谷类作物种子中赖氨酸含量的测定

谷类作物种子中赖氨酸含量的测定蛋白质中赖氨酸（lysine，Lys）的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成，须从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法（dyebindinglysine，DBL）测定玉米种子中赖氨酸含量。Ⅰ茚三酮显色法一、原理谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的c-NHz，它与茚三酮（ninhydrin）试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色与赖氨酸残基的数目成正相关。选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料不同品种的玉米种子，用粉碎机粉碎，过100目筛子，收集过筛后的细粉，放入广口瓶内，加入沸程60~90℃的石油醚，使其淹过粉面，浸泡8h，不时搅动进行脱脂。然后过滤，并用石油醚淋洗沉淀若干次，弃去滤液。将脱脂玉米粉晾在干净的滤纸上，置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉，置干燥器内，保存备用。（二）仪器设备722型分光光度计、水浴锅，试管，圆头玻璃棒（圆头大小要与试管大小配套）。（三）试剂（1）缓冲溶液，称取30g甲酸钠，溶解于约60mL蒸馏水中，加入10mL8%的甲酸，最后加水到100mL。（2）茚三酮试剂：称取1g茚三酮和1g氯化镉（CdCl2·H2O），加入25mL上述缓冲溶液和75mL乙二醇，室温下放置一天、第二天使用。若出现沉淀、则过滤后使用。该溶液一定要头一天配制，第二天使用，不宜放置过久，也不能现用现配。（3）4%和2%无水碳酸钠溶液各50mL。（4）标准亮氮酸溶液，准确称取25mg亮氨酸，加数滴稀盐酸，待溶解后定容至50mL，该溶液亮氨酸浓度为500μg/mL。准确吸取上述母液1mL、3mL、5mL、7mL、9mL，分别稀释至25mL，待用。三、实验步骤（一）绘制标准曲线准确吸取已配好的标准浓度系列的亮氨酸溶液各0.5mL，分别放入5支试管中，每种浓度做三个重复。再取一支试管加入0.5mL蒸馏水做空白对照。向每支试管中各加人0.5mL的4%碳酸钠溶液和2mL茚三酮试剂（头一天配好的），混匀，在80℃恒温水浴上保温30min。取出后，立即放入冷水浴中冷却3min，然后向每管内加入5mL的95%乙醇，摇匀，在分光光度计上500nm波长处进行比色，以空白做对照，读取吸光度。以吸光度值为纵坐标，亮氨酸浓度为横坐标，绘出标准曲线，并求出曲线的斜率。（二）样品的测定准确称取已脱脂的各种玉米种子干粉各25mL，每个品种做三个重复。放入试管中（试管应预先烘干），加入约300mg细石英砂（估计数字）和1mL2%碳酸钠溶液，用圆头玻棒充分搅拌2min，注意切勿将试管挤破。将试管放入80℃恒温水浴中，提取10min，应常搅动。取出试管，向每管内按顺序加入2mL茚三酮试剂，混匀，放入80℃恒温水浴中，保温显色30min，同时以蒸馏水做一空白对照，取出后，立即放入冷水浴中冷却3min，以下步骤与标准曲线做法相同。加完乙醇后进行过滤，用滤液进行比色，读取吸光度。若样品颜色过深，则可取一定量的滤液用95%乙醇稀释后比色，吸光度的数值以在标准曲线范围内为宜。在标准曲线上查出相当的亮氨酸含量。一般作物的籽粒中，蛋白质含量约为干重的10%~20%，富含蛋白的种子中则为30%~50%。赖氨酸含量约为3~7g/16g氮。四、结果计算按下列公式进行计算：【注意事项】样品要粉碎成细粉，称量要精确到0.1mg。样品与石英砂要充分研磨提取，每次操作要一致。茚三酮试剂要头天配制，第二天使用，切不可久放。恒温水浴上提取和显色时间要严格控制。比色时的顺序要与加茚三酮试剂的顺序相同。Ⅱ染料结合法（DBL）一、原理谷物蛋白中都含有一定数量的碱性氨基酸，如Arg、His、Lys的碱性基团分别是&'-胍基、β-咪唑基及ε-氨基，在pH2~3的缓冲液中，这些碱性基团均带正电荷，当在此溶液中加入一定或过量的偶氮染料（如酸性橙-12），此染料以阴离子存在于溶液中，并与带正电荷的碱性基团作用，定量地生成不溶解的结合物。但由于染料与这三种碱性氨基酸均能结合，为此，可在样品中加入微量的丙酸酐，使其在一定条件下（pH2~3）与赖氨酸的ε-氨基起特异的酰化作用，目的是掩蔽氨基酸中的ε-氨基，防止它与染料结合。同时，另取一份样品，不经酰化处理、并加入数量相同的染料。平衡后测定染料的结合量（DBL），根据两次测定染料结合量的差值，即可求得赖氨酸的含量。此法适于大批分析样品的快速筛选。其化学反应式如下。1.氨基酸酰化作用的反应式二、材料、仪器设备及试剂（一）材料同上。（二）仪器设备微型粉碎机（筛孔直径为0.05cm）、分析天平，索氏振荡器，GXD-201型蛋白质分析仪，离心机及离心管，容量瓶、移液管、滴定管及管架、加样器、烧杯等。（三）试剂（1）磷酸缓冲液：3.40gKH，PO.和20.00g草酸（H2C2O4·2H2O）分别溶于水中，定量地转入1000mL容量瓶中。然后再加入1，7mL.85%H3PO4、60mL冰醋酸和1mL丙酸，用蒸馏水定容至刻度。（2）染料溶液：准确称取1.363g酸性橙-12（Acidorange-12，相对分子质量为350.37）。用磷酸缓冲液溶解并定容至1000mL。此溶液的浓度是3.89mmol/L，或每毫升含染料1.363mg。（由于染料的来源不同，它的纯度也不同，故须对染料的纯度进行校正）。（3）半饱和醋酸钠溶液：取263gNaAc+3H：0溶液后定容至1000mL。pH为3.5左右。（4）丙酸酐。三、实验步骤（一）标准回归方程的制作用滴定管取出1.363mg/mL染料液分别为5mL、8mL、10mL、12mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mL至9个50mL容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度。用蛋白质分析仪分别测出每一溶液的透光度（T），然后换算成吸光度。以吸光度y和染料溶液浓度x，求测y随x而变的回归方程。※注：因染料的颜色较深，测定时不灵敏，为此，可将1.363mg/mL染料40mL加水25mL，让其透光率为0；以40mL1.363mg/mL染料加水125mL，调其透光度为87%，然后再测定各标准溶液求其T值，再换算成吸光度。样品的测定1.粉碎将待测的各种谷物种子10g置微型粉碎机中分别粉碎（粉碎机转速为8000r/min）约0.5min，回收全部样品，充分混匀样品，并在80℃烘箱中烘2h左右，然后放至干燥器中冷却。2.称重称取样品两份，其中一份为酰化样品，称重为300mg；另一份为未酰化的样品，称重为250mg，分别倒至两个离心管中。3.反应（1）在酰化样品管中加入1mL半饱和醋酸钠溶液及0.1mL丙酸酐。（2）在未酰化样品管中加入1mL半饱和醋酸钠溶液及0.1mL磷酸缓冲液。（3）各管摇匀后，加塞，在搅拌器或振荡器上搅拌15min，使之充分酰化，然后分别用快速加样器准确加入10mL1.363mg/mL的染料液，塞紧塞子后，在振荡机（水平式）上振荡1h，反应后的混合液立即以3000~3500r/min离心8~12min。4.测定将各管离心后的上清液用GXD-201型蛋白质分析仪测定透光度T值。四、结果计算（一）单位样品结合的染料量根据所测定剩余染料的透光度换算成吸光度后，由标准回归方程算出酰化管中和未酰化管中剩余染料的浓度，再根据下列公式计算出单位样品结合的染料量。式中：C为加入染料溶液的浓度，mg/mL，即1.363mg/mL；V为加入染料的体积，10mL；Vc为染料浓度为1.363mg/mL时的体积；CA、CB分别为酰化样品和未酰化样品与染料作用