生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件

第十三章DNA的生物合成第十三章DNA的生物合成DNA的生物合成复制：以DNA作为模板指导的DNA合成，即将DNA携带的信息传至子代DNA。反转录：DNA合成也可以RNA为模扳指导合成作用，见于RNA病毒。修复合成：当各种因素引起DNA损伤时，损伤DNA可修复合成，校正错误，完成正确合成，以保持DNA结构的稳定性和遗传信息的准确性。DNA的重组与克隆DNA的生物合成复制：以DNA作为模板指导的DNA合成，即将细胞、个体及物种的遗传特性要在代代相传中得到维持，有赖于遗传物质的完整、准确的复制并分配至子代细胞。细胞、个体及物种的遗传特性要在代代相传中得到维持，有

现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点——在生命有机体中，基因是唯一能够复制，并且能永远存在的单位，而其意义最终须通过蛋白质才体现出来。从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则。现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点——在生13.1DNA的复制亲本DNA双螺旋解开，两条链分别作为模板，合成子代DNA分子的过程DNA复制过程的研究一般采用三类系统

ΦX174DNA或质粒DNA及其完成复制所必需的酶、蛋白质及其因子构成的体外系统以E.coli为模式生物，研究原核生物的复制以酵母和动物病毒为模式生物研究真核生物的DNA复制13.1DNA的复制亲本DNA双螺旋解开，两条链分别作为模13.1.1DNA的半保留复制即新的双链DNA中，一股链来自模板，一股链为新合成的复制的这种方式可保证亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，体现了遗传的保守性1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制13.1.1DNA的半保留复制即新的双链DNA中，一股链来生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件13.1.2DNA复制的起点和方向基因组能独立进行复制的单位称为复制子，每个复制子都含有控制复制起始的起点，可能还有终止复制的终点大多数原核生物染色体DNA的复制是双向，形成复制眼，单向复制的特殊形式，称为滚动环式真核生物染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子。13.1.2DNA复制的起点和方向基因组能独立进行复制的单生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件DNA复制的特点与条件（1）半保留复制（2）有一定的复制起始点（3）需要引物（4）双向复制（5）半不连续复制（6）复制方向5´→3´DNA复制的特点与条件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点（termination,，ter）oriterABCA.环状双链DNA及复制起始点oriterA13.2原核生物DNA的复制原料：dNTP，Mg2+，双链DNA模板引物：小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游离的3´-OH。引物酶：用于合成复制所必需的RNA引物解螺旋酶：DnaB,由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（OriC）上解开双螺旋。单链结合蛋白：稳定已经解开成两股的DNA单链。拓扑异构酶：解DNA分子中存在打结，缠绕、连环的超螺旋现象。DNA连接酶：连接DNA双链中的单链缺口DNA聚合酶：复制酶，兼有校读、纠错13.2原核生物DNA的复制原料：dNTP，Mg2+，13.2.1参与原核DNA复制的酶和蛋白质13.2.1参与原核DNA复制的酶和蛋白质（1）原核生物的DNA聚合酶polIpolIIpolIII不同种类亚基数目1≥7≥10每个细胞的分子数40020生物学活性10.05155´→3´聚合酶活性＋＋＋3´→5´外切酶活性＋＋＋5´→3´外切酶活性＋－－聚合速度（核苷酸/S）16~2040250~1000连续合成能力（核苷酸）3~2001500≥5000功能

校正，去除RNA引物应急修复主要酶（1）原核生物的DNA聚合酶polIpolIIpolI（A）5´→3´聚合酶催化磷酸二酯键生成，延长子链（B）3´→5´外切酶切除子链3’端一个错配的碱基，即时校读（C）5´→3´外切酶切除子链5’端一段序列，包括引物和突变的片段（A）5´→3´聚合酶①

DNA聚合酶Ⅰ:

单体酶，多肽链内含一个锌离子，多功能酶，用于切除引物RNA，并填补留下的空隙

53聚合酶功能（对脱氧核苷酸的选择）；35外切酶活性（对双链无作用，校对功能；但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）

53外切酶活性（双链有效，主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其空隙的填补）

在DNA链的3形成焦磷酸解（生理意义不大）；无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。①DNA聚合酶Ⅰ:酶催化新加入的脱氧核苷酸单位的α-磷酸基与引物的3´-OH共价结合，并从新加入的脱氧核苷三磷酸分子上释放焦磷酸，因此合成的方向是从5´端到3´端。所产生的焦磷酸随即被细胞中的焦磷酸酶分解产生无机磷酸，推动聚合反应的完成酶催化新加入的脱氧核苷酸单位的α-磷酸基与引物的3´Klenow片段，含DNA聚合酶和3´→5´核酸外切酶活性Klenow片段，含DNA聚合酶和3´→5´核酸外切②

DNA聚合酶Ⅱ：

多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有3´5´外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。③

DNA聚合酶Ⅲ：

原核生物DNA复制的主要聚合酶，该酶由10种亚基组成，其中、、形成全酶的核心酶。

具有5´3´DNA聚合酶活性（亚基，速率高）；

具有3´5´外切酶（亚基）的校对功能，提高DNA复制的保真性；

具有53外切酶活性（单链有效，其意义未知）。④DNA聚合酶IV和V：1999年发现，当DNA严重损伤时，诱导产生。②DNA聚合酶Ⅱ：β-滑动夹子将正在复制的DNA固定在夹子中心，并能随DNA复制沿着模板DNA链滑动使DNA聚合酶不易从模板脱离，有利于DNA的连续复制β-滑动夹子（2）参与原核生物DNA复制的其他酶和蛋白质（2）参与原核生物DNA复制的其他酶和蛋白质①

引物合成酶（引发酶）

此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。②DNA连接酶

若双链DNA中一条链有切口，一端是3´-OH，另一端是5´-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能在模板链上连接DNA和DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNA。①引物合成酶（引发酶）大肠杆菌和其它细菌的DNA连接连接酶的反应机制

酶+NAD+（ATP）↔酶-AMP+烟酰胺单核苷酸（PPi）

酶-AMP+P-5´-DNA↔酶+AMP-P-5´-DNADNA-3´-OH+AMP-P-5´-DNA↔DNA-3´-O-P-5´-DNA+AMPDNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用连接酶的反应机制③拓扑异构酶催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其他转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。连环数：在双螺旋DNA中，一条链以右手螺旋旋绕另一条链缠绕的次数。③拓扑异构酶108局部解链后改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链108局部解链后改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件④解螺旋酶（解链酶）：通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。rep蛋白沿3´→5´移动，而解螺旋酶I、II、III沿5´→3´移动。⑤其它蛋白因子

单链结合蛋白（SSB-single-strandbindingprotein）引发前体④解螺旋酶（解链酶）：单链结合蛋白（SSB-single-strandbindingprotein）

稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。引发前体

它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n´、n´´和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。

引发体可以沿模板链5´3´方向移动，具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。

移动和引发均需要ATP提供能量，n´蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。单链结合蛋白（SSB-single-strandbindi生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件冈崎片段

在DNA复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只能是断续的合成5´3´的多个短片段，这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。

冈崎片段：真核生物中100-200个核苷酸（核小体的DNA单位）。原核生物中1000-2000个核苷酸（相当于一个顺反子）。冈崎片段13.2.2大肠杆菌DNA复制的起始大肠杆菌的复制的起始点称OriC由DnaB（解螺旋酶）在DnaA和DnaC协助下解链，形成复制叉（replicationfork），SSB结合并稳定解开的单股DNA链；

引物酶（DnaG）与上述因子、酶构成引发体（primosome），并合成RNA引物。

解链造成的超螺旋，由拓扑异构酶实现超螺旋的转型，即把正超螺旋转变为有利于复制的负超螺旋。13.2.2大肠杆菌DNA复制的起始大肠杆菌的复制的起始点DnaA辨认结合于AT区，AT区DNA解链。DnaB在DnaC协同下，结合于解链区，沿5´→3´移动，解开DNA双链，SSBP参与，形成复制叉。DnaA辨认结合于AT区，AT区DNA解链。Dna复制叉的结构及参与复制的酶与因子复制叉的结构及参与复制的酶与因子13.2.3大肠杆菌DNA链的延长这个过程由DNA聚合酶III催化，它是主要的复制酶。前导链：为连续合成，合成方向与解链方向一致，它的模板DNA链是5´→3´链。后随链：不连续合成，在RNA引物基础上分段合成DNA小片段（冈崎片段），方向与解链方向相反，它的模板DNA链是3´→5´链。13.2.3大肠杆菌DNA链的延长这个过程由DNA聚合酶I生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件复制时，从一个固定的起点（origin）开始复制，此时双链DNA解开形成两条单链，分别作为模板进行复制，由此形成的结构很像叉子，被形象地称作复制叉（replicationfork）复制时，从一个固定的起点（origin）开始复制，此随从链的合成随从链的合成领头链的合成领头链的合成生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件13.2.4大肠杆菌DNA复制的终止由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DNA连接酶将DNA片段连接起来当一个复制叉先期到达终止区时，其复制会停止，待另一个复制叉到达同一位置，两个复制叉相遇，即完成了整个DNA的复制过程13.2.4大肠杆菌DNA复制的终止由DNA聚合酶I完成切生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件13.3真核生物DNA的复制真核生物DNA复制的基本过程与原核生物相似，但参与复制的酶和蛋白质与原核生物不同，复制起始的调控更加复杂。13.3真核生物DNA的复制真核生物DNA复制的基本过程与13.3.1参与真核DNA复制的酶和蛋白质真核生物DNA聚合酶主要有5种α（Ⅰ），β（Ⅳ），γ（M），δ（Ⅲ），ε（Ⅱ）真核生物DNA聚合酶的酶促反应与原核生物DNA聚合酶相似，均以4种dNTP为底物，需要Mg2+激活，要求有模板和引物，链的延伸方向为5´→3´，也按半不连续的机制分别合成前导链和后随链13.3.1参与真核DNA复制的酶和蛋白质真核生物DNA聚DNA聚合酶的类型α（Ⅰ）β（Ⅳ）γ（M）δ（Ⅲ）ε（Ⅱ）相对分子质量/103100~2204560122亚基数4123~54聚合酶活性5´→3´＋＋＋＋＋外切（校正）酶活性3´→5´－－＋＋＋引物（合成）酶活性＋－－－－持续合成能力中高高有PCNA时高高对抑制剂敏感蚜肠霉素双脱氧TTP双脱氧TTP蚜肠霉素蚜肠霉素细胞定位核核线粒体核核DNA聚合酶的类型α（Ⅰ）β（Ⅳ）γ（M）δ（Ⅲ）ε（Ⅱ）相13.3.2真核生物DNA复制的起始细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。13.3.2真核生物DNA复制的起始细胞能否分裂，决定于进复制的起始真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与，还需拓扑酶和复制因子（replicationfactor，RF）。增殖细胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen,PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。复制的起始复制的延长复制的终止染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。复制的延长生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件（1）SV40DNA的复制①2分子由SV40基因组编码的T抗原六聚体作为起始蛋白（相当于E．coli的DnaB蛋白），在ATP的存在下与SV40复制起始区结合，使起始区的DNA解链。②复制蛋白A（replicationproteinA，RPA）作为SSB与单链区结合，进一步提高T抗原的解旋酶活性，致使解链区不断扩大，但真核生物的RPA与单链DNA结合没有协同效应。③DNApolα-引物酶复合物与T抗原/RPA复合物结合，合成前导链约10nt的RNA引物，和约30nt的DNA。（1）SV40DNA的复制④复制因子(replicationfactor，RFC)先与新合成的DNA3´端结合，随后PCNA取代polα-引物酶结合到DNA模板上，前导链的合成暂时中断。⑤polδ结合到PCNA-RFC复合物上，由于polδ具有校对能力，PCNA与模板DNA结合牢固，该复合物可以持续地、准确地合成前导链。同时，polα-引物酶结合到后随链的模板上，开始后随链的合成。后随链的进一步延伸，也需要用PCNA-polδ或PCNA-polδ取代polα-引物酶⑥FEN-1-RNaseHl负责切除RNA引物，DNA连接酶I负责连接相邻的冈崎片段，拓扑异构酶I负责清除复制叉移动形成的正超螺旋，拓扑异构酶Ⅱa和Ⅱb则负责解开连环体，促进最后的2个以共价键相连的连环体DNA分开④复制因子(replicationfactor生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件（2）酵母DNA的复制酵母DNA复制的起点称自主复制序列（autonomouslyreplicationgsequence，ARS）酵母DNA复制的起始需要起点识别复合物（originrecognizingcomplex，ORC）参与，该复合体由6个亚基组成。相当于原核生物的DnaA。（2）酵母DNA的复制生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件13.3.3真核生物DNA复制的特点原核生物和真核生物DNA复制的基本过程是相似的，但也有一些明显的差别共同点①均为半保留复制；②均为半不连续复制；③均需要解旋酶解开双螺旋，并由SSB同单链区结合；④均需要拓扑异构酶消除解螺旋形成的扭曲张力；⑤均需要RNA引物；⑥新链合成均有校对机制13.3.3真核生物DNA复制的特点原核生物和真核生物DN不同点①原核生物为单起点复制，真核生物为多起点复制。原核生物的复制子大而少，真核生物的复制子小而多。②原核生物复制叉移动的速度为900nt/s，真核生物复制叉移动的速度为50nt/s。③原核生物冈崎片段的大小为1000～2000nt，真核生物冈崎片段的大小为100～200nt。④真核细胞的DNA聚合酶和蛋白质因子的种类比原核细胞多，引物酶活性由DNApolα的两个小亚基承担。⑤原核细胞在第一轮复制还没有结束的时候，就可以在复制起始区启动第二轮复制。真核细胞的复制有复制许可因子控制，复制周期不可重叠。

⑥原核生物的DNA为环形分子，DNA复制时不存在末端会缩短的问题。真核生物的DNA为线形分子，DNA复制肘末端会缩短，需要端粒酶解决线形DNA的末端复制问题。不同点DNA复制与核小体组装真核生物的染色体结构复杂，其DNA与组蛋白构成核小体，DNA缠绕于组蛋白核心外，每个核小体上的DNA相当于两个负超螺旋。复制时的冈崎片段长约200bp，恰好相当于一个核小体DNA的长度。DNA复制时，组蛋白需同步合成，并与DNA组装成核小体。DNA复制与核小体组装原核生物和真核生物DNA复制调控的比较原核生物DNA复制的速率与其生长环境有关，迅速增殖的细胞通常在一次复制尚未完成的情况下，即可开始另一次复制，但复制叉上DNA链的延伸速度基本恒定。真核生物DNA复制的调控至少有3个层次，其一是细胞周期水平的调控；其二是染色体水平的调控；其三是复制子水平的调控。原核生物和真核生物DNA复制调控的比较端粒DNA的复制真核生物线性染色体的两个末端具有特殊的结构，称为端粒，它是由许多成串的重复序列所组成。

端粒酶是一种含有RNA链的逆转录酶，它以自身的RNA链为模板合成DNA端粒结构。一条链是由重复序列TTTTGGGG组成的，称TG链

另一条链是由重复序列AAAACCCC组成的，称AC链端粒在决定细胞的寿命中起重要作用，体细胞随着分化而失去端粒酶的活性，端粒缩短。这些重复序列的少量丢失，不会伤及基因的结构，如果短到一定程度就引起细胞停止生长或凋亡。端粒DNA的复制生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件分裂旺盛的细胞存在端粒酶（telomerase），这种酶是蛋白质和RNA组成的复合物，其蛋白质部分能以其RNA为模板催化合成DNA链。分裂旺盛的细胞存在端粒酶（telomerase），这13.4逆转录作用逆转录也称反转录，是以RNA为模板合成DNA的特殊复制方式（在某些生物如鸡的肉瘤病毒、HIV等）它们的遗传信息载体是RNA而不是DNA。因此，在感染细胞时，首先经过逆转录作用成为双链DNA，才能整合到宿主基因组中去。13.4逆转录作用逆转录也称反转录，是以RNA为模板合成D生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性（1）RNA指导的DNA聚合酶活性（2）DNA指导的DNA聚合酶活性（3）核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿5´→3´和3´→5´两个方向起核酸外切酶的作用。cDNA

几乎所有真核生物mRNA分子的3´末端都有一段polyA,当加入寡聚dT作为引物时，mRNA就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与其互补的DNA，称为cDNA。逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性13.5DNA的损伤与修复DNA的损伤DNA在复制时产生错配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏DNA的双螺旋结构。从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。DNA损伤的修复四种修复途径：直接修复（光复活）、切除修复、复组修复和诱导修复（暗修复）。13.5DNA的损伤与修复DNA的损伤13.5.1DNA损伤的产生DNA复制具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/109～1/1010，即每109～1010个核苷酸才出现一个错误DNA的损伤（突变）大多数是自发的，是进化与分化的基础外界环境因素，包括化学诱变剂和物理因子以及代谢过程中产生的自由基等影响13.5.1DNA损伤的产生DNA复制具有高度精确性，在大UV物理因素：紫外线（ultraviolet，UV）、各种辐射UV物理因素：紫外线（ultraviolet，UV）、化学因素化学因素突变的分子改变类型：

错配、缺失、插入、重排（1）错配：DNA分子上的碱基错配称点突变。

转换：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。

颠换：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。突变的分子改变类型：生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件（2）缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。缺失或插入都可导致框移突变。框移突变：指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。谷酪蛋丝5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙缬组缬正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C（2）缺失、插入和框移谷酪（3）重排DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。由基因重排引起的两种地中海贫血基因型（3）重排由基因重排引起的两种地中海贫血基因型13.5.2DNA损伤的修复是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态修复的主要类型光修复（lightrepairing）切除修复（excisionrepairing）重组修复（recombinationrepairing）SOS修复13.5.2DNA损伤的修复是对已发生分子改变的补偿措施，直接修复：如光复活酶,可以把嘧啶二聚体恢复正常状态。切除修复：找出损伤位置并切除，进行修复合成并连接。重组修复：先复制再修复。子代链在对应模板链的损伤处留下缺口，先将同源母链DNA上相应的核苷酸片段转移替补，然后再合成一段序列填充缺口。SOS系统：复杂的应急反应。既有避免差错的修复又有引起差错的修复，后者有高变异率但也增加了生存机会。直接修复：生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件（a）DNA糖基化酶切除损伤的碱基产生无碱基酸（b）无碱基核酸内切酶在无碱基酸处切开产生切口。（c）DNA聚合酶Ⅰ将无碱基酸切除并填补缺口。（d）DNA连接酶连接切口。（a）DNA糖基化酶切除损伤的碱基产生无碱基酸生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件13.6DNA的重组与克隆DNA的重组高等生物在细胞减数分裂时，同源染色体之间可以进行DNA片段的交换，病毒、噬菌体或质粒DNA插入（整合到）宿主的染色体DNA的克隆就是获得遗传背景完全相同的分子或个体的“拷贝”13.6DNA的重组与克隆DNA的重组13.6.1DNA的重组同源重组发生在同源序列之间、非特异性重组交换区具有相同或相似的序列两个DNA分子相同的部位、不同部位（异位重组）位点特异性重组可以将两个短的DNA特定序列（即特异位点）之间的基因从染色体上切除或组合到染色体另一个特定位点13.6.1DNA的重组同源重组生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件13.6.2DNA的克隆在体外利用酶学方法将感兴趣的物种来源的DNA片段转移到能自主复制的载体,形成重组的DNA分子,并在宿主细胞中增殖。这种复制基因或DNA片段以产生相同DNA分子“拷贝”的技术，称为重组DNA技术或DNA克隆。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合，获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning），即无性繁殖。13.6.2DNA的克隆在体外利用酶学方法将感兴趣的物种来PCR（聚合酶链式反应）

概念：一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。

原理：DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

应用：遗传病和疑难病的诊断、孕妇的产前检查、病原体检查、法医和刑侦鉴定、基因探针的制备、基因组测序、染色体步查、cDNA库的构建、基因的定点诱变、基因突变的分析、基因的分离和克隆等PCR（聚合酶链式反应）生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件基因克隆的基本条件

工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、DNA酶，等

目的基因：cDNA或基因组DNA

载体：质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等

宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞基因克隆的基本条件限制性核酸内切酶

存在于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。常用的是II类限制性内切酶，许多限制性核酸内切酶II的识别序列为回文结构配伍末端（compatibleend）：不同限制性内切酶产生的相同粘性末端DNA聚合酶

大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）、Klenow片段（Klenow酶）、T4DNA聚合酶以及Taq酶等DNA连接酶T4连接酶：可用于粘端与平端的连接限制性核酸内切酶基因组DNA（genomicDNA）

代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组DNA。cDNA（complementaryDNA）

指体外经反转录合成的，与RNA（常指mRNA）互补的单链DNA,单链cDNA进而合成双链cDNA。质粒（plasmid）

存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。基因组DNA（genomicDNA）基因工程基本过程1、目的基因的提取：分离或合成外源基因2、体外重组：外源基因与载体连接，构建重组DNA分子3、转化（转导、转染）：重组DNA分子导入细胞4、筛选与鉴定5、扩增该克隆DNA6、基因表达：控制适当条件，外源DNA表达7、获得表达产物或转基因动物、转基因植物DNA重组技术基因工程基本过程DNA重组技术生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊

美国转基因猪，其体内含有人类的基因，乳汁含有人体蛋白fatorⅧ。只需300～600只这样的母猪就能满足全世界对这种蛋白的需求。乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊美国转基因猪，其体内含乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我国采用转基因技术，培育出抗病毒的甜椒。甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我国采用转基因技术，培通过研究“基因异常”的耗子将帮助研究人类的癌症、糖尿病和高血压等慢性疾病与遗传的关系。通过研究“基因异常”的耗子将帮助研究人类的癌症、糖尿在猴子的未受精卵中加入附加基因，并利用它成功培育出健康活泼的小猴“安迪”。

通过对“安迪”的研究我们可以简单地引进如老年性痴呆病的基因、帕金森病基因等，加快针对这类疾病疫苗的开发研究。在猴子的未受精卵中加入附加基因，并利用它成功培育出健人类医学史上第一次通过基因治疗在阿尚蒂身上创造的奇迹般的成功，是一场医学领域的革命，这次临床试验正式标记着基因治疗的解禁的开始随后，世界范围内掀起了一股基因治疗研究的热潮，基因治疗得到了令人意想不到的发展，已经成为生物科学和临床科学领域的热门课题。人类医学史上第一次通过基因治疗在阿尚蒂身上创造的奇迹通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育第十三章DNA的生物合成第十三章DNA的生物合成DNA的生物合成复制：以DNA作为模板指导的DNA合成，即将DNA携带的信息传至子代DNA。反转录：DNA合成也可以RNA为模扳指导合成作用，见于RNA病毒。修复合成：当各种因素引起DNA损伤时，损伤DNA可修复合成，校正错误，完成正确合成，以保持DNA结构的稳定性和遗传信息的准确性。DNA的重组与克隆DNA的生物合成复制：以DNA作为模板指导的DNA合成，即将细胞、个体及物种的遗传特性要在代代相传中得到维持，有赖于遗传物质的完整、准确的复制并分配至子代细胞。细胞、个体及物种的遗传特性要在代代相传中得到维持，有

现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点——在生命有机体中，基因是唯一能够复制，并且能永远存在的单位，而其意义最终须通过蛋白质才体现出来。从DNA到蛋白质，遗传信息的流动遵循着中心法则。现代生物化学和分子生物学的一个最基本的观点——在生13.1DNA的复制亲本DNA双螺旋解开，两条链分别作为模板，合成子代DNA分子的过程DNA复制过程的研究一般采用三类系统

ΦX174DNA或质粒DNA及其完成复制所必需的酶、蛋白质及其因子构成的体外系统以E.coli为模式生物，研究原核生物的复制以酵母和动物病毒为模式生物研究真核生物的DNA复制13.1DNA的复制亲本DNA双螺旋解开，两条链分别作为模13.1.1DNA的半保留复制即新的双链DNA中，一股链来自模板，一股链为新合成的复制的这种方式可保证亲代的遗传特征完整无误的传递给子代，体现了遗传的保守性1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制13.1.1DNA的半保留复制即新的双链DNA中，一股链来生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件13.1.2DNA复制的起点和方向基因组能独立进行复制的单位称为复制子，每个复制子都含有控制复制起始的起点，可能还有终止复制的终点大多数原核生物染色体DNA的复制是双向，形成复制眼，单向复制的特殊形式，称为滚动环式真核生物染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子。13.1.2DNA复制的起点和方向基因组能独立进行复制的单生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件DNA复制的特点与条件（1）半保留复制（2）有一定的复制起始点（3）需要引物（4）双向复制（5）半不连续复制（6）复制方向5´→3´DNA复制的特点与条件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点（termination,，ter）oriterABCA.环状双链DNA及复制起始点oriterA13.2原核生物DNA的复制原料：dNTP，Mg2+，双链DNA模板引物：小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游离的3´-OH。引物酶：用于合成复制所必需的RNA引物解螺旋酶：DnaB,由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（OriC）上解开双螺旋。单链结合蛋白：稳定已经解开成两股的DNA单链。拓扑异构酶：解DNA分子中存在打结，缠绕、连环的超螺旋现象。DNA连接酶：连接DNA双链中的单链缺口DNA聚合酶：复制酶，兼有校读、纠错13.2原核生物DNA的复制原料：dNTP，Mg2+，13.2.1参与原核DNA复制的酶和蛋白质13.2.1参与原核DNA复制的酶和蛋白质（1）原核生物的DNA聚合酶polIpolIIpolIII不同种类亚基数目1≥7≥10每个细胞的分子数40020生物学活性10.05155´→3´聚合酶活性＋＋＋3´→5´外切酶活性＋＋＋5´→3´外切酶活性＋－－聚合速度（核苷酸/S）16~2040250~1000连续合成能力（核苷酸）3~2001500≥5000功能

校正，去除RNA引物应急修复主要酶（1）原核生物的DNA聚合酶polIpolIIpolI（A）5´→3´聚合酶催化磷酸二酯键生成，延长子链（B）3´→5´外切酶切除子链3’端一个错配的碱基，即时校读（C）5´→3´外切酶切除子链5’端一段序列，包括引物和突变的片段（A）5´→3´聚合酶①

DNA聚合酶Ⅰ:

单体酶，多肽链内含一个锌离子，多功能酶，用于切除引物RNA，并填补留下的空隙

53聚合酶功能（对脱氧核苷酸的选择）；35外切酶活性（对双链无作用，校对功能；但在正常聚合条件下，此活性不能作用于生长链）

53外切酶活性（双链有效，主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其空隙的填补）

在DNA链的3形成焦磷酸解（生理意义不大）；无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换。①DNA聚合酶Ⅰ:酶催化新加入的脱氧核苷酸单位的α-磷酸基与引物的3´-OH共价结合，并从新加入的脱氧核苷三磷酸分子上释放焦磷酸，因此合成的方向是从5´端到3´端。所产生的焦磷酸随即被细胞中的焦磷酸酶分解产生无机磷酸，推动聚合反应的完成酶催化新加入的脱氧核苷酸单位的α-磷酸基与引物的3´Klenow片段，含DNA聚合酶和3´→5´核酸外切酶活性Klenow片段，含DNA聚合酶和3´→5´核酸外切②

DNA聚合酶Ⅱ：

多亚基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有3´5´外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。③

DNA聚合酶Ⅲ：

原核生物DNA复制的主要聚合酶，该酶由10种亚基组成，其中、、形成全酶的核心酶。

具有5´3´DNA聚合酶活性（亚基，速率高）；

具有3´5´外切酶（亚基）的校对功能，提高DNA复制的保真性；

具有53外切酶活性（单链有效，其意义未知）。④DNA聚合酶IV和V：1999年发现，当DNA严重损伤时，诱导产生。②DNA聚合酶Ⅱ：β-滑动夹子将正在复制的DNA固定在夹子中心，并能随DNA复制沿着模板DNA链滑动使DNA聚合酶不易从模板脱离，有利于DNA的连续复制β-滑动夹子（2）参与原核生物DNA复制的其他酶和蛋白质（2）参与原核生物DNA复制的其他酶和蛋白质①

引物合成酶（引发酶）

此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。②DNA连接酶

若双链DNA中一条链有切口，一端是3´-OH，另一端是5´-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能在模板链上连接DNA和DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNA。①引物合成酶（引发酶）大肠杆菌和其它细菌的DNA连接连接酶的反应机制

酶+NAD+（ATP）↔酶-AMP+烟酰胺单核苷酸（PPi）

酶-AMP+P-5´-DNA↔酶+AMP-P-5´-DNADNA-3´-OH+AMP-P-5´-DNA↔DNA-3´-O-P-5´-DNA+AMPDNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用连接酶的反应机制③拓扑异构酶催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其他转变方面起重要作用。除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。连环数：在双螺旋DNA中，一条链以右手螺旋旋绕另一条链缠绕的次数。③拓扑异构酶108局部解链后改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链108局部解链后改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件④解螺旋酶（解链酶）：通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。rep蛋白沿3´→5´移动，而解螺旋酶I、II、III沿5´→3´移动。⑤其它蛋白因子

单链结合蛋白（SSB-single-strandbindingprotein）引发前体④解螺旋酶（解链酶）：单链结合蛋白（SSB-single-strandbindingprotein）

稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。引发前体

它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n´、n´´和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。

引发体可以沿模板链5´3´方向移动，具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的合成。

移动和引发均需要ATP提供能量，n´蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。单链结合蛋白（SSB-single-strandbindi生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件冈崎片段

在DNA复制过程中，领头链能连续合成，而随后链只能是断续的合成5´3´的多个短片段，这些不连续的小片段以其发现者的名字命名为冈崎片段。

冈崎片段：真核生物中100-200个核苷酸（核小体的DNA单位）。原核生物中1000-2000个核苷酸（相当于一个顺反子）。冈崎片段13.2.2大肠杆菌DNA复制的起始大肠杆菌的复制的起始点称OriC由DnaB（解螺旋酶）在DnaA和DnaC协助下解链，形成复制叉（replicationfork），SSB结合并稳定解开的单股DNA链；

引物酶（DnaG）与上述因子、酶构成引发体（primosome），并合成RNA引物。

解链造成的超螺旋，由拓扑异构酶实现超螺旋的转型，即把正超螺旋转变为有利于复制的负超螺旋。13.2.2大肠杆菌DNA复制的起始大肠杆菌的复制的起始点DnaA辨认结合于AT区，AT区DNA解链。DnaB在DnaC协同下，结合于解链区，沿5´→3´移动，解开DNA双链，SSBP参与，形成复制叉。DnaA辨认结合于AT区，AT区DNA解链。Dna复制叉的结构及参与复制的酶与因子复制叉的结构及参与复制的酶与因子13.2.3大肠杆菌DNA链的延长这个过程由DNA聚合酶III催化，它是主要的复制酶。前导链：为连续合成，合成方向与解链方向一致，它的模板DNA链是5´→3´链。后随链：不连续合成，在RNA引物基础上分段合成DNA小片段（冈崎片段），方向与解链方向相反，它的模板DNA链是3´→5´链。13.2.3大肠杆菌DNA链的延长这个过程由DNA聚合酶I生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件复制时，从一个固定的起点（origin）开始复制，此时双链DNA解开形成两条单链，分别作为模板进行复制，由此形成的结构很像叉子，被形象地称作复制叉（replicationfork）复制时，从一个固定的起点（origin）开始复制，此随从链的合成随从链的合成领头链的合成领头链的合成生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件13.2.4大肠杆菌DNA复制的终止由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DNA连接酶将DNA片段连接起来当一个复制叉先期到达终止区时，其复制会停止，待另一个复制叉到达同一位置，两个复制叉相遇，即完成了整个DNA的复制过程13.2.4大肠杆菌DNA复制的终止由DNA聚合酶I完成切生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件13.3真核生物DNA的复制真核生物DNA复制的基本过程与原核生物相似，但参与复制的酶和蛋白质与原核生物不同，复制起始的调控更加复杂。13.3真核生物DNA的复制真核生物DNA复制的基本过程与13.3.1参与真核DNA复制的酶和蛋白质真核生物DNA聚合酶主要有5种α（Ⅰ），β（Ⅳ），γ（M），δ（Ⅲ），ε（Ⅱ）真核生物DNA聚合酶的酶促反应与原核生物DNA聚合酶相似，均以4种dNTP为底物，需要Mg2+激活，要求有模板和引物，链的延伸方向为5´→3´，也按半不连续的机制分别合成前导链和后随链13.3.1参与真核DNA复制的酶和蛋白质真核生物DNA聚DNA聚合酶的类型α（Ⅰ）β（Ⅳ）γ（M）δ（Ⅲ）ε（Ⅱ）相对分子质量/103100~2204560122亚基数4123~54聚合酶活性5´→3´＋＋＋＋＋外切（校正）酶活性3´→5´－－＋＋＋引物（合成）酶活性＋－－－－持续合成能力中高高有PCNA时高高对抑制剂敏感蚜肠霉素双脱氧TTP双脱氧TTP蚜肠霉素蚜肠霉素细胞定位核核线粒体核核DNA聚合酶的类型α（Ⅰ）β（Ⅳ）γ（M）δ（Ⅲ）ε（Ⅱ）相13.3.2真核生物DNA复制的起始细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。13.3.2真核生物DNA复制的起始细胞能否分裂，决定于进复制的起始真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与，还需拓扑酶和复制因子（replicationfactor，RF）。增殖细胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen,PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。复制的起始复制的延长复制的终止染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。复制的延长生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件（1）SV40DNA的复制①2分子由SV40基因组编码的T抗原六聚体作为起始蛋白（相当于E．coli的DnaB蛋白），在ATP的存在下与SV40复制起始区结合，使起始区的DNA解链。②复制蛋白A（replicationproteinA，RPA）作为SSB与单链区结合，进一步提高T抗原的解旋酶活性，致使解链区不断扩大，但真核生物的RPA与单链DNA结合没有协同效应。③DNApolα-引物酶复合物与T抗原/RPA复合物结合，合成前导链约10nt的RNA引物，和约30nt的DNA。（1）SV40DNA的复制④复制因子(replicationfactor，RFC)先与新合成的DNA3´端结合，随后PCNA取代polα-引物酶结合到DNA模板上，前导链的合成暂时中断。⑤polδ结合到PCNA-RFC复合物上，由于polδ具有校对能力，PCNA与模板DNA结合牢固，该复合物可以持续地、准确地合成前导链。同时，polα-引物酶结合到后随链的模板上，开始后随链的合成。后随链的进一步延伸，也需要用PCNA-polδ或PCNA-polδ取代polα-引物酶⑥FEN-1-RNaseHl负责切除RNA引物，DNA连接酶I负责连接相邻的冈崎片段，拓扑异构酶I负责清除复制叉移动形成的正超螺旋，拓扑异构酶Ⅱa和Ⅱb则负责解开连环体，促进最后的2个以共价键相连的连环体DNA分开④复制因子(replicationfactor生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件（2）酵母DNA的复制酵母DNA复制的起点称自主复制序列（autonomouslyreplicationgsequence，ARS）酵母DNA复制的起始需要起点识别复合物（originrecognizingcomplex，ORC）参与，该复合体由6个亚基组成。相当于原核生物的DnaA。（2）酵母DNA的复制生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件13.3.3真核生物DNA复制的特点原核生物和真核生物DNA复制的基本过程是相似的，但也有一些明显的差别共同点①均为半保留复制；②均为半不连续复制；③均需要解旋酶解开双螺旋，并由SSB同单链区结合；④均需要拓扑异构酶消除解螺旋形成的扭曲张力；⑤均需要RNA引物；⑥新链合成均有校对机制13.3.3真核生物DNA复制的特点原核生物和真核生物DN不同点①原核生物为单起点复制，真核生物为多起点复制。原核生物的复制子大而少，真核生物的复制子小而多。②原核生物复制叉移动的速度为900nt/s，真核生物复制叉移动的速度为50nt/s。③原核生物冈崎片段的大小为1000～2000nt，真核生物冈崎片段的大小为100～200nt。④真核细胞的DNA聚合酶和蛋白质因子的种类比原核细胞多，引物酶活性由DNApolα的两个小亚基承担。⑤原核细胞在第一轮复制还没有结束的时候，就可以在复制起始区启动第二轮复制。真核细胞的复制有复制许可因子控制，复制周期不可重叠。

⑥原核生物的DNA为环形分子，DNA复制时不存在末端会缩短的问题。真核生物的DNA为线形分子，DNA复制肘末端会缩短，需要端粒酶解决线形DNA的末端复制问题。不同点DNA复制与核小体组装真核生物的染色体结构复杂，其DNA与组蛋白构成核小体，DNA缠绕于组蛋白核心外，每个核小体上的DNA相当于两个负超螺旋。复制时的冈崎片段长约200bp，恰好相当于一个核小体DNA的长度。DNA复制时，组蛋白需同步合成，并与DNA组装成核小体。DNA复制与核小体组装原核生物和真核生物DNA复制调控的比较原核生物DNA复制的速率与其生长环境有关，迅速增殖的细胞通常在一次复制尚未完成的情况下，即可开始另一次复制，但复制叉上DNA链的延伸速度基本恒定。真核生物DNA复制的调控至少有3个层次，其一是细胞周期水平的调控；其二是染色体水平的调控；其三是复制子水平的调控。原核生物和真核生物DNA复制调控的比较端粒DNA的复制真核生物线性染色体的两个末端具有特殊的结构，称为端粒，它是由许多成串的重复序列所组成。

端粒酶是一种含有RNA链的逆转录酶，它以自身的RNA链为模板合成DNA端粒结构。一条链是由重复序列TTTTGGGG组成的，称TG链

另一条链是由重复序列AAAACCCC组成的，称AC链端粒在决定细胞的寿命中起重要作用，体细胞随着分化而失去端粒酶的活性，端粒缩短。这些重复序列的少量丢失，不会伤及基因的结构，如果短到一定程度就引起细胞停止生长或凋亡。端粒DNA的复制生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件分裂旺盛的细胞存在端粒酶（telomerase），这种酶是蛋白质和RNA组成的复合物，其蛋白质部分能以其RNA为模板催化合成DNA链。分裂旺盛的细胞存在端粒酶（telomerase），这13.4逆转录作用逆转录也称反转录，是以RNA为模板合成DNA的特殊复制方式（在某些生物如鸡的肉瘤病毒、HIV等）它们的遗传信息载体是RNA而不是DNA。因此，在感染细胞时，首先经过逆转录作用成为双链DNA，才能整合到宿主基因组中去。13.4逆转录作用逆转录也称反转录，是以RNA为模板合成D生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性（1）RNA指导的DNA聚合酶活性（2）DNA指导的DNA聚合酶活性（3）核糖核酸酶H的活性，专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，可沿5´→3´和3´→5´两个方向起核酸外切酶的作用。cDNA

几乎所有真核生物mRNA分子的3´末端都有一段polyA,当加入寡聚dT作为引物时，mRNA就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与其互补的DNA，称为cDNA。逆转录酶是多功能酶，兼有3种酶的活性13.5DNA的损伤与修复DNA的损伤DNA在复制时产生错配、病毒基因整合；某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变等，破坏DNA的双螺旋结构。从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（生物突变）。DNA损伤的修复四种修复途径：直接修复（光复活）、切除修复、复组修复和诱导修复（暗修复）。13.5DNA的损伤与修复DNA的损伤13.5.1DNA损伤的产生DNA复制具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/109～1/1010，即每109～1010个核苷酸才出现一个错误DNA的损伤（突变）大多数是自发的，是进化与分化的基础外界环境因素，包括化学诱变剂和物理因子以及代谢过程中产生的自由基等影响13.5.1DNA损伤的产生DNA复制具有高度精确性，在大UV物理因素：紫外线（ultraviolet，UV）、各种辐射UV物理因素：紫外线（ultraviolet，UV）、化学因素化学因素突变的分子改变类型：

错配、缺失、插入、重排（1）错配：DNA分子上的碱基错配称点突变。

转换：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。

颠换：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。突变的分子改变类型：生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成课件（2）缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。缺失或插入都可导致框移突变。框移突变：指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。谷酪蛋丝5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙缬组缬正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C（2）缺失、插入和框移谷酪（3）重排DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。由基因重排引起的两种地中海贫血基因型（3）重排由基因重排引起的两种地中海贫血基因型13.5.2DNA损伤的修复是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态修复的主要类型光修复（lightrepairing）切除修复（excisionrepairing）重组修复（recombinationrepairing）SOS修复13.5.2DNA损伤的修复是对已发生分子改变的补偿措施，直接修复：如光复活酶,可以把嘧啶二聚体恢复正常状态。切除修复：找出损伤位置并切除，进行修复合成并连接。重组修复：先复制再修复。子代链在对应模板链的损伤处留下缺口，先将同源母链DN