微生物酶活性试验方法

微生物酶活性试验方法微生物酶活性试验方法微生物酶活性试验方法V:1.0精细整理，仅供参考微生物酶活性试验方法日期：20xx年X月微生物酶活性试验方法脱氢酶活性测定方法参考：【周春生,尹军.一脱氢酶活性检测方法的研究[J].环境科学学报,1996,4:400-405.】以及【环境工程微生物检验手册[M].中国环境科学出版社,1990.】（一）试验方法：（1）水样预处理：取污泥混合液10ml，放入离心管中离心5min后去除上清液，用纯水反复清洗三次，最后向样品中加入纯水至10ml搅拌均匀。（2）加试剂：将处理后样品转移至25ml比色管中，依次加入7.5mlTris-HCl缓冲液（PH=8.4）、2.5ml硫酸钠溶液（0.36%）、2.5ml纯水以及2.5mlTTC溶液（0.4%）、混匀。（3）样品培养：将比色管置于37℃条件下水浴恒温振荡器中培养，培养5min后吸取5ml于离心管内，加0.5ml甲醛固定以作样品空白；（4）终止酶反应：继续培养30min，然后向管中加入2ml甲醛终止酶反应；（5）样品萃取：将样品培养液以5.5ml为1份分装在四个离心管中，连同样品空白对照管一道离心5min,弃去上清液向各离心管内加6ml丙酮,研磨搅拌混合,于37℃条件下萃取TF10min后；（6）比色分析：将萃取液进行离心5min,用1cm的比色皿取上清液显色液,于波长485nm处进行比色,记录吸光值,根据样品显色液与样品空白的吸光值之差,查标准曲线,进而计算出TF的生成速度,即脱氢酶活性(mg/(L*h))（二）试剂：（1）0.4％三苯基四氮唑氯化物溶液（氯化三苯基四氮唑，TTC）:4g-2、3、5-氯化三苯基四氮唑，稀释至1L至容量瓶中，棕色瓶保存；（2）Tris-HCl缓冲液：称取6.057gTris（三羟甲基氨基甲烷,分析纯,北京化学试剂厂），加入20ml1mol/LHCl溶液,再定容至1L；（3）硫酸钠溶液（0.36%）：3.6g硫酸钠（Na2SO3）稀释至1L容量瓶中；（4）TTC标准溶液：称取0.05gTTC定容与50ml茶色容量瓶中此溶液即为1mg/L的标准溶液。（三）标准曲线的绘制：（1）采用1mg/L的TTC标准溶液制备每含20、40、60、80、100、120、140µgTTC系列溶液，即取1、2、3、4、5、6、7ml至50ml容量瓶中，稀释至50ml进行实验；（2）用8试管，分别加入2mlTris-HCl缓冲液、2ml纯水、2ml不同浓度的TTC，第八只不加入TTC；（3）加入10g硫酸钠溶液，TTC被还原为红色的TF；（4）加入5ml丙酮振荡摇匀提取TF（振荡床振荡10次）；（5）离心5min后485nm下测吸光度；（6）吸光度为纵坐标，TTC浓度为横坐标绘制标准曲线。（四）计算：TF=A*B*CA：标准曲线上读数；B：计算时间矫正值：培养时间/60min；C分光时的稀释倍数，当分光>0,8时，稀释分光ATP含量测定方法参考：【环境工程微生物检验手册[M].中国环境科学出版社,1990.】ATP消化后变为无机磷，制备ATP消化液，测无机磷吸光度以确定ATP含量（一）试验方法：（1）活性污泥稀释1:20，曝气池稀释1:10（保证ATP量在0.1-1.0mg/L之间）；（2）用50ml烧杯加入35ml的（pH=7.750.025MTris缓冲液）加热至沸腾；然后加入待测活性污泥溶液1ml，煮沸加热30-60s后摇动几分钟放入冰浴中，冷却后加入pH7.750.025M的Tris缓冲液至50ml，摇匀过滤，所得过滤液供测ATP；（3）ATP制备液消化：去待测液1ml于比色管中，加入2.5ml10N硫酸，至于高压锅中加压128℃,15min，冷却后加入1-2滴过氧化氢，摇匀，纯水稀释，制成消化液；（4）取两支试管，加入消化液3ml，摇匀，另一只加入纯水3ml，各加入定磷试剂3ml，至于45℃水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；（5）用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，利用无机磷含量查Pi-ATP相关曲线，得出ATP值；ATP含量高的污泥，微生物活性越高。（二）试剂：（1）无机磷溶液中间液：烘干后称取0.2195gKH2PO4稀释至500ml容量品；（2）无机磷溶液使用液：上述溶液取10ml稀释至100ml；（3）定磷试剂：6mol/L硫酸：水：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸（体积比）=1：2:1:1，配置时按上述顺序加入试剂。溶液配制后当天使用，正常为浅黄绿色，若颜色不正常，则不能使用6mol/L硫酸：取17ml浓硫酸加入83ml水中，得6mol/L；2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵→100ml容量瓶；10%抗坏血酸：取10g抗坏血酸→100ml容量瓶（棕色瓶冷藏）。（4）ATP：10mgATP（5）pH7.750.025M的Tris缓冲液：3.02785g稀释至500ml+35ml1mol/L盐酸→1000ml容量瓶（6）10N硫酸：271.7ml浓硫酸加入700ml纯水中，冷却后，稀释至1000ml容量瓶中；（三）标准曲线的绘制：1、无机磷标准曲线的绘制（1）取KH2PO4置于烘箱中恒重后称取0.2195g，稀释至500ml容量瓶中，得无机磷浓度100ug/L；（2）取10ml上述溶液稀释至100ml容量瓶中定容，得无机磷浓度10ug/L，取6之试管；试管无机磷纯水无机磷浓度加定磷试剂1030320.22.82330.42.64340.62.46350.82.28361.02.0103（3）将试管置于45℃中水浴，保温25min，冷却后660nm下比色；（4）以吸光度作为纵坐标，无机磷含量为横坐标，绘制标准曲线；2、ATP-无机磷曲线绘制；（1）称取10mgATP，取少量新配的pH7.750.025M的Tris缓冲液，充分摇匀溶解，定容至1L,最终浓度为10mg/L；取上清液，配置从1.00-0.01mg/L系列标准液；（2）ATP标准液的消化：去待测液1ml于比色管中，加入2.5ml10N硫酸，至于高压锅中加压128℃,15min，冷却后加入1-2滴过氧化氢，摇匀，纯水稀释，制成消化液；（3）取两支试管，加入消化液3ml，摇匀，另一只加入纯水3ml，各加入定磷试剂3ml，至于45℃水浴加热25min，冷却至室温，660nm下分光；（4）以吸光度为纵坐标，ATP浓度为横坐标，绘制曲线；（5）用上述曲线的吸光度在无机磷标准曲线上查出相应的无机磷含量，然后作为纵坐标，ATP为横坐标，绘制Pi-ATP相关曲线。脲酶活性测定方法参考：【李振高,骆永明,滕应.土壤与环境微生物研究法[M].科学出版社,2008.】根据脲酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。（一）试验方法：（1）水样预处理：取10ml待测样品经甲苯处理后，加5~10滴甲苯，盖好；（2）加试剂：15min后加10ml10%尿素和20mlpH=6.7柠檬酸盐缓冲液（3）样品培养：将锥形瓶置于37℃条件下恒温箱，培养24h过滤；（4）继续加试剂：取滤液1-3mg/L（视样品浓度定）与50ml比色管中，加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀；（5）比色分析：20min后定容，并在578nm波长下分光；（6）计算：并在标准曲线上求氨氮的量，测出脲酶活性。每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差。还需减去无土基质（尿素＋柠檬酸盐）。

（二）试剂：（1）甲苯（分析纯）；（2）10%尿素：尿素（分析纯）10克溶于100毫升蒸馏水中，（现配现用）；（3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸（分析纯）溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至6.7，并用水稀释至2L；（4）苯酚钠溶液：A液：62.5苯酚溶于少量95%乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升。B液.27克氢氧化钠溶于100毫升水中。将二溶液保存在冰箱里。使用前，将溶液A、B各吸取20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升；（5）次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%。（次氯酸钠活性氯浓度为5.2%）。（6）标准溶液：称0.4717克硫酸铵（105℃烘干）溶于水，稀释至1升（三）标准曲线的绘制：（1）将100ppm的标准溶液稀释为10ppm，分别吸取0.5ml、1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.5ml、5.5ml、6.5ml、7.5ml于50毫升容量瓶或刻度试管中，加蒸馏水至20ml；（2）再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀，20min后显色，定容，使溶液浓度为：0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。（3）1h内在分光光度计上与波长578nm处比色，绘制标准曲线。（四）计算：脲酶活性以24h内每克土中氨态氮的毫克数来表示。NH3-N（mg/1g土24h）=（土样浓度×稀释倍数×比色体积）÷（1000×干土重）1000：1000为ug换算成mg土样浓度：标准曲线查得浓度硝酸还原酶活性测定方法参考：【李振高,骆永明,滕应.土壤与环境微生物研究法[M].科学出版社,2008.】原理：在厌氧条件下，通过样品与酚二磺酸的显色反应计算出反应前后硝态氮的含量差值，从而计算出硝酸还原酶的活性。（一）试验方法：取10ml待测样品与50ml三角瓶中，加入葡萄糖，硝酸钾溶液，在真空下培养24h后，利用酚二磺酸分光光度计测定反应前后硝酸盐的含量差值，最后计算出硝酸还原酶活性（二）试剂：亚硝酸还原酶活性测定方法参考：【李振高,骆永明,滕应.土壤与环境微生物研究法[M].科学出版社,2008.】原理：通过亚硝态氮与格里试剂反应所产生的颜色深度，测定酶促反应前后亚硝态氮的变化，从而得出亚硝酸还原酶的活性。（一）试验方法：取50ml待测样品与50ml三角瓶中，加入葡萄糖，亚硝酸钠溶液，在真空下培养24h后，加入格里试剂显色，最后再波长550nm处测定反应前后的样品吸光度值，其差值可表示亚硝酸还原酶活性硝化速率的测定方法硝化强度的试验方法（一）试验方法：（1）150ml三角瓶中盛30ml硝酸细菌培养基，灭菌；（2）培养：冷却，接种1ml活性污泥溶液，于28℃培养15天，取出过滤。滤液装于塑料瓶中，低温保存（4度以下，最好马上测下步）。用比色法测定虑液中的亚硝酸含量。（3）加试剂：取滤液1ml（取决于虑液中亚硝酸量）于50ml容量瓶中，定容。再取1ml定溶液于50ml比色管中，稀释至约40ml，加入1ml对氨基本磺酸试剂，放置10分钟，然后加入1mlα－萘胺试剂、1ml20％醋酸钠，定容，呈色10分钟后，用分光光度计（波长520nm）比色测定。（潮土亚硝酸含量较少，可在第一步就就加显色剂，定容测定。）（4）标准曲线的绘制：同时吸取亚硝酸根溶液（每毫升含NO-20.01毫克）0.5、1、2、3、4、5ml，分别放入50ml比色管中，即得0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg亚硝酸根，与待测标本同样条件进行比色，根据标准系列得透光度绘制标准曲线，查出待测标本中亚硝酸根毫克数。（5）与此同时，用同一方法测定原始培养液中亚硝酸根含量（二）试剂：（1）硝酸细菌培养基：NaNO21.0克MgSO4·7H2O0.03克K2HPO40.75克MnSO4·4H2O0.01克NaH2PO40.25克蒸馏水1000毫升Na2CO31.0克（2）格利斯氏试剂：（a）对氨基苯磺酸试剂：溶解0.6g对氨基苯磺酸于70ml沸蒸馏水中，冷却后加入20ml浓盐酸，然后稀释成100ml，贮于棕色瓶中，保存于冷处备用。（b）α－萘胺试剂：溶解0.6gα－萘胺于含1ml浓盐酸的蒸馏水中，然后稀释至100ml，贮于棕色瓶中，保存于冷处备用。（3）20％醋酸钠（三）标准曲线的绘制：亚硝酸根标准溶液：称取1.500g分析纯亚硝酸钠于烧