第十九章药物研究的生物化学基础课件

第十九章

药物研究的生物化学基础第十九章

药物研究的生物化学基础1第一节生物药物制造的生物化学基础第一节生物药物制造的生物化学基础2

生物药物主要包括生化药物、微生物药物、生物技术药物和生物制品。制造技术的特点：1.目的物存在于组成非常复杂的生物材料中一种生物材料含有成千上万种成分，各种化合物的形状、大小、分子形式和理化性质各不相同，其中不少还是未知物，而且有效物质在制备过程尚处于代谢动态中，故常常无固定工艺可循。一、生物药物制备方法的特点生物药物主要包括生化药物、微生物药物、生物技术药物32.有些目的物在生物材料中含量极微只达万分之一、十万分之一、甚至百万分之一，因此分离纯化步骤多，难于获得高收率。3.生物活性成分易变性、破坏4.生物药物制造受理化因素和生物学因素影响生物活性成分离开生物体后，易变性破坏，分离过程必须十分小心，以保护有效物质的生物活性。以致许多工艺设计理论性不强制造工艺几乎都在溶液中进行温度、pH、离子强度对溶液中各种组分的综合影响常常难于固定2.有些目的物在生物材料中含量极微只达万分之一、45.生物药物常采用“多阶式”法纯化一种有效物质常常要联用几个，甚至十几个步骤并变换不同类型的分离方法交互进行才能达到目的。为了保护目的物的活性及结构完整性即“逐级分离”法。生物药物的均一性检测与化学上的纯度概念不完全相同5.生物药物常采用“多阶式”法纯化一种有效物质常常要联用5生物大分子类药物的分离纯化主要原理是：1）根据分子形状和分子大小不同的分离方法如，差速离心，超速离心，膜分离透析。电透析、超滤和凝胶过滤等。2）根据分子电离性质（带电性）不同的分离方法如，离子交换法、电泳法和电聚焦法等。3）根据分子极性大小与溶解度不同的分离方法如，溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂分级沉淀法。4）根据配基特异性不同的分离方法——亲和层析生物大分子类药物的分离纯化主要原理是：1）根据分子形状和分子6是指利用生物细胞的代谢反应（更多的是利用微生物转化反应）来合成化学方法难于合成的药物或药物中间体。生物合成：微生物转化反应：是指利用微生物的代谢作用来进行某些化学反应，确切地说就是利用微生物代谢过程中某种酶对底物进行催化反应，以生成所需要的活性物质。二、生物合成技术原理

是指利用生物细胞的代谢反应（更多的是利用微生物转化7微生物转化产物特点：转化条件温和具有立体构型单一公害少后处理简便能进行某些化学反应难于进行或不能合成的反应为此，在制药工业中得到愈来愈广泛的应用，现已形成一个以遗传工程为指导，以发酵工程为基础，包括细胞工程和酶工程有机结合的生物合成技术体系，微生物转化产物特点：转化条件温和具有立体8半合成技术：1）药物其部分结构由天然资源得到化学合成法制得最终产品＋2）化学合成的中间产物微生物转化法获得最终有效化合物＋半合成技术：1）药物其部分结构由天然资源得到化学合成法制得最9

生物技术（biotechnology）

又称为生物工程（bioengineering），是利用生物有机体（动物、植物和微生物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展新产品或新工艺的一种技术体系。三、生物技术原理（前述）生物技术（biotechnology）10包括：发酵工程基因工程细胞工程酶工程包括：发酵工程基因工程细胞工程酶工程11

基因工程技术的定义

用人工方法，提取或制备某种细胞的某种基因，在体外把它和一种载体连接构造杂种DNA分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物的工程技术。基因工程技术的定义12

细胞工程的定义

应用细胞生物学和分子生物学的方法,通过类似于工程学的步骤,在细胞整体水平或细胞器水平上按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术。其技术涉及细胞融合技术、细胞拆和技术、染色体导入技术、基因转移技术、胚胎移植技术、细胞与组织培养技术等。

细胞工程的定义应用细胞13

酶工程的定义

在酶反应器中,利用酶的生物催化作用,生产出人类所需要产品的一门科学技术。例如过去蔗糖几乎全部通过加工甘蔗或甜菜获得,但现在科学家利用α-淀粉酶等多种酶的催化作用,在酶反应器中将淀粉转化成和蔗糖具有同样甜度的高果糖浆。酶工程的定义在酶反应14

发酵工程发酵工程也称为微生物工程，是在最适合条件下，对单一菌种进行培养，是生物特定产品的一种生物工艺。发酵工程发酵工程也称为微生物工程，是在15单克隆抗体技术现代生物技术核心重组DNA技术生物工程药物是指运用重组DNA技术和单克隆抗体技术生产的多肽、蛋白质、激素和酶类药物以及疫苗、单抗和细胞生长因子类药物。单克隆抗体技术现代生物技术核心重组DNA技术生物工程药物16工程菌（或细胞）的大量培养与目的蛋白的生产基因工程是生物技术中最重要的一种。目的基因制备载体的选择和制备DNA片段重组连接重组DNA导入受体细胞转化子的筛选DNA重组体的筛选DNA重组体的鉴定工程菌（或细胞）的大量培养与目的蛋白的生产基因工程是生物技术17

(一)基因载体（Vector）1、定义：携带目的基因片段进入受体细胞的DNA一个理想的载体应具备以下几个条件：（a）本身是一个复制子，能自我复制。载体在进入受体细胞后，可自身复制或插入到基因组中，随受体细胞的基因组一起复制。（b）分子量小，小分子的DNA制备时不易损伤，小分子DNA限制酶的切点少。（c）目的基因与载体连结后，可在受体细胞内转录，翻译成蛋白质产物（表达载体）。（d）能给寄主（受体）细胞提供可选择的标记：如抗药性，营养缺陷型或显色表型等，以利于筛选。

（E）具有多克隆位点，便于目的基因片段与载体连接。(F)拷贝数多，便于分离提纯。(一)基因载体（Vector）1、定义：携带目的18

2、载体的分类

功能分类：克隆载体表达载体转移载体探针载体组成元件的来源分类:

质粒（plasmid）载体噬菌体载体：如λ噬菌体载体、M13噬菌体载体杂合载体(如粘粒cosmid)病毒性载体：逆转录病毒载体、腺病毒载体等人工染色体载体

2、载体的分类

功能分类：克193、克隆载体（cloningvector）（1）克隆载体的功能：用来克隆和扩增DNA片段（目的基因）的载体具备条件：（a）必须是一个复制子，能在受体细胞中复制。复制起点Ori复制区复制终点term（b）带有抗药性基因Tetr：编码膜蛋白，阻止Tet进入细胞Ampr：β-内酰胺环水解酶。Kanr：

Kan～P,neo～pCamr：氯霉素乙酰基转移酶

3、克隆载体（cloningvector）（1）克隆载体的20

（C）具有多克隆位点（multiplecloningsits，MCS）载体上含有的一个人工合成的DNA片段，其上含有数个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位具备条件：是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成。这些位点在载体上都是单一位点（d）可导入受体细胞（C）具有多克隆位点（multiplecloni21pBR322质粒有两个抗药性基因，每个抗性基因中均含有单克隆位点，外源DNA插入后使相应的抗性基因失活，宿主细胞失去相应的抗药性，不能在含相应抗生素的培养基中生长，这一现象称为插入失活。pBR322质粒有两个抗药性基因，22质粒pBR322的抗性基因筛选示意图质粒pBR322的抗性基因筛选示意图234、表达载体（expressingvector）（1）表达载体的功能：在受体细胞中表达外源基因的载体

结构：克隆载体+表达构件—原核生物表达真核生物表达

oriampr基础上加转录和翻译相关elementMCS

（2）原核（大肠杆菌）表达载体表达载体=克隆载体+表达元件“启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号”

“P—RBS—MCS—term”4、表达载体（expressingvector）（1）表达24原核表达载体结构示意图用T7表达系统质粒的基本结构元件原核表达载体结构示意图用T7表达系统质粒的基本结构元件25

(3)哺乳动物表达载体（1）病毒载体整合性载体：外源基因通过这种载体与宿主细胞的染色体整合。如pSV系列载体游离型载体：外源基因与这种载体重组后，以病毒颗粒形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒和逆转录病毒等。（2）质粒载体常常是穿梭质粒载体。既含原核的复制位点和筛选标记，又含真核的复制位点筛选标记和表达构件。(3)哺乳动物表达载体（1）病毒载体261.直接从染色体DNA分离

如果物理图谱已确定，可用限制酶直接从原核生物，噬菌体及动物病毒基因组切取目的基因。（二）目的基因的来源（Isolation）1.直接从染色体DNA分离如果物理图谱已确定，272.化学合成要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列

基因小2.化学合成要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸283.从cDNA文库（cDNA文库）筛选目的基因

将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNA逆转录成cDNA后,将所有cDNA混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为cDNA文库。

3.从cDNA文库（cDNA文库）筛选目的基因29mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTTmRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子30

4.从基因组文库（genomiclibrary）筛选目的基因

采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因组文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。从细胞中分离基因组DNA、用Sau3A或MboI部分消化、回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。4.从基因组文库（genomiclibrary）筛选目31组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分325.PCR或RT-PCR

根据目的基因的核苷酸序列设计一对引物以基因组DNA为模板经PCR扩增目的基因。以mRNA或RNA为模板经RT-PCR扩增目的基因。5.PCR或RT-PCR33（三）限制酶的应用

限制酶(restrictionenzyme):一类专门切割DNA的酶。是一类能识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并与其特异结合，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。

“Restrictionendonucleasesarebacteriaenzymewhichcut(hydrolyze)DNAintodefinedandreproduciblefragments.Inbacteriatheyformpartoftherestriction—modificationdefensemechanismagainstforeignDNA.Theyarebasicgenecloningtools.”

1.定义：（三）限制酶的应用1.定义：342.限制酶的识别和切割位点识别：

4～6碱基对，多具有回文结构（palindrom），少数识别长序列为8个或8个以上碱基对，有的存在简并序列（有的核苷酸位点可以不同）。Sau3AI

EcoRI

PstⅠSmaⅠ5′GATCGAATTCCTGCAGCCCGGG3′3′CTAGCTTAAGGACGTCGGGCCC5′

简并序列：GTYRAC——Y=C/TR=G/AYR=CG/CA/TG/TA∴HindⅡ可识别4个特定序列

2.限制酶的识别和切割位点识别：4～6碱基对，多具有回文353.限制酶的切割方式(1)识别序列内两条链上交错切割，产生单链突出的粘性末端(2)对称处同时切断DNA的两条链，产生平端DNA片段3.限制酶的切割方式(1)识别序列内两条链上交错切割，产生单364.限制酶的切割结果切割的结果：产生三种不同的末端平末端—bluntend5’突出—5’-protruding（cohesiveend）3’突出—3’-protruding（overhangtail）切割的化学本质：磷酸二酯键的断裂,形成含5’—P和3’—OH末端的两个DNA片段。对一特定的DNA而言，识别序列碱基对少的，则切点数多，产生的片段小。4.限制酶的切割结果切割的结果：产生三种不同的末端37第十九章药物研究的生物化学基础课件38(四)重组体的构建1.粘性末端连接：用同一种酶裂解后，产生相同的粘性末端，很容易按照碱基配对的原则以氢键结合，在T4DNA连接酶的作用下，共价闭合。

连接方式：

定向取代

双向插入（正向/反向）（双酶切）（单酶切）措施：载体酶切后，用AP（碱性磷酸酶）水解5’端的磷酸基团防止载体的自身环化。(四)重组体的构建1.粘性末端连接：用39

同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接

G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ的识别序列及切割部位G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ含目的基因的DNA片段BamHⅠGC

C

T

A

G5'3'5'3'3'5'5'3'5'3'5'3'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

G

G

A

T

C

C

G目的基因片段混合、退火G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

A

T

C

C

GG

C

C

T

A

G质粒载体含目的基因的重组质粒G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

GDNA连接酶同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接GGAT40双酶切DNA片段粘性末端的连接

G

G

A

T

C

CC

C

T

A

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GBamHⅠBamHⅠBamHⅠG

C

C

T

A

G5'3'5'3'5'5'5'3'5'3'3'G

A

A

T

T

CC

T

T

A

A

G

A

A

T

T

C

G目的基因片段混合、退火G

C

T

T

A

A

G

A

T

C

C

G

A

A

T

T

C

GG

C

C

T

A

G重组质粒DNA连接酶EcoRIEco

RI5'

G

A

T

C

C

G

G

C

T

T

A

A

A

A

T

T

C

G

G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

C

T

T

A

AEcoRI

GATCC

G

G

CCTAG3'5'载体双酶切DNA片段粘性末端的连接GGATCCCC41加入同聚体尾（homopolymerictail）连接

TdT：末端转移酶，可将某种单一脱氧核苷酸逐一加到3’-OH上去。底物：3’粘性突出末端

加入同聚体尾（homopolymerictail）连接422.平端连接

不同方式产生的平端DNA片段可以在T4DNA连接酶的作用下，与某些限制酶产生的平端载体相连接。在连接时，所用的ATP及T4DNA连接酶的浓度要比连接粘末端的高些。2.平端连接43(五)重组体的转化受体细胞应具备下列条件:1.安全宿主菌（或宿主细胞）在人肠道几无存活或存活率极低2.限制酶缺陷型，外源DNA进入受体菌不被降解3.重组缺陷型，保证外源DNA不与细菌基因组DNA重组，独立存在4.能发展成感受态细胞的菌株感受态：是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态感受态细胞：指经过一定方法处理后具备接受外源DNA能力的细胞(五)重组体的转化受体细胞应具备下列条件:44(五)重组体的转化

（transformation）

定义：

将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。过程：细胞—低温CaCl2处理—感受态细胞—加重组DNA—42℃热休克—重组体吸入细胞—复苏—涂板（含抗生素）—筛选转化菌落。其它方法：电转化、PEG法等。

(五)重组体的转化

（transformation）45

重组DNA转化过程示意图重组DNA转化过程示意图46

感染（fection）

以噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组DNA分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。此过程又叫转导（transduction）。

感染效率》转化效率

感染（fection）47（六）重组体的筛选和鉴定

涉及遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交和PCR方法1.根据重组体的表型进行筛选（1）抗生素抗性筛选：所有的克隆载体均带有可供选择的遗传学标志或特征，如某种抗生素的抗性基因，为选择提供方便。

（六）重组体的筛选和鉴定涉及遗传学方法、免疫学方法48

2.酶切鉴定

挑选单个菌落—扩大培养—小量快速提取质粒—酶切（根据插入片段上的酶切位点选定）—分析有无插入片段、插入片段大小及数量、插入方向等。

2.酶切鉴定挑选单个菌落—扩大培养—小量49（三）核酸杂交法—菌落原位杂交

从基因文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，它与目的基因的表达与否无关。（三）核酸杂交法—菌落原位杂交50原位杂交

原位杂交51基因工程的基本过程

基因工程的基本过程52重组DNA技术在药学中的应用①生产基因工程药物②定向改造生物的基因结构，构建高产菌株，用于改造传统制药工业③用于基础研究重组DNA技术在药学中的应用①生产基因工程药物53单克隆抗体（biotechnology）

是由一个杂交瘤细胞及其后代产生的抗体，具有单一、特异与纯化的特性。单克隆抗体主要用于免疫诊断、定向给药及家庭诊断检测试剂盒的配制，在治疗上也具有良好应用前景。单克隆抗体（biotechnology）是由54抗原注入小鼠体内用PEG促使细胞融合得到杂交瘤细胞收集骨髓瘤细胞分离受免淋巴细胞培养骨髓瘤细胞单抗产品单抗产品在HAT培养基中培养克隆杂交瘤细胞扩大组织培养或生成腹水瘤分离纯化筛选产生专一抗体的杂交瘤细胞分离纯化杂交瘤细胞与单克隆抗体制造示意图抗原注入小鼠体内用PEG促使细胞融合得到杂交瘤细胞收集骨髓瘤55第二节药物质量控制的生物化学基础

第二节药物质量控制的生物化学基础

56一、药物质量控制的常用生化分析法一、药物质量控制的常用生化分析法57生化分析法的优点：操作简便，取样少，灵敏度高，专一性强。微量凯氏定氮法——测定含氮有机药物酶法——分析具有旋光异构体或几何异构体的药物免疫法——分析具有抗原或半抗原性质的药物放射酶法——检测微生物药品等生化分析法的优点：操作简便，取样少，灵敏度高，专一性强。微量58（一）免疫分析法

基于抗原抗体特异性结合反应发展起来的分析方法。1.免疫扩散法2.免疫电泳法3.放射免疫测定法（RIA）4.酶联免疫测定法（ELISA）（一）免疫分析法

基于抗原抗体特异性结合反应发展起来591.免疫扩散法本法可用于未知样品的抗原组成及不同样品的抗原特性比较鉴定。1.免疫扩散法本法可用于未知样品的抗原602.免疫电泳法本法可用以检查抗原制剂的纯度和分析抗原混合物的组分。2.免疫电泳法本法可用以检查抗原制剂的纯度613.放射免疫测定法（RIA）Ag-AbAgAg*-Ab＋Ab＋Ag*3.放射免疫测定法（RIA）Ag-AbAgAg*-624.酶联免疫测定法（RIA）4.酶联免疫测定法（RIA）63（二）电泳分析法

电泳是带点颗粒在电场作用下，向着与其所带电荷相反的电极方向移动。各种物质由于所带净电荷的种类和数量不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同。利用物质的这种性质可以对物质进行分离和鉴定。（二）电泳分析法

电泳是带点颗粒在电场作用下，向着与64电泳分析法

电泳分析法

65影响颗粒电泳迁移率的因素主要有：1.缓冲液的种类和性质2.电场3.支持介质影响颗粒电泳迁移率的因素主要有：1.66（三）酶法分析酶法分析的原理是借助酶促反应（包括单酶或多酶耦联反应）对酶或酶所作用的底物或参与酶促反应的辅酶、激动剂和抑制剂等进行定性、定量分析。（三）酶法分析酶法分析的原理是借助酶促反应（包67酶法分析的特点酶法分析的特点68酶法分析主要有三类测定法：1.中止反应法2.连续测定法3.循环放大法酶法分析主要有三类测定法：1.中止反应法2.连续测定法369第十九章药物研究的生物化学基础课件70二、生物药物质量控制的生化分析法

二、生物药物质量控制的生化分析法

71（一）多肽与蛋白质类药物的主要分析方法1.蛋白质药物的纯度分析蛋白质纯度一般是指样品有无含其他杂蛋白，而不包括盐类、缓冲液离子、SDS等小分子在内。蛋白质纯度检测方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）SDS毛细管电泳（CE）等点聚焦（IEF）HPLC（包括凝胶排阻层析，各种反相HPLC，离子交换色谱，疏水色谱等）化学法（一）多肽与蛋白质类药物的主要分析方法1.蛋白质药物的纯722.多肽与蛋白质的分子量的测定2.多肽与蛋白质的分子量的测定733.蛋白质的定量测定3.蛋白质的定量测定74第十九章药物研究的生物化学基础课件754.生物质谱法4.生物质谱法76（二）核酸类药物的主要分析方法

核酸、核苷酸及其衍生物的分子中含有碱基，具有共轭双键结构，对紫外光有特征吸收，RNA和DNA对紫外光的特征吸收位于260nm处。核酸分子中含有碱基、戊糖和磷酸。定量核酸的方法可测定三者中任何一种，从而计算样品中的核酸含量。

每1ml含1μgRNA溶液的光吸收值为0.022，

每1ml含1μgDNA溶液的光吸收值为0.020。1.紫外分光光度法测定RNA与DNA含量（二）核酸类药物的主要分析方法核酸、核苷酸及其衍生77当RNA与浓盐酸在100℃下煮沸后，即发生降解产生核糖，并进而转变为糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应生成绿色复合物，在670nm处有最大吸收。2.地衣酚显色法测定RNA当RNA与浓盐酸在100℃下煮沸后，即发生降783.二苯胺法测定DNA含量3.二苯胺法测定DNA含量79（三）酶类药物的分析酶类药物的主要质量指标是它的催化活力。适宜的测定酶活力的方法至少应满足如下条件：1.有可被检测且能反映酶反应进行程度的信号物2.底物对酶远远过量3.适宜的反应温度4.最适的pH反应体系5.被测的酶量适当6.测定时间在酶促反应初速度范围内。（三）酶类药物的分析酶类药物的主要质量指标是它的催80（四）重组DNA药物中的可能杂质检查（四）重组DNA药物中的可能杂质检查811.外源性DNA重组DNA药物中残留的外源性DNA来源于宿主细胞，每种制品都有其独特的残留DNA，因此产品中必须控制外源性DNA残留量。测定残留DNA的有效方法：DNA分子杂交技术。1.外源性DNA重组DNA药物中残留的外源性DNA822.宿主细胞蛋白质宿主细胞蛋白质简称宿主蛋白，是指生成过程中来自宿主或培养基中的残留蛋白或多肽等杂质。测定制品中宿主蛋白含量的方法：酶联免疫吸附测定法（ELISA）；Westernblot法。2.宿主细胞蛋白质宿主细胞蛋白质简称宿主蛋白，是指83３.二聚体或多聚体的测定一般采用分子排阻色谱法测定二聚体或多聚体的含量限度。4.降解产物的测定鉴于降解产物的基本结构通常与未降解的重组药物相似，因此，对降解产物的测定多采用离子对反相色谱。３.二聚体或多聚体的测定一般采用分子排阻色谱法测定84第三节药理学研究的生物化学基础第三节药理学研究的生物化学基础85现代药理学研究已从整体、系统、器官、组织、细胞进入到亚细胞、分子甚至量子水平，因此生物化学和分子生物学已成为现代药理学的重要理论基础。现代药理学研究已从整体、系统、器官、组织、细胞进入86一、药物作用的生物化学基础

（一）神经传导与神经递质当两个神经元的突触＜20nm时，动作电位仍可使突触后膜去极化，神经冲动继续向下传递。如裂隙＞20nm时，就必须由神经递质来传递信息。神经递质(突触分泌信号)：神经元突触前膜释放起着信息传递作用的物质称为神经递质。一、药物作用的生物化学基础

（一）神经传导与神经递质87

（二）受体的结构与功能细胞中能识别配体并与其特异性结合，引起各种生物效应的分子称为受体。为蛋白质，部分为糖蛋白或脂蛋白。

受体的化学本质：

（二）受体的结构与功能细胞中能识别配体并与881.受体——离子通道型受体本身构成离子通道。当受体的调节部位与配体结合后，受体变构，使通道开放或关闭、引起或切断阳离子、阴离子的流动，从而传递信息。1.受体——离子通道型受体本身构成离子通道。892.受体——G蛋白-效应蛋白型在真核细胞，鸟苷三磷酸-结合蛋白（G蛋白）在联系细胞膜受体与效应蛋白质中起着重要的介导作用。2.受体——G蛋白-效应蛋白型在真核细胞90第十九章药物研究的生物化学基础课件913.受体——酪氨酸蛋白激酶型3.受体——酪氨酸蛋白激酶型924.受体——转录因子型4.受体——转录因子型93

（三）药物作用的靶酶药物对靶酶的作用：一是调节酶量（酶的合成增加或减少），二是调节酶活力（激动剂、抑制剂、辅酶或活力调节）。有些重要治疗剂的作用在于它们能选择性地抑制一种靶酶。

（三）药物作用的靶酶药物对靶酶的作用：一94一种酶抑制剂要成为应用于临床的有效药物应具备以下条件：被抑制的靶酶所催化的生化反应与某种疾病的发生有关，在患者体内这一生化途径的抑制具有治疗意义。2.这种酶抑制剂必须具有特异性，在治疗剂量内不对其它代谢途径或受体发生抑制作用。3.这种抑制剂应具有某种药动学特征，如可被吸收并渗透到作用部位和具有合理，可预见的量效关系及作用持续时间。4.抑制剂对人体毒性较小，疗效指数高。5.抑制剂应符合药品标准。工艺、质量与价格在临床上与市场上具有竞争性。一种酶抑制剂要成为应用于临床的有效药物应具备以下条件95

（四）细胞生长调节因子细胞生长调节因子系在体内和体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类生理活性物质，其中大多数是蛋白质或多肽，亦有非蛋白质物质。许多生长因子在靶细胞上有特异性受体，它们是一类分泌性、可溶性介质，仅微量就具有生物活性。

（四）细胞生长调节因子细胞生长调节因子系在体96细胞生长调节因子分为：1.细胞生长刺激因子类：如：促红细胞生长因子与集落细胞刺激因子等造血细胞生长因子和表皮生长因子、纤维细胞生长因子、神经生长因子、白细胞介素1~18、骨生长因子等。2.细胞生长抑制因子类：如：如干扰素（α、β、γ），肿瘤坏死因子α、β，转化生长因子（TGFS），肝增殖抑制因子等。细胞生长调节因子分为：1.细胞生长刺激因子类：如：促红细97二、新药物筛选的生物化学方法

研究治疗某种疾病的药物，首先要有能反映预期药理作用的筛选模型。新药筛选模型可以是整体动物或是细胞、亚细胞或分子水平。生物化学理论与实验方法常常成为新药筛选与药效学研究的技术手段。二、新药物筛选的生物化学方法

研究治疗某种疾98（一）放射配基受体结合法（RRA）（一）放射配基受体结合法（RRA）99（二）酶学实验法在药物代谢中起关键作用的酶是肝脏细胞色素P450系统。其主要技术：制备肝微粒体和线粒体用于体外药物代谢研究；用诱导肝脏药物酶的方法研究药物对肝脏药物酶的影响；观察药物对细胞色素P450活性及含量的影响以及药物与P450结合后的光谱分析；测定药物受肝脏药物代谢酶的水解作用和药物经葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶的作用所产生的结合反应等。（二）酶学实验法在药物代谢中起关键作用的酶是肝脏细胞色素P4100（三）膜功能研究方法在药理学研究中有代表性的膜制备技术与功能研究方法常见的有：1.钙调蛋白-红细胞膜的制备及钙调蛋白功能测定应用高速离心法制备的红细胞膜含有Ca2+、Mg2+-ATP酶是一种与钙离子转运密切相关的CaM靶酶。通过测定CaM激活Ca2+、Mg2+-ATP酶活性的变化可观察钙拮抗剂类药物的药理活性。（三）膜功能研究方法在药理学研究中有代表性的膜制1012.心肌细胞膜的制备与功能测定应用差速离心法制备的心肌细胞膜可作为膜上酶的活性的测定材料。强心甙，某些抗心律失常药和β-肾上腺能阻断药的作用机制都与心肌细胞膜上的Na+、K+-

ATP酶或腺苷酸环化酶以及膜上专一性受体的功能有关。因此，心肌细胞膜的功能分析可供这类药物的筛选研究。2.心肌细胞膜的制备与功能测定应用102（四）生化代谢功能分析法体内存在着一整套复杂又十分完整的代谢调节网络，各种代谢相互联系，有序进行。整体的神经-体液调节细胞及其关键酶的调节生化代谢功能分析的目的：是研究纠正代谢紊乱与失调药物的有效实验方法。（四）生化代谢功能分析法体内存在着一整套复杂又十1031.降血糖药物实验法：2.调血脂药及抗动脉粥样硬化药实验法：1）喂养法抗动脉粥样硬化药的筛选模型主要有：2）免疫学方法3.凝血药和抗凝血药实验法1.降血糖药物实验法：2.调血脂药及抗动脉粥样硬化药实验104（五）逆向药理学以往的药理学研究模式：先发现作用于某一类受体或受体亚型的药物（确定受体的存在）分离受体（研究受体的相关基因家族）即：配基（药物）受体基因模式逆向药理学研究模式：即：受体基因配基（药物）（五）逆向药理学以往的药理学研究模式：105第四节与药物设计有关的生物化学原理第四节与药物设计有关的生物化学原理106药物设计是新药研究的重要内容，是研究和开发新药的重要手段和途径。所谓药物设计是通过科学的构思与科学的方法，提出具有特定药理活性的新化学实体或新化合物结构。药物设计是新药研究的重要内容，是研究和开发新药的重107一、酶与药物设计一些重要治疗药物的作用机制就在于它们抑制了一种靶酶，靶酶有的存在于正常人体组织中，有的存在于感染人体的病原体内。一、酶与药物设计一些重要治疗药物的作用机制就108（可逆性胆碱酯酶抑制剂）毒扁豆碱抑制乙酰胆碱酯酶抑制乙酰胆碱阻止其水解，延长其效应。毒扁豆碱起着拟胆碱剂的作用，主要用于青光眼缩瞳作用。（可逆性胆碱酯酶抑制剂）毒扁豆碱抑制乙酰胆碱酯酶抑制乙酰109磺胺类药物二氢叶酸二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶对氨基苯甲酸谷氨酸二氢叶酸还原酶四氢叶酸磺胺类药物抗菌增效剂TMP磺胺类药物二氢叶酸二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶二氢叶酸110二、受体与药物设计药物受体是在分子水平上，与药物互相识别、相互作用而发生初始药理效应的生物大分子。受体的基本特征是：1.受体具有识别特异性配体（药物）的能力，其识别的基础是二者在化学结构和空间结构的互补；配体与受体结合后可引发生物效应，其结合具有特异性，饱和性和可逆性；3.与受体结合的配体，其生物效应可分为激动剂和拮抗剂。二、受体与药物设计药物受体是在分子水平上，与111（一）受体介导的靶向药物设计利用受体学说指导药物设计，目前切实可行的是受体介导的药物导向，即以受体的配体为药物载体，把有效药物选择性地通过受体导向特定的细胞分子，以达到治疗疾病和减少毒副作用的目的。利用无药理性活性的受体配体作为药物载体，制成的靶向药物大大地增加了药物作用的选择性。（一）受体介导的靶向药物设计利用受体学说指导药物112靶向药物按其导向机制可分为：是指药物通过正常的生理转运和潴留达到靶部位。被动靶向：主动靶向：是指通过生物识别设计，如抗体识别、受体识别、免疫识别等将药物导向特异靶部位。物理靶向：形象的称为“药物导弹”。是指通过磁场、点场、温度等因素把药物导向靶部位，如磁性微球、热敏脂质体等。靶向药物按其导向机制可分为：是指药物通过正常的生理113（二）药物与受体结合的构象分析研究受体蛋白三维结构的方法有：1.同源分子法2.归纳法3.演绎法4.比较分子力场分析法（二）药物与受体结合的构象分析研究受体蛋白三维结114三、药物代谢转化与前体药物设计三、药物代谢转化与前体药物设计115四、生物大分子的结构模拟与药物设计四、生物大分子的结构模拟与药物设计116五、药物基因组学与药物研究五、药物基因组学与药物研究117药物基因组学在以下药学领域中将获得广泛应用：检测、评估个体对某种药物的适用程度，使药物的有效性达到最大化。2.检测药物应答基因的多态性，依据个体的遗传差异实现个性化用药。3.确定疾病发生相关基因，筛选新的药物作用靶点，研究药物代谢酶基因谱及药物产生毒副反应的相关基因，从而提高新药开发命中率，增强药物疗效和安全性，缩短开发周期，降低研究开发成本。药物基因组学在以下药学领域中将获得广泛应用：检测、评估个体对118第十九章

药物研究的生物化学基础第十九章

药物研究的生物化学基础119第一节生物药物制造的生物化学基础第一节生物药物制造的生物化学基础120

生物药物主要包括生化药物、微生物药物、生物技术药物和生物制品。制造技术的特点：1.目的物存在于组成非常复杂的生物材料中一种生物材料含有成千上万种成分，各种化合物的形状、大小、分子形式和理化性质各不相同，其中不少还是未知物，而且有效物质在制备过程尚处于代谢动态中，故常常无固定工艺可循。一、生物药物制备方法的特点生物药物主要包括生化药物、微生物药物、生物技术药物1212.有些目的物在生物材料中含量极微只达万分之一、十万分之一、甚至百万分之一，因此分离纯化步骤多，难于获得高收率。3.生物活性成分易变性、破坏4.生物药物制造受理化因素和生物学因素影响生物活性成分离开生物体后，易变性破坏，分离过程必须十分小心，以保护有效物质的生物活性。以致许多工艺设计理论性不强制造工艺几乎都在溶液中进行温度、pH、离子强度对溶液中各种组分的综合影响常常难于固定2.有些目的物在生物材料中含量极微只达万分之一、1225.生物药物常采用“多阶式”法纯化一种有效物质常常要联用几个，甚至十几个步骤并变换不同类型的分离方法交互进行才能达到目的。为了保护目的物的活性及结构完整性即“逐级分离”法。生物药物的均一性检测与化学上的纯度概念不完全相同5.生物药物常采用“多阶式”法纯化一种有效物质常常要联用123生物大分子类药物的分离纯化主要原理是：1）根据分子形状和分子大小不同的分离方法如，差速离心，超速离心，膜分离透析。电透析、超滤和凝胶过滤等。2）根据分子电离性质（带电性）不同的分离方法如，离子交换法、电泳法和电聚焦法等。3）根据分子极性大小与溶解度不同的分离方法如，溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂分级沉淀法。4）根据配基特异性不同的分离方法——亲和层析生物大分子类药物的分离纯化主要原理是：1）根据分子形状和分子124是指利用生物细胞的代谢反应（更多的是利用微生物转化反应）来合成化学方法难于合成的药物或药物中间体。生物合成：微生物转化反应：是指利用微生物的代谢作用来进行某些化学反应，确切地说就是利用微生物代谢过程中某种酶对底物进行催化反应，以生成所需要的活性物质。二、生物合成技术原理

是指利用生物细胞的代谢反应（更多的是利用微生物转化125微生物转化产物特点：转化条件温和具有立体构型单一公害少后处理简便能进行某些化学反应难于进行或不能合成的反应为此，在制药工业中得到愈来愈广泛的应用，现已形成一个以遗传工程为指导，以发酵工程为基础，包括细胞工程和酶工程有机结合的生物合成技术体系，微生物转化产物特点：转化条件温和具有立体126半合成技术：1）药物其部分结构由天然资源得到化学合成法制得最终产品＋2）化学合成的中间产物微生物转化法获得最终有效化合物＋半合成技术：1）药物其部分结构由天然资源得到化学合成法制得最127

生物技术（biotechnology）

又称为生物工程（bioengineering），是利用生物有机体（动物、植物和微生物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展新产品或新工艺的一种技术体系。三、生物技术原理（前述）生物技术（biotechnology）128包括：发酵工程基因工程细胞工程酶工程包括：发酵工程基因工程细胞工程酶工程129

基因工程技术的定义

用人工方法，提取或制备某种细胞的某种基因，在体外把它和一种载体连接构造杂种DNA分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物的工程技术。基因工程技术的定义130

细胞工程的定义

应用细胞生物学和分子生物学的方法,通过类似于工程学的步骤,在细胞整体水平或细胞器水平上按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术。其技术涉及细胞融合技术、细胞拆和技术、染色体导入技术、基因转移技术、胚胎移植技术、细胞与组织培养技术等。

细胞工程的定义应用细胞131

酶工程的定义

在酶反应器中,利用酶的生物催化作用,生产出人类所需要产品的一门科学技术。例如过去蔗糖几乎全部通过加工甘蔗或甜菜获得,但现在科学家利用α-淀粉酶等多种酶的催化作用,在酶反应器中将淀粉转化成和蔗糖具有同样甜度的高果糖浆。酶工程的定义在酶反应132

发酵工程发酵工程也称为微生物工程，是在最适合条件下，对单一菌种进行培养，是生物特定产品的一种生物工艺。发酵工程发酵工程也称为微生物工程，是在133单克隆抗体技术现代生物技术核心重组DNA技术生物工程药物是指运用重组DNA技术和单克隆抗体技术生产的多肽、蛋白质、激素和酶类药物以及疫苗、单抗和细胞生长因子类药物。单克隆抗体技术现代生物技术核心重组DNA技术生物工程药物134工程菌（或细胞）的大量培养与目的蛋白的生产基因工程是生物技术中最重要的一种。目的基因制备载体的选择和制备DNA片段重组连接重组DNA导入受体细胞转化子的筛选DNA重组体的筛选DNA重组体的鉴定工程菌（或细胞）的大量培养与目的蛋白的生产基因工程是生物技术135

(一)基因载体（Vector）1、定义：携带目的基因片段进入受体细胞的DNA一个理想的载体应具备以下几个条件：（a）本身是一个复制子，能自我复制。载体在进入受体细胞后，可自身复制或插入到基因组中，随受体细胞的基因组一起复制。（b）分子量小，小分子的DNA制备时不易损伤，小分子DNA限制酶的切点少。（c）目的基因与载体连结后，可在受体细胞内转录，翻译成蛋白质产物（表达载体）。（d）能给寄主（受体）细胞提供可选择的标记：如抗药性，营养缺陷型或显色表型等，以利于筛选。

（E）具有多克隆位点，便于目的基因片段与载体连接。(F)拷贝数多，便于分离提纯。(一)基因载体（Vector）1、定义：携带目的136

2、载体的分类

功能分类：克隆载体表达载体转移载体探针载体组成元件的来源分类:

质粒（plasmid）载体噬菌体载体：如λ噬菌体载体、M13噬菌体载体杂合载体(如粘粒cosmid)病毒性载体：逆转录病毒载体、腺病毒载体等人工染色体载体

2、载体的分类

功能分类：克1373、克隆载体（cloningvector）（1）克隆载体的功能：用来克隆和扩增DNA片段（目的基因）的载体具备条件：（a）必须是一个复制子，能在受体细胞中复制。复制起点Ori复制区复制终点term（b）带有抗药性基因Tetr：编码膜蛋白，阻止Tet进入细胞Ampr：β-内酰胺环水解酶。Kanr：

Kan～P,neo～pCamr：氯霉素乙酰基转移酶

3、克隆载体（cloningvector）（1）克隆载体的138

（C）具有多克隆位点（multiplecloningsits，MCS）载体上含有的一个人工合成的DNA片段，其上含有数个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位具备条件：是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成。这些位点在载体上都是单一位点（d）可导入受体细胞（C）具有多克隆位点（multiplecloni139pBR322质粒有两个抗药性基因，每个抗性基因中均含有单克隆位点，外源DNA插入后使相应的抗性基因失活，宿主细胞失去相应的抗药性，不能在含相应抗生素的培养基中生长，这一现象称为插入失活。pBR322质粒有两个抗药性基因，140质粒pBR322的抗性基因筛选示意图质粒pBR322的抗性基因筛选示意图1414、表达载体（expressingvector）（1）表达载体的功能：在受体细胞中表达外源基因的载体

结构：克隆载体+表达构件—原核生物表达真核生物表达

oriampr基础上加转录和翻译相关elementMCS

（2）原核（大肠杆菌）表达载体表达载体=克隆载体+表达元件“启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号”

“P—RBS—MCS—term”4、表达载体（expressingvector）（1）表达142原核表达载体结构示意图用T7表达系统质粒的基本结构元件原核表达载体结构示意图用T7表达系统质粒的基本结构元件143

(3)哺乳动物表达载体（1）病毒载体整合性载体：外源基因通过这种载体与宿主细胞的染色体整合。如pSV系列载体游离型载体：外源基因与这种载体重组后，以病毒颗粒形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒和逆转录病毒等。（2）质粒载体常常是穿梭质粒载体。既含原核的复制位点和筛选标记，又含真核的复制位点筛选标记和表达构件。(3)哺乳动物表达载体（1）病毒载体1441.直接从染色体DNA分离

如果物理图谱已确定，可用限制酶直接从原核生物，噬菌体及动物病毒基因组切取目的基因。（二）目的基因的来源（Isolation）1.直接从染色体DNA分离如果物理图谱已确定，1452.化学合成要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列

基因小2.化学合成要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸1463.从cDNA文库（cDNA文库）筛选目的基因

将不同细胞类型或不同阶段细胞的mRNA逆转录成cDNA后,将所有cDNA混合体与载体进行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合体称为cDNA文库。

3.从cDNA文库（cDNA文库）筛选目的基因147mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTTmRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子148

4.从基因组文库（genomiclibrary）筛选目的基因

采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增，得到的分子克隆的混合体称为“基因组文库”。从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。从细胞中分离基因组DNA、用Sau3A或MboI部分消化、回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。4.从基因组文库（genomiclibrary）筛选目149组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*从基因组DNA文库获取目的基因组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分1505.PCR或RT-PCR

根据目的基因的核苷酸序列设计一对引物以基因组DNA为模板经PCR扩增目的基因。以mRNA或RNA为模板经RT-PCR扩增目的基因。5.PCR或RT-PCR151（三）限制酶的应用

限制酶(restrictionenzyme):一类专门切割DNA的酶。是一类能识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并与其特异结合，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。

“Restrictionendonucleasesarebacteriaenzymewhichcut(hydrolyze)DNAintodefinedandreproduciblefragments.Inbacteriatheyformpartoftherestriction—modificationdefensemechanismagainstforeignDNA.Theyarebasicgenecloningtools.”

1.定义：（三）限制酶的应用1.定义：1522.限制酶的识别和切割位点识别：

4～6碱基对，多具有回文结构（palindrom），少数识别长序列为8个或8个以上碱基对，有的存在简并序列（有的核苷酸位点可以不同）。Sau3AI

EcoRI

PstⅠSmaⅠ5′GATCGAATTCCTGCAGCCCGGG3′3′CTAGCTTAAGGACGTCGGGCCC5′

简并序列：GTYRAC——Y=C/TR=G/AYR=CG/CA/TG/TA∴HindⅡ可识别4个特定序列

2.限制酶的识别和切割位点识别：4～6碱基对，多具有回文1533.限制酶的切割方式(1)识别序列内两条链上交错切割，产生单链突出的粘性末端(2)对称处同时切断DNA的两条链，产生平端DNA片段3.限制酶的切割方式(1)识别序列内两条链上交错切割，产生单1544.限制酶的切割结果切割的结果：产生三种不同的末端平末端—bluntend5’突出—5’-protruding（cohesiveend）3’突出—3’-protruding（overhangtail）切割的化学本质：磷酸二酯键的断裂,形成含5’—P和3’—OH末端的两个DNA片段。对一特定的DNA而言，识别序列碱基对少的，则切点数多，产生的片段小。4.限制酶的切割结果切割的结果：产生三种不同的末端155第十九章药物研究的生物化学基础课件156(四)重组体的构建1.粘性末端连接：用同一种酶裂解后，产生相同的粘性末端，很容易按照碱基配对的原则以氢键结合，在T4DNA连接酶的作用下，共价闭合。

连接方式：

定向取代

双向插入（正向/反向）（双酶切）（单酶切）措施：载体酶切后，用AP（碱性磷酸酶）水解5’端的磷酸基团防止载体的自身环化。(四)重组体的构建1.粘性末端连接：用157

同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接

G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ的识别序列及切割部位G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ含目的基因的DNA片段BamHⅠGC

C

T

A

G5'3'5'3'3'5'5'3'5'3'5'3'G

G

A

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CC

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T

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G

G

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C

G目的基因片段混合、退火G

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G

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C

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G

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GG

C

C

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G质粒载体含目的基因的重组质粒G

C

C

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G

G

A

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C

C

GDNA连接酶同一种限制酶切割DNA产生的粘性末端的连接GGAT158双酶切DNA片段粘性末端的连接

G

G

A

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CC

C

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GBamHⅠBamHⅠBamHⅠG

C

C

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G5'3'5'3'5'5'5'3'5'3'3'G

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A

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G目的基因片段混合、退火G

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C

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G重组质粒DNA连接酶EcoRIEco

RI5'

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