DB51∕T 2905-2022 猪A型塞内卡病毒分离鉴定技术规范

ICS11.220CCSICS11.220CCSB41四 川 省 地 方 标 准DB51/T2905—2022猪ATechnicalspecificationforisolationandidentificationforswinesenecavirusA2022-05-20发布 2022-07-01实施四川省市场监督管理局 发布DB51/T2905DB51/T2905—2022标准下载目 次前言 II112范引文件 13语定义 14略语 15剂设备 15.1主试剂 15.2主仪设备 26品采、存输 26.1样采集 26.2保与输 27毒细分培养 2生安措施 2样的理 2单细制备 27.4样接种 37.5病收获 38毒酸定 3RT-LAMP和RT-PCR引物 3核提和转录 3RT-LAMP反应 3RT-PCR4试结观察 49果定 59.1RT-LAMP 59.2RT-PCR 59.3病分鉴定 5附录A（范）试配置 6附录B（料）猪A型塞卡毒VP1白因LAMP和RT-PCR增列 7I前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件主要起草单位：四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学。本文件首次发布。II猪A型塞内卡病毒分离鉴定技术规范范围本文件规定了猪A型塞内卡病毒分离鉴定方法、RT-LAMP及RT-PCR诊断方法。本文件适用于猪A型塞内卡病毒的病原分离和鉴定、实验室诊断、病毒检测、流行病学调查。（GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541本文件没有需要界定的术语和定义。缩略语下列缩略语适用于本文件。CPE：细胞病变DMEM：细胞营养液DNAmarker：DNA相对分子质量标记FBS：胎牛血清HEPES：4RT-LAMP：逆转录环介导等温扩增RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应SVA：猪A型塞内卡病毒GB/T6682PK-15DMEMHEPES(1mol/L0.01mol/LpH7.0~7.41PBS（参见附录A）；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR反应混合液（2×）、LAMP反应各组分试剂。PCR用一次性注射器吸取临床发病猪只水泡液0.5mL~1mL，并将水泡液装入保存管，加青霉素至终浓度1000IU/mL、链霉素至终浓度500IU/mL，不能立即使用应置于-70℃冷冻保存；用0.01mol/LPBS（pH7.4）清洗水泡表面，然后用灭菌手术剪刀剪取水泡皮2g~5g，装入样品保存管，加适量50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，不能立即使用应置于-70℃冷冻保存；5g~10g，50%甘油-PBS采集的样品应按照NY/T541要求包装和运输。SVA分离鉴定时，应在高等级生物安全实验室操作，按照GB19489（所有部分）的规定执行。水泡液4℃3000r/min离心10min，以0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，-70℃保存备用；取0.5g待检组织样品，加入1mL~1.5mLPBS，用组织破碎仪充分破碎，用含青、链霉素的DMEM作3:1℃3000r/min0.22μm1.5mL，-702PK-1525cm28FBS的DMEM培养基5mL，细胞2×105个/mL~3×105个/mL48h。，37℃、5%CO2h0.2mLPK-15（5mL瓶~42瓶~437°C15mL含2%FBSDMEMCO24848hCPE°C3000r/min1070°C1代72hCPE/PK-151mL4mL37°C代~5RT-LAMPRT-PCRRT-LAMP和RT-PCR引物针对SVAVP1蛋白基因保守区域，引物序列见表1。表1 引物列检测方法引物序列(5′→3′)位置(bp)RT-LAMPSVVF3CCGATCTCGACTACTGAATG2866～2886SVVB3GAGAACGCCACTGTCAGAC3017～3036SVVFIPCATCGTCCTGCTGTGCACCT-AGAAGGACGCCGTCTTCC2881～2941SVVBIPTTCTAACACCCCGCCCAACA-TTGACGTACAGGCCGAAAC2953～3013RT-PCRSVVFTACAGTTTGGCCTGTTTCACT3063～3083SVVRCGCCCAGTAAAGTGGTAGGG3210～3229采用RNA/cDNA，于-20RT-LAMPRT-LAMP反应体系中各组分见表2，反应体系可根据表中各组分比例适当调整。3表2 RT-LAMP应系反应试剂体积（µL）BstDNA聚合酶缓冲液2.5RNA酶抑制剂（40U/μL）0.5反转录酶（200U/μL）0.75BstDNA聚合酶1甜菜碱（1mmol/L）2MgSO4（8mmol/L）2引物F3/B3（0.2μmol/L）各2引物FIP/BIP（1.6μmol/L）各4dNTPs（1.4mmol/L）2RNA模板1ddH2O1.25RT-LAMP将8.4.165°C4580°C反应104°CRT-PCRRT-PCR反应体系见表3，反应体系可根据表中各组分比例适当调整。表3 RT-PCR应系PCR反应试剂体积（µL）2×TaqPCRmasterMix5上游引物：F（10µmol/L）0.5下游引物：R（10µmol/L）0.5cDNA模板1ddH2O3RT-PCR反应程序见表4。表4 RT-PCR应序步骤时间和温度(min、s/°C)循环数(个)预变性5min、95°C1变性30s、95°C35退火30s、56°C延伸30s、72°C延伸7min、72°C1RT-LAMP在每个RT-LAMP反应管内加入荧光染料SYBRGreenI0.5μL，涡旋混匀，在紫外光下观察。4取适量扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪中观察结果。RT-LAMP阳性对照出现1条梯状条带并发出绿色荧光，阴性对照无条带不显色，说明对照成立。若样品电泳结果出现与阳性对照一致条带，且显色反应样品管发出绿色荧光，判定为SVA核酸阳性；若样品电泳结果无条带，显色反应样品管无绿色荧光变化，判定为SVA核酸阴性。RT-PCR167bpSVASVAB.2CPE8.18.2SVA3CPE8.18.25RT-LAMPRT-PCR8.2SVA3CPE8.18.2SVA5附录A（.01mol/LpH7.0~7.4PBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO4∙12H2O3.58gKH2PO40.27g灭菌双蒸水800mLNaOH或者HCl调pH值7.0~7.4，灭菌双蒸水定容至1000mL,121℃、15min高压锅灭菌冷却，置常温或4℃备用。TAE（50三羟甲基甲烷碱（Trisbase）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）100mL蒸馏水100mL待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000mL，置4℃冰箱中备用，如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍，成TAE电泳缓冲液。1.0琼脂糖1.0g1×TAE缓冲液100mL0.5ug/mLGoldView5uL微波炉充分溶解后，加入溴化乙锭，倒入凝胶板中，在距离底板0.5mm的位置上放置梳子，凝胶的厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，电泳缓冲液没过胶面。6附录B（资料性）猪A型塞内卡病毒VP1蛋白基因LAMP和RT-PCR扩增序列猪AVP1F3、B3CCGATCTCGACTACTGAATGTAATTAAGGTACTGGAGAAGGACGCCGTCTTCCCCCGTCCTTTCCCCACAGCAACAGGTGCACAGCAGGACGATGGTTACTTTTGTCTTCTAACACCCCGCCCAACAGTCGCTTCCCGACC