小柴胡汤的有效中药成分分离及生物活性的研究

小柴胡汤的有效中药成分分离及生物活性的研究

湖

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省

自

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科

学

基

金

申

请

书

名称

小柴胡汤的有效中药成分分

离及生物活性研究。

涉及学科（专业）A名称应用化学B名称中药学C名称动物医学

代码070302

代码10082

代码09061

主要应用行业（仅重点项目填写）1

2

3

起止年月2004年1月

至

2005年12月申请金额5.60

万元

第一承担单位名称华中农业大学

通信地址华中农业大学理学院邮编430070

单位性质A.高等院校

●

B.科研单位

○

C.其它

○

合作单位名称（仅重点项目填写）1

2

总人数高级中级初级博士后博士生硕士生

8413

7

项目负责人姓名郑新生出生年月1958.3专业技术职称教

授学术带头人是○否○

学位博士○硕士●学士○电话87281187E-mail

通信地址华中农业大学理学院化学系邮编430070

其他主要成员情况姓名出生年月专业技术职务工作单位项目中的分工

王大菊1946.01教授华中农业大学动物医学院总体设计；药理、毒理试验。

陈浩1963.10副教授华中农业大学理学院化学系活性组分测定及结构图谱

马敬中1958.04副教授华中农业大学理学院化学系构效关系研究

江洪1968.10讲师华中农业大学理学院化学系先导化合物的化学修饰

马忠华1974.07助教华中农业大学理学院化学系提取工艺研究

宁丽红1975.07助教华中农业大学理学院化学系分离纯化工艺研究

陆冬莲1975.06助教华中农业大学理学院化学系活性组分筛选

研究内容和意义摘

要提取小柴胡

汤的中药成分，去除植物中普

遍存在的蛋白质、果胶、淀粉等，得到该

复方提取物。测定其生物活性和结构指纹

谱图。研究提取物与传统中药复方的药效

关系及它对艾滋病毒的作用。研究其剂效

关系和构效关系。旨在使该传统中药现代

化，并寻找它对爱滋病毒有明显作用的天

然新型生物活性物质。

主题词1．主题词数量不多于三个；2。主题词之间空一格。

小柴胡汤

生物活性物质

抗艾滋病毒

3．研究项目的科学依据（包括科学意义和应用前景，国内外研究慨况、水平和发展趋势，学术思想，立论依据，特色或创新之处，主要参考文献目录和出处，可另附页）

随着人体基因组计划（HumanGenomeProject,HGP）取得突破性进展，HGP的成果使人们想到中医药与基因及基因调控之间的微妙关系，激起了新一轮国际中医药研究热潮[1]。2002年10月国家科技部、计委、卫生部等单位联合提出2002年至2010年中药现代化发展纲要，使中医药研究提升到一个新的水平。

小柴胡汤是张仲景的何解少阳之主方，可医治口苦咽干目眩、往来寒热、胸胁苦满、脉弦等病症。近期于建军[2]等研究发现，该方剂对丙型肝炎患者有明显疗效，稻田赖太郎[3]研究了小柴胡汤提取剂对HIV诱发的免疫功能障碍状态的免疫调节作用，确认了小柴胡汤提取剂对淋巴细胞有免疫调节作用，与低浓度的AZT有相乘的抗HIV活性。

但总体上看，我国中成药的生产工艺落后，技术水平低，在国际市场上缺乏竞争力；中成药缺少与国际接轨的质量标准，已成了中成药进入国际市场的主要障碍；中医药研究不够普遍和深入，国产中成药的知识产权正面临流失。小柴胡汤虽有数百年的临床应用，但没有形成现代中药剂型，缺乏质量检测标准，不仅影响了该药方的进一步开发应用，也影响了它被国际接受和在国际传播；该方剂虽对艾滋病毒有一定作用，但是何种成分起作用，如何改进和提高，均有待进一步的研究。

本项研究采用现代提取分离纯化技术，使小柴胡汤提取物质量可以控制，并建立该提取物的质量检测标准，使之达到国际药品标准要求，这对进一步开发它的应用及进入国际市场，都具有重要的现实意义和广阔的应用前景；研究该提取物对艾滋病毒的作用，筛选出有效成分，分析其构效关系，寻找新型生物活性物质，对防止和治疗艾滋病毒对人类的侵害具有重要的现实意义和理论价值；研究单味中药和中药复方的关系，这对中医药学科现代化具有一定的理论价值。

小柴胡汤得到的多组分中药提取物与传统中药方剂相比，具有如下特点：

(1)提取物的内在成分相对稳定，把中药材的来源差异消除到一个可控制的范围；

(2)将农药残留量，重金属离子含量降到国际标准所允许的限度内；

(3)具有一组相对公认的生物活性组分作为该提取物的质量检测标准。

参考文献：

[1]李楚源，徐安龙等

新世纪中药现代化的发展前瞻

世界科学技术-中药现代化

2002，4（3）：29

[2]于建军，耿杰

小柴胡汤对细胞因子的影响

国外医学中药分册

1998，20（5）：18

[3]张志军，第10次国际艾滋病会议（摘要）

国外医学中药分册

1995，17（1）：64

研究方案研究内容：

（1）研究小柴胡汤有效中药成分的提取方法和提取工艺条件。提取方法重点研究超声波强化提取，微波干燥—水煎提取等，筛选出合适的提取方法。研究提取的温度、时间、中药原材料的粉碎粒度等因素对提取效率的影响，确定最佳的提取工艺条件；

（2）研究提取液的分离纯化方法和分离纯化工艺条件。分离方法重点研究超滤法、絮凝剂法和柱层析法等分离技术。筛选出适合本项研究目的的分离纯化方法，最终确定最佳分离纯化工艺条件；

（3）研究提取物的生物活性。通过药理、毒理试验，研究给药量与药效的关系、单味中药与复方综合药效的关系，筛选出一组相对公认的生物活性成分。

（4）通过体外生物活性测试，研究该提取物对HIV感染细胞的作用，寻找活性组分，研究其构效关系，探索防止艾滋病的新药物；

（5）研究提取物的物质结构。利用现代分析技术，建立该提取物药效的定量检测标准；

（6）探讨中药复方配伍的内在规律。

重点解决的科学问题：

(1)建立中药剂量与药效的关系。解决这个问题的关键是提取物的内在成分比较稳定，要做到这一点，其提取、分离工艺一定是可重复的、稳定可控的；

(2)建立该提取物药效的检测标准。解决这个问题的关键，一是所选择的活性成分应是大家公认的，二是检测方法比较可靠，容易定量；

(3)确定该提取物对HIV感染细胞作用的活性成分，测定其物质结构。

预期成果：

(1)使其提取物具有用药安全，疗效可靠，成分稳定，质量可控的现代中药特点；

(2)初步建立该提取物的指纹图谱，利用相对公认的生物活性组分。作为它的质量测试标准；

(3)筛选出对艾滋病毒感染细胞有生物活性的主要成分，测定它的化学结构；

(4)为进一步中试放大提供提取工艺，分离纯化工艺的主要控制参数。

2．拟采取的研究方法和技术路线（包括研究工作的总体安排和进度，理论分析、计算、实验方法和步骤及其可行性论证，可能遇到的问题和解决办法，可另附页）

研究的技术路线：(省略)

研究工作预计两年完成，第一年完成提取，分离纯化的方法选择，完成提取物的生物活性测定，建立该提取物的指纹图谱和定量检测标准；研究剂量与效应的关系；研究提取物对艾滋病毒的作用，筛选出有效成分。第二年完成提取，分离纯化的工艺条件优化，完成单味中药——复方药效的关系研究，探讨复方配伍的内在规律。分析测试对艾滋病毒有生物活性的物质结构，探讨构效关系，对其先导化合物进行化学修饰或改造，为开发出治疗艾滋病的新型药物作一些有益探索。

在中草药提取的过程中，主要以水为溶剂，考察超声波，微波在提取过程中的影响。在分离纯化过程中，主要采用凝絮剂如壳聚糖（CTS）等除去提取液中的果胶，蛋白质和淀粉等大分子。另一方法是选用抗活性较好的聚丙烯腈膜材料或磺化聚砜膜等，利用超滤技术除去溶液中的无效成分。同时柱层析技术，萃取技术和醇沉技术等，在本项研究中也要进行考察和利用。生物活性测定在我校动物医学院中进行，利用那里较完备的生物活性测试系统，一是进行动物体内的药理、毒理研究，二是进行动物体外的病毒活性研究。既要测试复方提取物的生物活性，又要测试单味中药提取物的生物活性，期望得到一组有代表性的活性组分。以色谱法为主要方法，尤其是TLC，HPLC和GC色谱技术，综合UV，IR，NMR和MS等，测试提取物的特征结构，建立其指纹图谱，利用X射线衍射法，测定对艾滋病毒有活性的分子结构，研究其构效关系。

中药复方的成分比较复杂，药效是多靶点的，因此，筛选出一组有效成分是一个难题。对此，课题组准备先根据一个具体的靶点进行选择，再考虑各种靶点的情况，进行综合分析，筛选出一组相对公认的活性成分。第二个难题是在提取、分离各个过程中，都不能引入对人或动物有害的杂质。因此，在选用各种试剂、操作使用的仪器设备等各个细小环节，都必须认真对待这个问题。

四、研究基础

1.实现本项目目标已具备的条件（包括过去的研究工作基础，现有的主要仪器设备、研究技术人员及工作条件，从其他渠道已得到，已申请或拟申请的经费情况及金额等，可另附页）

本课题组成员在长期的科学研究中有过从天然植物中提取有效成分，进行分离纯化并研究其生物活性和分子结构的实践经历，了解其中的操作过程和研究方法。曾研究过油茶籽粕饼中提取油茶皂素，从黄姜中提取甾体皂苷和从盾叶著蓣中提取甾体皂甙等，在这些研究中涉及到了天然产物的各种提取，分离纯化方法，涉及到了提取物的性质研究，结构测定等，这为小柴胡汤有效成分的提取，分离纯化奠定了实验和研究基础。也研究过吡罗昔康凝胶有效成分的高效液相色谱分析，电感耦合等质子体质谱测定中草药中痕量稀土元素，微波消解/ICP-MS用于草药痕量元素测定及分光光度法测定甾体化合物等，这为开展小柴胡汤提取物的有效组分测定，建立提取物的指纹谱图等工作，积累了初步经验，为分析复杂的中药复方成分奠定了分析测试基础。还承担过省医工院项目—沙拉沙星药理毒理实验，研究了国产盐酸沙拉沙星在鸡的药动学和生物利用度，还研究了九灵胃康的急性和亚慢性毒性、氧阿苯达唑的药代动力学、临床试验等，这为研究小柴胡汤提取物的活性，药理，毒理奠定了基础。

现在我校在该项目研究领域可供使用的仪器设备主要有：高效液相色谱仪（日本岛津10ADAP），原子吸收分光光度计（AA-6800），气相色谱仪（HP5980），紫外分光光度计（UV-2450）和红外分光光度计（FTIR-8300）等，还有提取分离使用的常规玻璃仪器和较完善的药理，毒理系统实验条件。

2.项目组人员组成体现了学科交叉的特点。涉及到高分子化学与物理（郑新生）、药理、毒理学（王大菊）、分析化学（陈浩）、有机合成化学（马敬中、江洪）、农药学（马忠华、宁丽红）和天然植物化学（陆冬莲）。这保证了在该项目研究的每一个环节中都有必要的知识储备，多学科交叉配合，使本项目向纵深发展。项目组人员还具有比较合理的年龄层结构。50岁以上的1人，40-50岁之间2人，30-40岁之间2人，30岁以下3人。年龄较长的课题组第一、二负责人，有过多次组织省级科研项目的经验和长期的科学研究积累，年轻的都是刚从重点大学毕业的研究生，他们既接受了系统的科研训练，又有充沛的科学研究精力，在老、中、青协同努力下，能迅速开展科研活动，完成科研项目既定目标。项目组内部具有明确的责任分工。由郑新生教授负责课题的总体规划和小柴胡汤有效成分的提取，分离纯化工作；王大菊教授负责该提取物的药理，毒理实验，研究剂量药效间的关系；陈浩副教授负责提取物有效成分测定，建立指纹图谱，确定该提取物的药效定量检测标准；马敬中副教授，江洪博士（在读）负责筛选对HIV有生物活性成分，测定其结构，研究构效关系，对先导化合物进行化学修饰等；马忠华，宁丽红和陆冬莲负责日常的实验工作。申请者和项目组主要成员业务简历（按人填写主要学历和研究工作简历，近期发表的与本项目有关的主要论著目录和科研成果名称，并注明出处及获奖情况，可另附页）

申请人郑新生，毕业于华中理工大学，高分子化学与物理专业，理学硕士，教授，主要从事高分子，天然高分子，天然产物研究。主持完成了河南省科技攻关项目（项目号981090220）“苯并噁嗪二苯醚树脂的合成与应用”（河南省科委成果[1999]第147号），2000年获河南省教育系统科研三等奖。

主要论文：

郑新生，曾繁涤.苯并噁嗪二苯醚树脂的固化行为.高分子材料科学与工程，2000，16（5）：103

郑新生，曾繁涤.以苯胺、二苯醚为基础的苯并噁嗪预聚物的合成与表征.塑料工业，2000，28（4）：4

郑新生，周涛茶皂素表面活性的研究.信阳师范学院学报，1990，3（1）：72

第二主持人王大菊，毕业于华中农学院兽医专业，本科毕业，教授，主要从事药物的药理毒理研究，主持并完成了农业部重点科研项目：“抗菌药物残留快速检验方法研究”，并起草了该标准，主持完成了省医工院科研项目，“沙拉沙星药理毒理实验”，获得新药证书。

主要论文：

王大菊，邱银生.盐酸沙拉沙星在鸡的药动学和生物利用度研究.中国兽医学报，2002，22（6）：612

王大菊，周诗其.九灵胃康的急性和亚慢性毒理研究.华中农业大学学报，2002，21（3）：252

王大菊，周诗其.国产盐酸沙拉沙星对大鼠的亚慢性毒理研究.华中农业大学，2002，21（2）：135

主要参加者陈浩，毕业于武汉大学分析化学专业，理学硕士，近期主要从事中草药中痕量元素分析

主要论文：

陈浩等.吡罗昔康凝胶有效成分的高效液相色谱研究.分析科学学报，2000，16（16）

陈浩等.电感耦合等质子体质谱测定中草药中痕量稀土元素的研究.分析化学学报，2002，18（3）

陈浩等.微波消解/ICP-MS用于中草药痕量元素测定的研究.光谱实验室，2001，18（4）

主要参加者江洪，毕业于武汉大学有机合成专业，理学硕士，近期主要研究有机合成及天然产物化学。

主要论文：

江洪等.盾叶薯蓣根抽提物中甾体皂甙成分对植物病源真菌的抑制活性.华南农业大学学报，2002.3

江洪等.微波辐射快速合成2-(2′-羟基苯)-5（6）取代苯并咪唑.化学研究与应用，2002.4

江洪等.邻-[（5（6）-取代苯并咪唑-2-基）-苯氧乙酸乙酯的合成与表征.华中农业大学学报，2002.3

五、经费预算

支出科目金额（万元）计算根据及理由

1．合计5.60

2．科研业务费1.70资料费（0.50）、学术交流费（0.60）、管理、加班费（0.60）。

3．实验材料费1.30药品、低质易耗费（0.50）、特殊材料费（0.80）。

4．仪器设备费1.40所需的特殊的仪器配件费（0.80）、附属设备费（0.60）。

5．协作费1.20艾滋病毒协作试验费（0.80）、测试费（0.40