sds-page电泳问题与讨论实例版个人总结之四

SDS电泳问题讨论（实例版 凌波丽个人总结之四、 、小木虫(金币 一下，谢谢提供资 配胶缓冲液系统对电泳的影响 ， 在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系。在浓缩胶中其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度压着蛋白质分子 到一起浓缩为一狭窄的区带当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后同时由于分离胶孔径的缩小在电场的作用下蛋白分子根据其固有的 ， 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因 样品如何处理根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。还原SDS处理：在上样buffer中加入SDSDTT（Beta）后，蛋白质构象SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入Buffer，离心，沸水煮5min，再离 带有烷基化作用的还原 非还原SDS处理：生理体液、、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还SDS电泳凝胶中各主要成分的作 提高SDS聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室 微笑”（两 中间凹下）形带原因主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。为什么带出现拖尾现主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的 ，，处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂什么是“鬼 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来 为什么溴酚蓝不能起到指示作用 ）） 处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度为什么电泳的条带很电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确 ；适当降低电压为什么电泳电压很高而电流却很低呢这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮。处理办法：电泳槽正确装配即可浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗这主要出现在初学者中一般对电泳不会有太大的影响前者主要原因是拔梳子用力不均匀 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APSTEMED用量过，二、 电泳带弥散和拖尾的原因和改进措施(2013-10-，握。一般上样体积为10-15µL（即2-10µg蛋白质。如果样品很稀上样量可以达到100µL。2.（1）样品应该充分溶解：保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最(2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.5-1.0mg/LEppendorf（可以在盖子处加上卡子后在110度沸水中水浴加热3（可以在薄塑料板上钻出几个与Eppendorf管直径形同的圆洞，Eppendorf管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄塑料板的出Eppendorf管的管体大分的那一放入沸水锅中，薄塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。可以一批对于多个Eppendorf管进行不同时间的沸水浴。Eppendorf管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开，而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3（3）改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDSSDS电泳带变宽的原因和改进措施(2013-10-7)原因三：SDS电泳带与邻近蛋白质电泳相连。除了上样量过多和样品溶解不完全外，凝胶的加只能重新凝胶，梳子拔起时要等凝胶凝聚完毕，速度不宜过快，拔起的方向要垂直于样品处理（充分溶解样品：根据样品分离目的不同，在上样前对样品进行的溶解处理主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。SDSbufferSDSDTTBeta巯基乙醇)后，蛋白质构象SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl10μl20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。非还原SDS处理：生理体液、、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未在SDS不连续电泳中，pH对整个反应体系的影响是至关重要的。制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.8，分离胶pH8.8;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而Cl性场度比这带成较电度着白子到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH(>8.8分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH，验中排其他后仍能好解问的况应首要考虑该因素，即适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值的差值。聚丙烯酰胺凝胶浓度/%蛋白质分离范围/kd 36— 24— 14— 14— 14—浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小 5%2KD的蛋白质必须要用Tricine胶系统，上面说的改进对于分子量低于3KD的蛋白质的电泳没有用，但是对于高于3KD的蛋白质的电泳有用。以上材料的主要参考文献是主编，蛋白质纯化实验方案与应用，化学工业，2010，第13章。SDS 的蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散的原因和解决方法20131024蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散可能有多种原加样量过多，会引起蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散。为了提高分辨率，应该避免加样过多，小体积样品可给出窄带.加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15µL（即2-10µg蛋白质。如果样品很稀上样量可以达到100µL。加样没有立即电泳会引起蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散。加热蛋白质样品变性需要沸水浴3-5的二硫键在高温下可能是会断开，但是于空气中温度降低会重新形成二硫键，而且可能在过久放置过程中蛋白质可能会再折叠，更不要扔到冰箱里保存。配制对应蛋白质相对分子量的适当浓度的电泳凝胶，使得蛋白质组分的以充分分离。蛋白质样品被水解。注意除去蛋白质样品的内源性的水解酶，不要反复冻融电泳时间过长或过短。溴酚蓝达到分离胶的底部即应该关闭电泳电源低于10Kd的蛋白质分子在SDSelectrophoresis不可能获得好的分辨率，此时要缓冲溶液、SDSMr<15KDSDS可以加大缓冲溶液的摩尔浓度，并且用三羟甲基甘氨酸代替甘氨酸作为终止离子，浓度可先不变，还可以把分离胶的交联度C增加到10%，这样应该可以顺利。Mr<15KD的肽要用SDS，分离胶浓度应该在15-20%，同时分离胶的交联度C大约5%。SDS SDS电泳主要利用聚丙烯酰胺的分子筛效应分离蛋白质和核酸，SDS-PAG蛋白质电泳分几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的，最常用的就是SDS电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：Q：SDS电泳的基本原理A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠)，SDS会与变性的多肽，并使蛋负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，1.4g15KD200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得Q：配胶缓冲液系统对电泳A：在SDS不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分pH8.9;TrispH因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而CL离子却很高，两者之间形成导pH所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。Q：样品如何处A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后，蛋白质构象被SDS按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3、非还原SDS处理：生理体液、、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加Q：SDS电泳凝胶中各主要制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris-HCL系统，具体作用后面介绍;TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固;Q：提高SDS电泳分辨率的途A1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。体可参照编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。Q：“微笑”(两边中间凹下)形带原因A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。Q：“皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。Q：A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的处理办法：加样前离心;选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长，重新配制;降低凝胶浓度。Q：为什么带出现纹理现A：主要是样品不溶性颗粒引起的处理办法：加样前离心;加适量样品促溶剂。Q：A的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来还原剂的氧化。Q：为什么溴酚蓝不能起到指A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原处理办法：适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压;Q：A：这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。处理办法：电泳槽正确装配即可Q：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗?A：这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的后，板未压紧而致空气进入引起的。SDS蛋白质电泳的原理，蛋白质电泳中蛋白样品的准备，蛋白质电泳中拖尾现象的原因，浓缩胶的注意事项。SDS电泳中根本没有带出现目的蛋白质的相对分子量对应的条带原因和解决2014717SDS电泳中根本没有带出现目的蛋白质的相对分子量对应的条带。分两种情对应样品泳道处用很宽的弥散带出现。这又分为两种情况：①上样样品中有不均一的杂MADLI-S、红外光谱仪和紫外可见光光谱仪光谱检测一下可能的凝胶上的目的蛋白质带中会收到的蛋白质样品的MADLI-S、红外光谱和紫外光-可见光光谱的特征值与目的蛋白质是否有吻合2的方法，再结合目的蛋白质的序列特征，进行MS-MSSDS目的蛋白质没有充分溶解（需要加入增溶剂），或者变性不彻底以至于目的蛋白质没有在结合SDS之后形成杆状结构而是还有部分球状结构引起电泳位置异常，或者发生了非常均一性的聚合（均一性聚合可能性不大），或者SDS用量不够没有充分使得目的蛋白质没有在结合SDS之后形成均一的杆状结构而是还有部分球状结构引起电泳位置异常（SDS用量不够的话带会较宽或者有多条，一般不会单一而且明亮）。1的原因 起来很复杂，一般知道一下，直接用2和3检测盒调整就行了。缓冲液和分离胶的浓度不合适，需要重新配胶。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低Mr范围。可以2。聚丙烯酰胺凝胶浓度/%蛋白质分离范围/kd 36— 24— 14— 14— 14—浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小 5%如果样品准备中使用了如果样品准备中使用了EG，那么EG进入电泳体系肯定会对电泳有影响，可以在样品液点样前用超滤离心管超滤离心去掉PEG成不溶物与PEG形成网络聚合体无法去除EG。如果真的在煮沸蛋白质样品时可能使得EG形成的串珠状高聚物，那么实际目的蛋白质的分子量可能会加大很多，导致在电泳时在时可能使得PEGEG的特异性的红外光谱的样品，也有可能只有EG的特异性的红外光谱而没有热变性的目的蛋白质的特异性的红外光谱，因为变性过程中有了PEG的干扰最终变性态也改变了，然后用S分别：检测热变性的目的蛋白质的特异性的质谱、EG的特异性的质谱和样品的质谱，前两者与第三者的质谱应该诸多到了此刻就不要去做SS电泳了，除非你非要用WB，那么你就要考虑去掉有关蛋白酶、——考虑碱性蛋白酶的水解酶类在样品组织里是否有充足来源；另外碱性蛋白酶在煮沸变性WB、Pulldon、免疫沉淀、免疫共沉淀等，可以用MADLI-S、圆二色光谱、红外光谱和紫外光-可见光光谱等更易于操作蛋白质-蛋白质相互作用方法代替WBull-onMADLI-MS、圆二色光谱、红外光谱和紫外光-可见光光谱等特征值。五、SDS电泳实例分析：1.SDS大家好，请教一个问题：最近做SDS电泳，发现每次跑完胶，撬开薄板以后，胶的下端恼。分离胶的浓度是10%，80V或者90V恒压跑全程，溴酚蓝前沿出胶大约需要两个半小时。感谢参与，应助指数+1可能的原凝胶不均匀冷却，中间冷却不 凝胶和玻璃挡板底有bubble，或者俩遍聚合不完全样品中含有不溶性颗2.SDS各位大侠好：最近跑SDS出现了一点问题，蛋白分子量大小45KD，但是电泳时marker相比却在44K29KD之间如果靠近44k就算了44k挺远的，请问各位有谁遇到过这种情况吗这与蛋白的结构以及等电点等因素有什么关系吗谢谢指教大小有关，与形状无关，为啥大小却跟marker不一致呢纠结郁闷求解释小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回silicare(金币+3,BioEPI+1):2012-01-31你的电泳缓冲液是否正确？不同的电泳缓冲液marker胶是否正确。如上面仁兄所小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回silicare(金币+12012-01-31是不是你的蛋白发生了降解？用你的样品和别人的样品一起跑个电泳，看看别人的样分能不能对上，如果对上了，那就是你样品的问题，如果他的也没有对上，那就是胶的问baodongq★小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回silicare(金币+12012-01-31蛋白结构应该没有问题，在确认胶的配制和电泳过程没有问题，那么你的样品在什么缓冲里面，里面的盐浓度高不高，还 pH，都会有所影响hxs-520★★★小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回silicare(金币+32012-01-31一般情况，如果胶有问题，marker也同样有但是如果maker给的图与说明书一致，那可能就是电泳之外的问题3.SDS ybs007【答案】应助回★★amisking(金币+3,BioEPI+1):2011-07-25loadingbuffer。电泳缓冲液。你的缓冲液用了多久，是否是回收的 ）电压。怀疑是不是开始的电压太高了请着重注意一下电泳液和电压，尤其是电泳液，我曾经在这个上栽了好多跟头fanglove0o0蛋白质电泳带模糊不清和分辨率低，原因可能是蛋白质样品加多了，小量样品能够有窄带加样后没有立即电泳，电泳后没有立即固定，引起了扩散样品的蛋白质发生了水解通常靠近前沿的位置的蛋白质带分辨率不好，适当灌制较长的凝胶个人意见，参考例4.例4.SDS20最近一直在做哪个sds聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离胶浓度12%，浓缩胶是5%，在浓缩胶中的电压用的80V大概30分钟然后进入分离胶的时候电压用的120V整个电泳跑完的时间大概是2.5小时，样品用的茶叶中提取的多酚氧化酶（粗蛋白，也用凝胶过滤层析初步进行了分离纯化，想做下电泳看看纯度怎么样，发现一直没出现条带，感觉拖尾非常严重，还有是做了很多次最后下面都有一条横贯线（从左到右分别是ake粗蛋白两个，纯化后的蛋白两个，最后两个也是粗蛋白只是这个两个粗蛋白的浓度不一样，一直都找不到原因，在此求助于各位师兄 【答案】应助回帖★kx444555:金币+1,鼓励交流2013-07-02你这个明显是浓缩胶没有凝 可以尝试浓缩胶分离胶配好后过夜再上样开【答案】应助回帖★kx444555:金币+2,鼓励交流2013-05-28SDSpHmarker条带都制剂可以解决，浓度低则可以用超滤浓缩或TCA沉淀法解决。Good蛋白拖尾看起来像是被降解了，建议在低温条件下进行亲和层【答案】应助回帖★kx444555:金币+1,2013-07-02蛋白胶本身有问题，哪有电泳跑这么久的，200V跑到底，42min。我一直用这个参数。你所谓的蛋白通过SE纯化，你知道蛋白的分子量大致范围啊，没有对照所以看不出来。在重新跑胶的时候，最后加入过SE之前的样品，作为对照。小火炉【答案】应助回帖建议楼主用15%的分离胶试试，90V，30in，120V，1h小小米呐 火炉at2013-05-31建议楼主用15%的分离胶那为什么时间长反倒要把分离胶浓度调高，不是应该用低点的【答案】应助回帖★kx444555:金币+2,2013-07-02 MARKER 你蛋白是碱性蛋白吗？如果是碱性蛋白，跑电泳的时候正负极要调换一下跑电泳例.dspge跑胶时间太长，时间也有问题10 sds 【答案】应助回帖★★★★小丹木木:金币+2,2012-03-27西瓜:金币+3,MolEPI+1,2012-03-28不知道你要做什么，目的蛋白在哪里，看图嘛下面这些是的话，还可以再跑跑，拉开距离。可以跑浓度高一点的，因为你这些跑的蛋白看来有点小就说你的题目问的，长时间跑胶会热，会影响结果建议加个make，最右边的那个是吗？跑胶每孔的体积要一制，不够补上样缓冲液，要不你看你的第4道，被挤成啥养了调调上样量，3,5的有点多，2,4的有点跑的稍有点弯，还可以，最好不变电压跑完，80v（我常用，参考电泳上下槽的电泳 是一样的，一般上槽我会用新的，下槽用旧的 不缺钱，就全新【答案】应助回★感谢参与，应【答案】应助回★感谢参与，应cxch1224:金币+1★有帮助,谢谢2012-03-27用6%的胶，30K左右的用12.5%胶，都有不错的结果送鲜花一送鲜花一不知道你要做什么，目的蛋白在哪里，看图嘛下面这些是的话，还可以再跑跑，拉开距离。可以跑浓度高一点的，因为你这些跑的蛋白看来有点小就说你的题目问的，长时间跑胶会热，会影响结建议加个maker，最右非常感不知道你要做什么，目的蛋白在哪里，看图嘛下面这些是的话，还可以再跑跑，拉开距离。可以跑浓度高一点的，因为你这些跑的蛋白看来有点小就说你的题目问的，长时间跑胶会热，会影响结建议加个maker，最右前沿是蓝色的吗？怎么我看到蓝色的前面还有一条乳白色或者土红色的线★西瓜:金币+2,2012-03-28应该是蓝色的那条线，我当时做大点的蛋白，都要把最前面的跑出你这个蛋白有点小感觉，跑到浓点的胶1/3或1/4处，应该就差例6.请教大家双向电泳图谱问题是上样量太高了吗？定量后的浓度为2.16ug/ul，24厘米胶条，按照推荐上样量250ug来算上样116ul。左侧为酸性端，有横纹，请问是什么原因呢凌波★小木虫:金币+0.5,样品没有完全溶解，上样前确保样品完全溶解并且保持稳定IEF的物质存在，改进样品方法，可用分子筛、超滤、透析等纯化蛋白样品中存在存在干扰IEF的离子。可用超滤、透析等纯化蛋白质样品降低离子强度（离子浓度要小于10mmol/L)；或者用TCA、沉淀蛋白质，然后用缓冲溶液重新溶解被沉淀的蛋白质（当然弃TCA、）.凌波★小木虫:金币+0.5, 上样量过大。需要适当减少上样量聚焦时间过短使得聚焦不完全。需要适当延长聚焦时 凌波★★★★wizardfan:金币+5,2013-08-22我觉得楼主的垂直方向也存在拖尾，应是SDSSDS含量不足，电泳缓冲溶液的终浓度的SDS终浓度应为0.1%;2.2.双向电泳的第二向SDS电泳的电泳缓冲溶液（除了SDS含量不足外）可能放置过双向电泳的第二SDS电泳时，可SDSSDS平衡液中加入30%的丙三醇和6M尿素；回帖我觉得楼主的垂直方向也存在拖尾，应是SDSSDS含量不足，电泳缓冲溶液的终浓度的SDS终浓度应为0.1%;双向电泳的第二向SDS电泳的点用缓冲溶液（除了SDS含非常感谢。下次再试电泳缓冲液是新配置的，应该没问题。 也是够的。可能聚焦时间不行★ ，小木虫金币+0.51.的排除离子的干扰有可能是样品中核酸的影响建议用核酸酶混合物(DnaseI和Rnase按照你给的上样量应该是银染的吧？感觉你这背景很深而且高丰度的蛋白点都呈现透回帖:10楼:Originallypostedby2013-08-22在酸性端且大分子区域出现横向条纹，我前不久也碰见过，样品蛋白是用沉淀后的，。按照你给的上样量，应该是银。水水应该没问题，是超纯水是银染，上样量是太高了，染色时间30in，下次考虑缩短下。谢例7求助]6请问各位大侠电泳图跑成这样，银染 谢凌波样品没有完全溶解，上样前确保样品完全溶解并且保持稳定样品中存在干扰IEF的物质存在，改进样 ）蛋白质（当然弃去TCA 。 聚焦时间过长，引起胶内渗水，并且改变了凝胶 的电场微环境，使得蛋白质样品 8.家蚕表皮二维电泳图家蚕表皮二维电泳图例8[求助]，， 6蛋白提取过程：乙腈沉淀蛋白，冻干（7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS）溶解冻干样品，超纯水透析三天除盐，10KD超滤后测浓度，-80冰箱 IEF过程：7cmPH3-10蛋白上样量1.5mg聚焦4000v1DTT210min*2IAA4%10min*2次2DTT215minIAA2.5%15min5mA20min10mA至结束R-2502013-08-22500ulpro聚焦【答案】应助回帖蛋白【答案】应助回帖蛋白提取纯度不够，估计杂质和盐浓度过2013-08-28聚焦4000v2mg蛋白2楼:Originallypostedbyat2013-09-06蛋白提取纯度不够，估计杂质和盐浓度过7cm能不能说说那种杂质呢？怎么除去盐浓度高的话，我聚焦也达到4000v了！！能不能说说那种杂质呢？怎么除去盐浓度高的话，我聚焦也达到 了我看双向图都是点 是一团黑圆这个是怎么回事呢而且我上样量挺大的7cm要500ug 学术【答案】应助回帖凌波丽【答案】应助回帖我觉得楼主可能有四个问题一、楼主的垂直方向存在拖尾，应是SDSSDS含量不足，电泳缓冲溶液的终浓度的SDS终浓度应为0.1%;SDS电泳的电泳缓冲溶液（SDS含量不足外）可能放置过双向电泳的第二SDS电泳时，可SDSSDS平衡液中加入30%的丙三醇和6M尿素；二、上样量过高5。凝胶的显色背景比较深，蛋白质的显色斑面积太大（大的显色斑很可能已经掩盖了很 ）的含量小的蛋白质的小的显色的含量小的蛋白质的小的显色 ，显示上样量明显偏大，应该较少上样量样品中存在干扰IEF的物质存在，改进样品 白质样品用透析有时不容易除去一些小分子杂质可以在透析后再用超滤纯化蛋白质样品，浓度要小于10mmol/L)TCA白质（当然弃去TCA、。））我觉得楼主可能有四个问题一、楼主的垂直方向存在拖尾，应是SDSSDS含量不足，电泳缓冲溶液的终浓度的SDS终浓度应为0.1%;！没想到您还真的来了，太激动了双向电泳的第二向SDS电泳之前，还要用SDS缓冲溶液平衡IPG胶条吗？这个平衡是平衡母液加2%DTT一次和4%IAA。这个浓度合适吗？时间是我上面介绍的两种方法，我试了两次这两种平衡方法对 图没有改进效果，不知怎么的。蛋白上样量我也觉得大了，我会改进的，谢谢您说的太对了我感觉还是我蛋白样品有干扰离子存在，可是我透析就透析72h，而且每3h换一次超纯水，然后10KD超滤管超滤的。 ， 【答案】应助回帖回帖！，）非常感谢啊！还资助我那么多金币，太感动了！！没想到您还真的来了，太激动！，）双向电泳的第二向SDS电泳之前还要用SDS缓冲溶液平衡IPG胶条吗？这个SDS IPG胶条长7cm时，DTT25mg，平衡液用量2.5ml，碘代乙酰胺IPG胶条长11，13cm时，DTT40mg，平衡液用量4.0ml，碘代乙酰胺IPG胶条长17cm时，DTT60mg，平衡液用量6ml，碘代乙酰胺IPG胶条长18cm时，DTT100mg，平衡液用量10ml，碘代乙酰胺400mg；其他长度的IPG胶条平衡试剂配制方法，大致按照以上比例推算一下。二、平衡步骤(以下两个指标取交集平衡缓冲液用量：2.5-10ml，DTT：25- ，平衡操作耗时10-平衡缓冲液用量：2510ml，碘代乙酰胺：100400m，平衡操作耗时1015min。凌波丽【答案】应助回帖）） 试试有（文献也介绍过。"）） 凌波丽【答案】应助回帖））Good凌波【答案】应助回帖回帖6楼:Originallypostedbyat2013-09-06聚焦总量多少？聚焦电压可以升高回帖:"重新处理蛋白，通过查文献，我用75%沉淀尿中蛋白（这个蛋白的回收率高，下批我用您介绍的试试有（文献也介绍过。"重新处理蛋白质用和都可以蛋白沉淀下来后，我用的是7M2M4%CHAPS40mMtris120mM2%ampholytes前只用7M2M4%CHAPS的然后蛋白溶解后从透析膜看去，会有白色颗粒，这是蛋这种情况呢你有没遇到这种情况呢凌波【答案】应助回帖 ：。当尿素等一些变性剂或者表面活性剂会使得蛋白质溶解与水中，也是有一个定量化的问题。在一定比例的表面活性剂和变性剂表面活性剂和变性剂与蛋白质相互作用肯定会改变蛋白质的折叠形态和其表面的结合的水膜而且表面活性剂和变性剂加入水中本身改变了溶液的离子强度和H等水环境，使得与原本可能还能够溶于水的蛋白质的折叠态也发生改变，因为蛋白质是形成胶体溶液不是离子溶液所以蛋白质在溶液中也是彼此又相互作用的 ：。， ，表面活性剂和变性剂的物质的量蛋白质的物质的量的达到某种特定比例时会因为表面活性剂和变性剂形成了两性离子结和在蛋白质分子表面亲水基团在外给蛋白质穿上了比较完整的亲水外衣但是有没有太多的结合上游离水分子所以促进了蛋白质的溶解但是在表面活性剂和变性剂的物质的量：蛋白质的物质的量=其他比例时，可能会存在：无法完全给蛋白质穿上亲水外溢反而消耗了活性水或者表面活性剂和变性剂过多而自己彼此相互作用形成自我组织的聚合体， ， 活性剂和变性剂透析膜的孔径能够使得尿素这类小分子透过蛋白质大分子无法透过所以变性剂（或表面活性剂）流失了，水环境又发生了变化，表面活性剂和变性剂的物质的量：蛋白质的物质的量也就变化了 例9.[求助]聚丙烯凝胶电泳marker跑成空心什么原因5amisking:金币+7,2013-08-2910bp 老跑成空心，什么原因？还有取胶时只抓着胶的一个角，为什么胶很脏呀Administrator2013-08-291800分钟_副本【答案】应助回帖★myprayer:金币+1,看你空心的趋势都是一样的，所以判断是你的胶溶的不均 回帖 。。2楼:Originallypostedbyat2013-08-30。。看你空心的趋势都是一样的，所以判断是你的胶溶的不均5图为真菌胞内蛋白双向电泳图，pH3-107cmbio-rad公司7cm胶S1250V30S2500V30S34000V3S44000V20,000S5500V设置等电聚焦时的温度（20℃）【答案】应助回帖产生这个的问题是第一向没有分开。蛋白聚焦不够所以2D的时候看到这样的图谱。建议你回帖产生这个的问题是第一向没有分开。蛋白聚焦不够所以2D的时候看到这样的图谱。建议你增加电压，至少8000v，延长时间。这样，在一维上蛋白聚焦足够好以后，才能在二维上看到点状的，而不是带状的图谱。等点聚焦条件等按bio-rad公司说的来得，他写7cm胶不是4000v吗？？？要8000v啊？？我一直以为是样品的原因凌波【答案】应助回帖。 。 样品没有完全溶解，上样前确保样品完全溶解并且保持稳定样品中存在干扰IEF的物质存在，改进样品方法，可用分子筛、超滤、透析等纯化蛋白样品中可能存在干扰IEF的离子。可用超滤、透析等纯化蛋白质样品降低离子强度（离子浓度要小于10mmol/L)；或者用TCA、沉淀蛋白质，然后用缓冲溶液重新溶解被沉淀的蛋白质（当然弃去TCA、。聚焦时间过短使得聚焦不完全。需要适当延长聚焦时聚焦时间过长，引起胶内渗水，并且改变了凝胶的的电场微环境，使得蛋白质样品再次具体可以再讨论例例11.求助，sds跑胶都糊成一片了，~~o(>_<)o★10kx444555:金币+1,2013-09-27从左到右是maker，样品a，样品b。a和b分别是微生物蛋白和蚯蚓蛋白，提取方法不一也还可以但是显然被aa样品裂解液中的成分有问题啊以至我是半路弄分子生物的，初次接触蛋白，还望各位有经验的虫子指点，谢谢【答案【答案】应助回帖蛋白浓度小到PAGE夫法检测，还有就是你的蛋白已经降解，条带就会弥【答案】应助回帖可能原因与解决蛋白质发生了降解。处理办法：重新提取蛋白质，加入蛋白酶抑制剂样品浓缩效果不好。处理办法：样品上样前煮沸充分，适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的H正确(67)，适当降低电压。一般电按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Bufer，离心，沸水煮5in，再离心加样。拖尾严重，样品溶解解效果不佳或分离胶浓度过大引起的处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂（比如表面活性剂电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度参考例例初始悬赏金币15 结果如图，中间很粗的条带，分不开。减少上样量，有的细条带又看不到了感谢参与，应助指数+1:引用回帖bngat2012-11-30你2.5ul的样品中，目的蛋白的浓度也有1mg/ml。上10ul肯定是上样量太多了。不知道你想要了，不知道是你照...分离的是菌体表面蛋白，希望得到的条带越多，越分散，越好。图片是我照的虚。果，这个还是不好办。银染可以看到很多条带，且效果非常明显，，例，，例 跪求：蛋白质电泳条带老是跑不开去怎么o青果10本跑蛋白质电泳面别同学用我们的溶液条带都跑开了，但我们还是不行，胶浓度应该没问题，我们用的12%的分离胶，5%的浓缩胶，这个胶浓度下别同学的maker都是分散的，我们的就不行，我们用了12mA和20mA的电流，长的时候跑了近三个小时溴酚蓝都跑过了还不行，难道我们的操作【答案】应助回帖★o青果(gyesang代发金币+1,2013-05-1013:05:041949stone:MolEPI+1,good2013-05-1016:10:56o青果:金币+12013-05-1140%储液体；分离胶Tris-HCl的pH值是否是8.8，一般浓度为1.5M；AP、SDS、TEMED是然后是仪器是否能提供稳定的电流/12mA【答案】应助回帖★o青果(myprayer代发):金币+1,赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你 。同样期待你更详细的应助指导。2013-05-0908:17:00楼主你在用溴酚蓝染胶的时候一定有碰到胶吧,对于12%的胶来说,韧性是很好的,你捏住一个角可以把它提起来的(甚至还可以轻轻地左右晃动).如果楼主发现它软得不行好像轻轻一捏就烂掉的话问题就是在胶上面.楼主的跑胶缓冲液看上去没问题,建议换一瓶【答案】应助回帖★ 。myprayer:金币+1,赠人玫瑰手有余香鼓励应助分子生物版块期待你的 期待你更详细的应助 。如LS所说，检查一下acrylamide浓度和缓冲液pH。跑胶时有没有漏电【答案】应助回帖★o青果(myprayer代发):金币+1,鼓励应助，分子生物版块期待你的 待你更详细的应助指导。2013-05-0908:17:42我觉得acrylamide浓度或者acrylamidebisacrylamide的比例有问题 o楼主你在用溴酚蓝染胶的时候一定有碰到胶吧,对于12%的胶来说,韧性是很好的,你捏住一个角可以把它提起来的(甚至还可以轻轻地左右晃动).如果楼主发现它软得不行好像轻轻一捏就烂掉的话问题就是在胶上面.楼主的跑...我们的丙烯酰胺是重新配的，别的同学也用过了，他们能跑开啊！！回帖回帖o青果3楼:Originallypostedbyat2013-05-09如LS所说，检查一下acrylamide浓度和缓冲液pH。跑胶时有没有漏电我到现在也不明白。再配置一次，让你同学在旁 你【答案】应助回帖★o青果(gyesang代发):金币+1,2013-05-10o青果:金币+1,★有帮助,我们好像确实是制胶的问题，移液枪没校正可能产生了影响，我们用了10%的胶跑了，效果好了一点2013-05-1118:31:15【答案】应助回帖★o青果(gyesang代发):金币+1,2013-05-10我觉得是电压电流的事，我们师兄跑不开的时候跑了足足6个小时才跑好的，不要着急，慢点来德国工兵铲【答案】应助回帖★o青果(gyesang代发):金币+1,2013-05-10可以很负责的告诉你，你的Tris液体的pH值有问题跑胶时漏电怎么检查，我们也用过另一台电泳槽，效果也不【答案】应助回帖胶的问题，分离胶的【答案】应助回帖★o青果:金币+12013-05-11 。。泳时间建议使用新的电泳液在电泳初始阶段看看气泡是不是均匀的从底部升起而不是那种像似的一丝丝的上来一般国内省点钱都让学生反复使用电泳液此外你在电泳过程中要看看电源有没有报错，一般我使用伯乐的mini系统，2块胶200v,40-45min12%的胶(29:1),一块胶建议使用横流35mA,35min同上12%的胶。建议是每次电泳时候内槽 。。希望对你有用百目【答案】应助回帖。。SDS电泳太慢和带弥散的改进措建议改进措施可以适当进一步地拉开浓缩胶和分离胶之间的pH值，比如浓缩胶为pH=6.6，分离胶为，可以考虑加高电泳时，浓缩胶的电压为90-100V，分离胶的电压到120V-200V；浓缩胶和分离胶有时候可能都设成150V也能电泳成功。，使用全新配置的缓冲溶液适当该种胶浓度下使用分离效果明显的Marker保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解适当调整聚丙烯酰胺的凝胶浓度聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。样品缓冲溶液用：Tris-HCl缓冲溶液，电泳缓冲溶液用:Tris–Gly缓冲溶液 控制好电泳时间，别把样品跑出了胶）样品处理（充分溶解样品：根据样品分离目的不同，在上样前对样品进行的溶解处理主）（1）还原SDS处理：在上样ufer中加入SDS和D(或Bta巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Bufer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 （2SDS处理碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl样品缓冲液中10μl20%的碘乙酸胺，并在室温保温 （3）非还SDS处理：生理体液、、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，， ，在SDS不连续电泳中，pH对整个反应体系的影响是至关重要的。制胶缓冲液使用缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动由于导电性与电场强度成反比这一区带便形成了较高的电压剃度压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH(>8.8)的增加，呈碱性甘氨酸大量解离泳动速率增加直接紧随氯离子之后同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的实验中， ，聚丙烯酰胺凝胶浓度/%蛋白质分离范围/kd536—1014—12.514—1514—浓缩胶浓度低；分离胶浓度高于浓缩胶，一般不小于5%2KD的蛋白质必须要用Tricine胶系统，上面说的改进对于分子量低于3KD的蛋白质的电泳没有用，但是对于高于3KD的蛋白质的电泳有用。以上材料的主要参考文献是主编，蛋白质纯化实验方案与应用，化学工 ，2010，第13章（建 参考例14.SDS泳道形状诡异10跑SDS把细胞裂解液上样结果跑出来这么奇怪的形状(最右边两个泳道) 的问题,换了好几块胶了上样的时候其他的泳道都没问题,就是只要把这个细胞裂解液加上去,对应的泳道就肯定就跑成这鬼样子电解缓冲液也没问题 其他人拿我配的缓冲液跑都没大概就是这裂解液样品的问 请问这是不是盐浓度太高了?还是盐浓度太低了?我这里还有少量NP-40,不应该影响吧？大概还会残留一些养细胞用的见了鬼了，按理说我这缓冲液最多只是同东中郎【答案】应助回帖★★★★★gyesang:金币+2,2013-10-05fuyuandj86:金币+42013-10-06这位同学，你的上样量太大了的结果，可以的样品先稀释一下再上样。先稀释5倍看看吧，不行的话少上一点，上样量蛋白太多了。【答案】应助回帖★★★★gyesang:金币+3,2013-10-05fuyuandj86:金币+22013-10-06上样量太大，或者把裂解液过滤纯化下再电泳【答案】应助回帖★★gyesang:金币+1,2013-10-05fuyuandj86:金币+22013-10-06上样量太多，多稀释些，上样前离心取上清【答案】应助回帖★fuyuandj86:金币+22013-10-06你试试离心取上清上【答案】应助回 样 的问题，不是跑胶的问题，建议重新做样品再跑胶看上样量太大，逐步两倍的稀释一下，跑一下就知道了凌波丽样品处理（充分溶解样品：根据样品分离目的不同，在上样前对样品进行的溶解处理主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。SDSbufferSDSDTTBeta巯基乙醇)后，蛋白质构象SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入Buffer，离心，沸水煮5min，再离带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100μl10μl20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。非还原SDS处理：生理体液、、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解减少上样量，楼主的样品应该稀释十倍后再上样可以考虑加高电泳时，浓缩胶的电压为90-100V，分离胶的电压到120V-200V，；浓缩胶和分离胶有时候可能都设成150V能电泳成功。凌波丽更准确的回答楼主的电泳问题是SDS电泳带弥散、拖尾，原因和解决方法如下（我今天下午刚写好的材料SDS电泳带弥散和拖尾的原因和改进措施(2013-10-原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15µL（即2-10µg蛋白质。如果样品很稀上样量可以达到（1）Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好(2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.5-1.0mg/L样品溶解液。溶解后，将其转移至Eppendorf管，盖上盖子（可以在盖子处加上卡子后在110度沸水中水浴加热3（可以在薄塑料板上钻出几个与Eppendorf管直径形同的圆洞，Eppendorf管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄塑料板的出Eppendorf管的管体大部分的那一面放入沸水浴锅中，薄塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。可以一批对于多个Eppendorf管进行不同时间的沸水浴。Eppendorf管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开，而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3（3）改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDS例15.哪位大神帮忙分析一下，右下角那个蛋白怎么跑成那样了，跑了两次了都这【答案】应助回帖【答案】应助回帖凌波【答案】应助回帖楼主的电泳问题是SDS电泳带弥散、拖尾和变宽（SDS电泳带与邻近蛋白质电泳相连： 电泳带弥散和拖尾的原因和改进措施(2013-10-原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15µL（即2-10µg蛋白质。如果样品很稀上样量可以达到（1）样品应该充分溶解：保持各种蛋白质样品和arker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。(2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.51.0mg/L样品溶解液。溶解后，将其转移至Eppendorf管，盖上盖子（可以在盖子处加上卡子）后在110度沸水中水浴加热3分钟（可以在薄塑料板上钻出几个与Epenorf管直径形同的圆洞，Epenorf管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄塑料板的出Eppenof管的体大分的那面放沸水锅中薄塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。可以一批对于多个Eppnorf管进行不同时间的沸水浴。Eppndorf管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开，而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样，以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。（3）改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDSSDS电泳带变宽的原因和改进措施(2013-10-除了以上两条原因外，还有原因三：SDS电泳带变宽，SDS电泳带与邻近蛋白质电泳相连。除了上样量过多和样品溶，加会泳。加往胶之策只子时凝，宜快拔起的方向要垂直于凝胶表面；要避免凝胶两侧的玻璃板与凝胶之间产生裂纹，在凝胶过程中不要挤压凝胶两侧的玻璃板。17cm★初始悬赏金5myprayer:金币+1,鼓励发帖积极2013-10-11图为真菌胞内蛋白双向电泳图，样品采用TCA-，。将1克冻干菌体用液氮研磨至粉末，加入TCA-质量体积比为10%的混合液15ml和0.07%DTT，-20℃沉淀1h,离心并用含DTT的洗涤以TCA，真空干燥以除去丙酮。重悬于裂解液(7M尿素、2M硫脲、4CHAPS、40mMDTT、1IPG缓冲液、痕量溴酚蓝)中，4℃14000×g高速离心20min，。pH3-10，17cmbio-rad公司说的来的，等电聚焦程序设17cm胶50V12小时（20℃）S1250V1.5S21000V线性2小时除盐S310000V线性5S410000V60,000S5500V设置每根胶条的极限电 （50-70mA/根SDS电泳，70V，30min,200v,4h. 1样品时，感DTT的洗涤以除去TCA时，TCA可能未除尽，另外，真空干燥以除去时，我是在超净台里吹EP管中的物质，需要2-3小时，耗时较多，且怕此过程中蛋白变性请问有没有好一点办法？？另外一个重要问题此方法提的的蛋白总是盐离子太多，从后面IEF可看出，不知如何解 2等点聚焦过程中，总觉得聚焦不够充分，不知是不是盐离子太多的原因，主动水化过程中水化液中溴酚蓝从负极向正极移动，但未完全到达正极。S3结束时，电压总是未能升到10000V，是不是应该将5小时延长为6小时？？3用考马斯亮蓝BBG250染色时，有2次竟然没有染出蛋白，不知BBG250染色液是不是有什么特别注意的地方，比如加试剂的先后顺序等？？ 复（6块胶）才能进行后面的分析？？就是只跑2块胶（CK和处理）不是不能进行后面的实验啊？？？图1CBBR250刚聚焦完后的胶条 如 1.★★★★小木虫:金币+0.5,kx444555:金币+4,鼓励交流2013-10-12回帖谢谢您的回复，由于自己完全是自己摸索，我还是有几处不明白，特来请教1.是用多洗几次吗？？既能除盐，又能除TCA吗2稍微调整两性电解质的用量，是裂解液中，还是水化液中的两性电解3上样量是350-400微克总蛋4您的意思是可以先同时6个IEF胶条都先聚焦好，再每2个跑第二向SDS吗★★★★★★小木虫:金币+0.5,给个红包，谢谢回kx444555:金币+4,鼓励交流2013-10-12zhangbaocau:金 -10-121.是可以除盐，TCA是沉淀蛋白用的，离心沉淀蛋白后TCA洗是为了除去沉淀里面的TCA和盐分，可以多做1-2我不清楚你的裂解液和水化液有什么区别。我通常的做法是直接重悬在EF水化液里，后面就直接上聚焦的看成分就知道样品处于变性条件一般做离心前（我一般是做超速离心的，20°C）做室温30分钟处理样品。不清楚你为什么要4°C下离心，水化通常都是在室温下进行的。考染可以适当增加一点上样量可以是500μg-1mg总蛋白上样体积在300μl体积多了胶条也吸收不了。上等点聚焦前室温放置1-2h让胶条溶胀。这个看个人喜好吧我觉得相对于第二向IEF比较容易出问题不同次跑出来的效果未必一样。所以一般是一起做IEF。因为里有很多电泳装置，一般是一起跑4块胶，太 面用洗是为了除去沉淀里面的TCA和盐分，可以多做1-2次。2写错了，您说的对。将1克冻干菌体用液氮研磨至粉末，