荧光显微镜的基本原理及应用

高分辨率荧光显微镜的基本原理和操作要求第一页，共二十页。第二页，共二十页。一、荧光显微镜(fluorescencemicroscope)

原理：

某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其从激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光部就是荧光(fluorescence)。所谓荧光就是某些物质在一定波长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。第三页，共二十页。第四页，共二十页。第五页，共二十页。二、荧光显微镜的组成1、光源：一般采用高压汞灯2、滤色系统：由激发滤板和压制滤板组成a、激发滤板：提供一定范围的激发光b、压制滤板：完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围荧光3、反光镜：一般采用平面反光镜4、聚光镜：用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成5、物镜和目镜第六页，共二十页。Theopticalsystemofafluorescencemicroscope.Afiltersetconsistsoftwobarrierfilters(1and3)andadichroicmirror(beam-splitting2)第七页，共二十页。第八页，共二十页。三、荧光显微镜的操作

(1)安装紫外防护罩。

(2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。

(3)插入挡光板，中断光路。

(4)预热5—10分钟。

(5)将载有样品的载玻片放到载物台上。

(6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。第九页，共二十页。

(7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要的分光镜组件：“O”为观察透射光时用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如FITC)；“WG"为观察红色荧光时用(如TRITC)。

(8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜)。

(9)通过粗、细螺旋调整焦距。

(10)打开与显微镜连接的计算机，点击数码成像系统软件，采集数码图像。第十页，共二十页。四、荧光显微镜标本制作要求（一）载玻片载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。（二）盖玻片盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光女可激发标本。第十一页，共二十页。（三）标本

组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。（四）封裱剂封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。（五）镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。第十二页，共二十页。五、荧光染料的使用1、吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。2、溴化乙锭（EB）:染色DNA和RNA。3、荧光素双醋酸酯(FDA)：FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。4、荧光染料Ho33342和罗丹明123:Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，罗丹明123能与线粒体进行特异的结合。第十三页，共二十页。六、荧光组化实验中应注意的几个问题1、每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH值的缓冲液中进行。2、一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。3、在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。4、一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。第十四页，共二十页。七、荧光显微镜应用技术1.对细胞结构或组分的定性位、半定量研究免疫荧光技术

用荧光标记的抗体或抗原与样品(细胞、组织或分离的物质等)中相应的抗原或抗体结合，以适当检测荧光的技术对其进行分析的方法。将抗原或抗体与荧光染料连接，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法称“直接免疫荧光技术(directimmunofluorescenttechnique)”。用荧光染料标记的第二、第三抗体等检测相应抗原抗体复合体的方法则称“间接免疫荧光技术(indirectimmunofluorescenttechnique)”。第十五页，共二十页。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位第十六页，共二十页。1.分子标记

利用绿色荧光的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(proteintagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察第十七页，共二十页。2.药物筛选

荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针第十八页，共二十页。八、使用注意事项1暗室内进行，打开汞灯5-10min稳定后再观察。2荧光淬灭(光漂白)：激发光长时间照射会发生荧光减弱或消失，操作时注意及时用挡板阻挡激发光照射标本。3汞灯关