapConsensus以打印结果第三十五页，共六十七页，2022年，8月28日ParsimonyTreebasedonITSsequenceT.songshanenseT.songshanenseT.taiyuanenseT.songshanense第三十六页，共六十七页，2022年，8月28日Softwares

第三十七页，共六十七页，2022年，8月28日红火蚁（Solenopsisinvicta）

分子检测技术研究

中国检验检疫科学研究院第三十八页，共六十七页，2022年，8月28日研究背景研究目的材料和方法结果分析与讨论第三十九页，共六十七页，2022年，8月28日研究背景分类地位膜翅目（Hymenoptera）蚁科（Formicidae）家蚁亚科（Myrmicinae）火蚁属（Solenopsis）

第四十页，共六十七页，2022年，8月28日研究背景分布国外：巴西、阿根廷、安提瓜和巴布达、特立尼和多巴哥、波多黎各、巴哈马群岛、特克斯和凯科斯群岛、英属维尔京群岛、美属维京群岛、美国、澳大利亚、新西兰、马来西亚国内：中国台湾省、香港、澳门和广东省吴川等第四十一页，共六十七页，2022年，8月28日预测分布图第四十二页，共六十七页，2022年，8月28日中国预测分布图第四十三页，共六十七页，2022年，8月28日研究背景形态方面单家蚁属（Monomorium）、大头家蚁属（Pheidole）、拟大头家蚁属（Pheidologeton）、热带火蚁（Solenopsisinvicta）黑火蚁S.richteri相似。尤其是幼虫和卵更难区分。分子方面红火蚁Solenopsisinvicta，黑火蚁S.richteri，热带火蚁S.geminata和

S.quinquecuspis四个种

第四十四页，共六十七页，2022年，8月28日研究背景危害经济危害农作物，电力设备等社会人类健康生态环境降低生物多样性第四十五页，共六十七页，2022年，8月28日研究目的红火蚁的分子检测技术研究筛选引物与探针，建立红火蚁不同虫态卵、幼虫、成虫快速、准确的实时荧光PCR分子检测体系，为口岸快速查验和大通关提供有力的技术支持。

第四十六页，共六十七页，2022年，8月28日材料与方法确定红火蚁主要分布的地区及要采样的地点；获取红火蚁不同地理种群标本；筛选并优化红火蚁分子检测探针。第四十七页，共六十七页，2022年，8月28日技术路线第四十八页，共六十七页，2022年，8月28日国内标本收集标本国外标本序列比对基因测序DNA提取扩增构建红火蚁分子检测技术体系筛选分子检测引物与探针GenBank第四十九页，共六十七页，2022年，8月28日材料与方法样品总共选取红火蚁5个种群和热带火蚁1个种群为研究对象。只选取采自同一地点，至少有两个个体(卵、幼虫、成虫)的同种标本提取基因组DNA。其中一头标本用于分子生物学实验，其余的作为形态鉴定参考(voucherspecies)。第五十页，共六十七页，2022年，8月28日标本号种类采集地1Solenopsisinvicta深圳公明广记花场2Solenopsisinvicta深圳光明农场3Solenopsisinvicta珠海斗门白蕉镇4Solenopsisinvicta珠海回归公园5Solenopsisgeminata广西北海6Solenopsisinvicta广东吴川第五十一页，共六十七页，2022年，8月28日材料与方法提取基因组DNA采用Wizard方法（Promega）提取基因组DNA，可成功提取卵、幼虫、成虫单个个体的基因组DNA。标本最初保存在浓度为100％的酒精中；随后转至70％的酒精中长期保存。第五十二页，共六十七页，2022年，8月28日材料与方法设计引物与探针GenBank发表火蚁属（Solenopsis）的COI基因序列有102条，分别属于Solenopsisinvicta,S.richteri，S.geminata和S.quinquecuspis四种，标本来源分别为阿根廷、巴西和美国。用ClustalX软件对COI基因序列进行比对后，分析保守区与高变区，针对红火蚁的特异序列，手工设计了引物与探针。第五十三页，共六十七页，2022年，8月28日材料与方法序列的比对（alignment）与分析比对（ClustalX,Thompsonetal.,1997)Neighbor-JoiningTreeThinking第五十四页，共六十七页