连续培养的基本原理课件

第六章连续培养的基本原理第一节微生物生长的基本特征微生物的种类（可分为三大类）：Ⅰ、非细胞型微生物（病毒）；Ⅱ、原核细胞型微生物，仅有原始细胞核，如细菌、放线菌等；Ⅲ、真核细胞型微生物，霉菌、酵母菌和单细胞藻类，原生动物。

微生物的作用：

微生物是生物反应过程的催化剂，催化原料转化为有用的产品；微生物如同一个微小的容器，原料中的反应物透过微生物细胞周围的细胞壁和细胞膜进入微生物体内，把反应物转化为产物，接着这些产物又被释放出来。

一、生长现象与繁殖方式

微生物可分为成三大类：Ⅰ、非细胞型微生物学（病毒）；Ⅱ、是原核细胞型微生物，仅有原始细胞核，如细菌、放线菌等；Ⅲ、是真核细胞型微生物，霉菌、酵母菌和单细胞藻类，原生动物。

微生物细胞在生长过程中的变化：

其形态、组成、活性都处在动态变化过程中，使其经历生长、繁殖、维持、死亡等阶段。并使反应系统中的环境条件也处在动态变化之中。微生物细胞的基本组成：蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸等。

二、生长的测定

微生物生长的测定，通常是测群体的重量或细胞数，而不是测细胞个体的重量或大小。生长测定的常用理化方法，分为测定细胞数和细胞重量两类。1、计数器计数法浊度计比浊法测定稀的细胞悬液的透光量，间接测出细胞数量的生长计数器计数法在显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或霉菌孢子数目，以及用细菌计数片直接测出细菌数的生长2、测定细胞重量

细胞干重称量法直接测定单位体积培养物的细胞干重，由此代表菌体细胞物质总量的生长细胞堆积容积测量法

用锥形刻度管测量经离心的细胞沉淀物的容积，由此间接表示细胞重量的生长细胞组成分析法测定一种大分子的细胞组成(蛋白质、RNA、DNA等)，间接地算出细胞重量的生长

第二节微生物生长动力学

什么是微生物生长动力学？微生物生长动力学是研究微生物生长过程的速率及其影响速率的各种因素，从而获得相关信息。微生物生长动力学可反映细胞适应环境变化的能力。

一、微生物生长曲线

细胞的生长过程可以用细胞浓度的变化来描述和表达。若取细胞浓度的对数值与细胞生长时间对应作图，可得到分批培养时的细胞浓度变化曲线。二、微生物生长动力学1、比生长速率specificgrowthrate若细胞物质或细胞数目增长一倍的时间间隔是常数，则微生物是以指数速率增长，可用数学模型来描述。（1）

（2）

式（1）表明，细胞物质随时间的增加而增加式（2）表明，细胞数目随时间的增加而增加当微生物处在最高的生长时期，培养基中营养物过量，此时生长速率与营养物浓度无关，而与细胞浓度有关，其关系表现为微生物细胞浓度（以重量表示）的瞬时增长速率dX/dt和培养液中微生物细胞浓度X成正比，或任一瞬间生长速率与细胞浓度成正比。若μ为常数，则：

对式（1）积分得：

在大多数情况下，生长是以物质的增加衡量的，因而得到应用。此式可在△t=td（td为倍增时间）时求得，td即在时所需时间，于是td=ln2/μ=0.693/μ。

为比生长速率，单位是h-1。对式（2）积分得：

lgNt-lgN0=µ(t1-t0)/2.303例题1：某微生物的＝0.125h-1，求td。2：N0时每ml培养液中细菌数为104，经过4小时后该培养液中细菌的数目增加到108，求此条件下细菌的比生长速率（µ）µ=(lgNt-lgN0)/(t1-t0)2.303=(8-4)/42.303/h=2.303h-1代表在该条件下，每个细菌以每小时增加2.303个细菌的速度增加

比生长速率的意义

比生长速率是菌体繁殖速率与培养基中菌体浓度之比，它与微生物的生命活动有联系

在对数生长期，是一个常数，这时

Monod方程是典型的均衡生长模型，其基本假设如下：①细胞的生长为均衡式生长，因此描述细胞生长的唯一变量是细胞的浓度；②培养基中只有一种基质是生长限制性基质，而其它组分为过量，不影响细胞的生长；③

细胞的生长视为简单的单一反应，细胞生长速率为一常数。

Monod方程中为比生长速率(h-1)；为最大比生长速率(h-1)，S为限制性基质浓度(g／L)；Ks为饱和常数(g/L)，其值等于比生长速率为最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。

当一种限制性营养物浓度S大大低于Ks时，µ=µmaxS/Ks，即µ很小，此时生长很慢当S=Ks时，µ=0.5µmax，随营养物浓度增加，µ相应增加，逐渐趋向µmax，µ成为营养物浓度的重要函数，此时营养物浓度仍是生长的限制因素，在Monod模型上表现为曲线当S无限大时，µµmax，理论上最大潜力

当营养物浓度S大大高于Ks时，营养物浓度不再影响微生物生长，即S的变化不再成为生长限制因素，此时，µ接近µmax，在Monod曲线上表现为直线在分批培养时，Ks表示微生物对营养物的亲和力，在一定营养条件下，Ks越小，微生物对限制性营养物的亲和力越大，限制性营养物的浓度必须降低到十分低的水平，才能影响微生物的生长，Ks越大，亲和力越小，即使限制性营养物浓度很高，生长率也下降将Monod方程变为并作图。通过该图，即可以获得两个重要的动力学参数。Ks和μm值随菌种、限制性基质种类的变化微生物限制生长基质Ksμm（hr）大肠杆菌葡萄糖0.22--大肠杆菌乳糖0.58--啤酒酵母乳糖2.6~3.00.18啤酒酵母葡萄糖0.56--纤维素分解菌葡萄糖0.860.125固氮菌葡萄糖0.16~0.330.13青霉菌氧气0.0070.35Monod方程虽然表述简单，但它不足以完整地说明复杂的生化反应过程，并且已发现它在某些情况与实验结果不符，因此人们又提出了另外一些方程,归纳于下表

单基质限制的细胞生长动力学模型第三节连续培养动力学及连续培养的应用现代发酵工业中，绝大多数的培养采用纯种液体培养方法,其操作方法主要有:间歇培养、连续培养和流加培养三种。连续培养是在1949年莫诺建立的，在连续培养中，将新鲜的培养基连续地加入有均匀培养液的反应器中，同时排出发酵液，使培养环境不随时间变化而改变，保持培养的稳定状态，并可以维持一个较长的时间。一、单级恒化器及其操作特征恒化器：指具有恒定化学环境的反应器。在培养过程中，可灵活的制造多种培养环境来研究微生物生长、发酵的动力学特征。物料衡算：对于菌体：积累的细胞=（进入–流出）的细胞+（生长-死亡）的细胞即：dx/dt=(u-D)x对于限制性底物：积累的底物=（进入-流出）的底物-（生长+形成产物+维持代谢）所消耗的底物即：ds/dt=D(s0-s)-(u/Yx/s+rp/Yp/s+ms)x对于产物：积累的产物=（生成-流出）的产物即：dp/dt=rp·x-D·p当培养处于稳态时，反应器中的菌体、底物、产物的积累量为零，即：

dx/dt=ds/dt=dp/dt=0则单级恒化器在稳态条件下的物料衡算方程为：菌体：D-u=0底物：D(s0-s)-(D/Yx/s+rp/Yp/s+ms)x=0产物：rp·x-D·p=0若在培养微生物菌体的特定连续培养过程中存在：1）培养过程无产物形成，或形成得很少，忽略不计；2）维持代谢所消耗的底物很少，忽略不计。则：D=u;x=Yx/s(s0-s)代入莫诺方程：s=Ks·u/um-u整理后得：x=Yx/s(

s0-Ks·D/um-D)若上式D→um,s→s0,x→0时临界稀释率：DcritDcrit=um·s0/Ks+s0通常：Dcrit=um说明：用单级恒化器连续培养菌体的稳态操作有D＜Dcrit，而当D≥Dcrit时，反应器中菌体浓度终将全部被洗出。参见书P113的例6-2二、部分菌体再循环的单级恒化器指连续分离单级恒化器流出的培养液，然后将分离后的部分菌体再接入反应器中。优点：提供了连续接种手段；增加了培养系统的稳定性；实现了在较高的稀释率下，D＞Dcrit；大大提高了单位体积反应器的反应效率物料衡算：对于菌体：积累的细胞=（进入-流出）的细胞+由循环液流入的细胞即：dx/dt=ux-[1+δ(1-γ)]x对于限制性底物：积累的底物=（进入-流出）的底物-消耗的底物+由循环液进入的底物即：ds/dt=D(s0-s)-u·x/Yx/s当培养处于稳态时，dx/dt=ds/dt=0，则：U=D[1+δ(1-γ)];x=Yx/SD/u(s0-s)引入循环浓缩因子R=1+δ(1-γ)，0＜R＜1针对莫诺方程：有x=1/R·Yx/s(s0-Ks·R·D/um-R·D)说明：在部分菌体再循环的单级恒化器中，稳定状态下的菌体浓度x比没有菌体再循环的大一个1/R因子。根据临界稀释率Dcrit的定义，则再循环下的临