辅酶Ⅰ NAD(H)含量检测试剂盒说明书-可见分光光度法UPLC-MS-4338

电话：400-998-2324邮箱：service_uplc_ms@163.com网址：本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！-上海液质检测技术有限公司第第页辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒说明书注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。货号:UPLC-MS-4338规格:50T/24S

可见分光光度法产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。试剂名称规格保存条件酸性提取液液体15mL×1瓶4℃保存碱性提取液液体15mL×1瓶4℃保存试剂一液体20mL×1瓶4℃保存试剂二液体6mL×1瓶4℃保存试剂三液体16mL×1瓶4℃保存试剂四液体3mL×1瓶-20℃保存试剂五液体40mL×1瓶4℃保存试剂六液体75mL×1瓶（自备）常温保存NAD标准品粉剂×1支-20℃保存NADH标准品粉剂×1支-20℃保存溶液的配制：1、试剂三：需要严格避光；2、试剂六：72mL乙醇和3mL蒸馏水混合，备用；3NAD1.5mL21.25nmol/mLNAD4、NADH1.4mL2µmol/mL1.25nmol/mLNADH标准溶液备用。产品说明：II又称烟酰胺腺嘌呤二核ND（IH则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧I含量降低会导致细胞损伤或衰亡。分别用酸性和碱性提取液提取样品中A+和AH通过MS（）570nmNAD+NADHMTT还原法检测。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。操作步骤：一、NAD+和NADH的提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、血清（浆）中NAD+和NADH的提取：NAD+0.1mL血清（浆），0.5mL5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g4℃10min200µL，加入等体积碱性提取液；混匀，10000g4℃10min冰上保存待测。NADH0.1mL血清（浆），0.5mL碱性提取液，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g4℃10min200µL，加入等体积酸性提取液；混匀，10000g4℃10min冰上保存待测。2、组织中NAD+和NADH的提取：NAD+0.1g0.5mL5min(盖紧，以防止水分散失)，4℃4℃冰上保存待测。NADH0.1g0.5mL5min(盖紧，以防止水分散失)，4℃4℃冰上保存待测。3、细胞或细菌中NAD+和NADH的提取：NAD+5000.5mL1min（20200W，超2s1s）5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g4℃10min200uL另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g4℃10min，取上清,冰上保存待测。NADH5000.5mL1min（20200W，超2s1s）5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g4℃10min200uL另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g4℃10min，取上清,冰上保存待测。二、测定步骤1、分光光度计预热30分钟以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。2、操作表（在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样）试剂名称对照管(µL)测定管(µL)NAD或NADH标准管(µL)空白管(µL)上清液5050--标准溶液--50-蒸馏水50试剂五500试剂一250250250250试剂二75757575试剂三150150150150试剂四35353535充分混匀，室温避光静置20min试剂五-500500500充分混匀，静置5min后，15000rpm，25℃离心15min，弃上清，沉淀中加入：试剂六1000100010001000混匀，570nmAA-AD标准管的记为A1=A1-A空白管。NADH标准管的记为ΔA标准2=A标准管2-A空白管。（空白管只需做1-2次）三、NAD+含量的计算1、血清（浆）中NAD+含量计算NAD+含量(nmol/mL）=ΔA测定÷（ΔA1÷C标）×V提取÷V血清=12.5×ΔA测定÷ΔA12NAD+含量计算按样本蛋白浓度计算NAD+(nmol/mgprot）=ΔA测定÷（ΔA1÷C标）×V提取÷(V提取×Cpr)=1.25×ΔA测定÷ΔA1÷Cpr按样本质量计算NAD(nmol/g质量）=ΔA测定÷（ΔA1÷C标）×V提取÷W1.25×ΔA测定÷ΔA1÷W(3)按细菌或细胞数量计算NAD+(nmol/104cell）=ΔA测定÷（ΔA标准1÷C标）×V提取÷500=0.0025×ΔA测定÷ΔA标准1四、NADH含量的计算1、血清（浆）中NADH含量计算NADH含量(nmol/mL）=ΔA测定÷（ΔA2÷C标）×V提取÷V血清=12.5×ΔA测定÷ΔA22NADH含量计算按样本蛋白浓度计算NADH(nmol/mgprot）=ΔA测定÷（ΔA2÷C标）×V提取÷(V样品×Cpr)=1.25×ΔA测定÷ΔA2÷Cpr(2)按样本质量计算NADH(nmol/g质量）=ΔA测定÷（ΔA2÷C标）×V提取÷W=1.25×ΔA测定÷ΔA2÷W(3)按细菌或细胞数量计算NADH(nmol/104cell）=ΔA测定÷（ΔA标准2÷C标）×V提取÷500=0.0025×ΔA测定÷ΔA标准2CDNH1.25nmol/mLCprmgm