叶绿体色素的提取、分离和理化性质

叶绿体色素的提取、分离和理化性质Ⅰ.提取与分离一、原理叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料菠菜、小白菜叶片。（二）仪器设备研体，漏斗，三角瓶，剪刀，滴管，培养皿（直径11cm），康维皿或平底短玻管，圆形滤纸（直径11cm）。试剂（1）95%乙醇。（2）石英砂。（3）碳酸钙粉。（4）推动剂：按石油醚：丙酮：苯（10：2：1）比例配制（V/V）。三、实验步骤1.叶绿体色素的提取（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4～5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2~3ml.95%乙醇，研磨至糊状，再加10~15mL95%乙醇，离心35min，提取上清液过滤于三角瓶中，残渣用10mL95%乙醇冲洗.一同过滤于三角瓶中。（3）如无新鲜叶片，也可用事先制好的叶干粉提取。取新鲜叶片（以菠菜叶最好），先用105℃杀青，再在80℃下烘干，研成粉末，密闭贮存。用时称叶粉2g放入小烧杯中，加95%乙醇20~30mL浸提，并随时搅动。待乙醇呈深绿色时，滤出浸提液备用。2.叶绿体色素的分离（1）取圆形定性滤纸一张（直径11cm），在其中心戳一圆形小孔（直径约3mm），另取一张滤纸条（5cm×1.5cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液，沿纸条的长度方向涂在纸条的一边，使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次，然后沿长度方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。（2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿突出）。（3）在培养皿内放一康维皿，在康维皿中央小室中加入适量的推动剂，把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿（图2-11-1）。此时，推动剂借毛细管引力顺纸捻扩散至圆形滤纸上，并把叶绿体色素向四周推动，不久即可看到各种色素的同心圆环。如无康维皿，也可在培养皿中放入一平底短玻管或塑料药瓶盖，以盛装推动剂。所用培养皿底、盖的直径应相同，且应略小于滤纸直径，以便将滤纸架在培养皿边缘上。当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色，用铅笔标出各种色素的位置和名称。Ⅱ.理化性质一、原理叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定。叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H'所取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素、铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。皂化反应式如下：二、材料、仪器设备及试剂（一）材料菠菜叶片。（二）仪器设备刻度试管，小试管，试管架，分光镜，石棉网，烧杯，酒精灯，玻棒，铁三角架，刻度吸量管，火柴。试剂（1）95%乙醇。（2）苯。（3）醋酸铜粉末。（4）5%的稀盐酸。（5）醋酸-醋酸铜溶液：用50%的醋酸100mL溶人醋酸铜6g，再加蒸馏水4倍稀释而成。（6）KOH-甲醇溶液：20gKOH溶入100mL甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂中。三、实验步骤本实验第一项中提取的叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验：1.光对叶绿素的破坏作用（1）取4支小试管，其中两支各加入5mL用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5mL叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。（2）取1支装有叶绿体色素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片匀浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。（3）另取本实验中用圆形滤纸层析分离成的色谱一张，通过圆心裁成两半，一半放在直射日光下，另一半放在暗中，半小时后比较两张色谱上的四种色素的颜色各有何变化。2.荧光现象的观察。取1支20mL刻度试管加入5mL浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。3.皂化作用（绿色素与黄色素的分离）（1）在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5mL20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。（2）片刻后，加入5mL苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1~1.5mL蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），于试管架上静置分层。若溶液不分层、则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素），上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。4.吸收光谱的观察将上述已分层的试管溶液，用分光镜观察两类色素的吸收光谱，首先让下层绿色素部分对准进光孔，看光谱有何变化，然后再将上层黄色素溶液对准进光孔，看光谱又有何变化。把观察的结果用简单的图表示出来。5.H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用（1）取两支试管。第一支试管加叶绿体色素提取液2mL，作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液5mL，再加入5%HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。（2）当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记载溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。解释其颜色变化原因。（3）另取醋酸-醋酸铜溶液20mL，置于烧杯中。取新鲜植物叶两片，放入烧杯中，用酒精灯慢慢加热，随时观察并记录叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。【注