1992培养条件对重组大肠杆菌生长及外源蛋白基因表达的影响

培养条件对重组大肠杆菌生长及外源蛋白基因表达的影响方宏清于公义

（军事医学科学院生物工程研究所,北京,100071）摘要综述了培养基、温度、pH、溶氧、比生长速率等对重组大肠杆菌生长、外源蛋白基因表达及产物存在形式的影响，并探讨了提高表达水平的途径。关键词重组大肠杆菌；培养条件；外源蛋白基因表达；存在形式重组DNA技术发展至今，已有许多外源蛋白基因在大肠杆菌中获得表达,其中一些蛋白产品已投放市场。这些产品能够进行大规模生产在很大程度上得益于发酵培养技术的完善。与传统发酵培养相比，重组菌培养有其自身的特点，即:产物（蛋白质）为初级代谢产物;目的基因克隆在质粒上，存在结构不稳定性和分配不稳定性;随着培养条件的改变，基因剂量可以发生质的和量的变化;大多数克隆基因的表达是由已知的诱导型启动子控制，因此可根据启动子的特性实施先高密度培养后高表达的策略。重组大肠杆菌的产物可分为菌体产品（死菌）、胞质产品（包含体或可溶形式）、周质产品和胞外产品。表1列出了重组大肠杆菌的产物特点及常用启动子。本文综述了培养基、温度、PH、溶氧、比生长速率等对重组大肠杆菌生长、外源蛋白基因表达及产物存在形式的影响，并探讨了提高表达水平的途径。1重组大肠杆菌生长及外源蛋白合成的一般影响因素培养基培养基是影响菌体生长及产物合成的主要因素之一，基本组成包括碳源、氮源、无机盐、微量元素、维生素和生物素等，对营养缺陷型菌还应考虑补加相应的营养成分。应用正交设计及均匀设计等数学工具优化培养基成分及配比是提高外源蛋白产量的重要手段。不同的碳源对菌体生长的影响不同。Anderson等［1］研究了不同碳源对野生型大肠杆菌生长的影响。结果表明，在基础培养基中，葡萄糖和甘油相比，它们所导致的菌体比生长速率及呼吸强度相差不大，但甘油的菌体得率较大，而葡萄糖所产生的副产物较多;用甘露糖作碳源时，不产生乙酸，但比生长速率和呼吸强度均较小。碳源对基因表达也有不同的影响，主要表现在两个方面:糖的分解代谢物阻遏作用和诱导作用。如葡萄糖对lac启动子控制的基因表达有抑制作用，其原因是降低胞内cAMP水平和排除诱导物。Pastan发现加入外源cAMP能克服葡萄糖的分解代谢物阻遏作用［2］。DeBellis［3］研究了葡萄糖浓度对IPTG诱导作用的影响，当葡萄糖浓度为0.4%时,IPTG的诱导作用被抑制;当葡萄糖浓度为0.05%-0.1%时,IPTG诱导后有大量外源基因产物表达。因此，采用流加措施控制培养基中葡萄糖在低浓度，能减弱或消除葡萄糖的分解代谢物阻遏作用。乳糖能诱导lac启动子和tac启动子控制的基因表达。对这一类表达系统,用乳糖作为碳源较有利,乳糖同时可以作为诱导物。Kapralek等［4］在研究tac启动子控制的凝乳酶原基因表达时，用乳糖替代IPTG作诱导物，提高了产物的最高含量。此外，我们在研究不同碳源对重组霍乱毒素B亚单位表达的影响时，发现乳酸作为碳源可提高产物的表达水平［5］，其原因是乳酸代谢后可提高培养液的pH值。在培养基中增加氨基酸、蛋白胨、蛋白质水解物、酵母抽提物能提高菌体密度和产物浓度。Mizutani等［6］利用DO-stat流加亮氨酸菌体密度提高一倍，酶比活提高70%。另一方面，高浓度的某些氨基酸会抑制菌体生长及产物合成，如高浓度缬氨酸会抑制异亮氨酸的合成，从而抑制菌体生长［7］。对分泌型产物，添加酪蛋白水解物有利于其合成及分泌。此外,Zhang等［8］报道加甘氨酸能促进胞外酶的释放，认为甘氨酸可能会影响细胞代谢及碳源利用的途径。无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子，如在DNA、RNA、蛋白质的合成，糖代谢途径的利用、细胞呼吸和ATP合成中均有磷参与。过量的无机磷会刺激葡萄糖的利用、菌体生长和氧消耗。磷对克隆基因表达的调节较为复杂。Jensen等［9］在进行补料培养时，降低培养基中磷的浓度，抑制菌体生长，再加大葡萄糖流加速率可进一步提高rMAE-hGH产量一倍。我们在复合培养基中加入0.05mol/L磷酸盐可使rCTB产量提高8倍左右［10］，推测磷对不同表达系统的作用差异与受体菌基因型及启动子有关。1.2温度温度对基因表达的调控机理很复杂，涉及DNA复制、转录、翻译及低分子量调节分子合成等方面。如杨胜利等［11］的研究指出温度是在转录水平上调节E.coliA56(pPA52)内青霉素酰化酶基因的表达。温敏扩增型质粒在升温后，质粒拷贝数猛增，对菌体生长影响很大。对于此类重组菌，通常先在较低温度培养,然后再升温扩增质粒,提高剂量,再诱导外源基因表达,从而获得高产量。阻遏物CI857调节的Pl/pr启动子活性也受温度影响。CI857的熔点是42°c,比野生型CI的熔点低13°C。在较低温度(v32°C)CI857的氨857基端区域(与DNA结合)是完全折叠的，随温度上升其氨基端的非折叠程度呈S形上升，在42C有52%的分子的氨基端是非折叠的，到50C则有65%的分子是非折叠的。似乎可以假设氨基端结构的变化改变了ci857与pl的结合特性。在低于最优温度时，低产量是部分诱导的结果，即只有部分ci857分子从PL的操作基因位点解离下来。Okita等［12］的实验结果一外源蛋白的起始比合成速率随温度上升(38.5C〜42C)而增加一也支持了这一观点。Chalmers等［13］研究了tac启动子表达B-内酰胺酶(pKN)和rEGF(pCU)的影响。在较低温度培养时,B-内酰胺酶和rEGF的产量均较高。含pCU质粒的重组菌37C诱导时细胞易裂解，在21C-25C诱导时不易裂解。尽管较高温度会导致细胞裂解，但30C和37C培养时合成的蛋白量却比20C时多。这指出较高温度下rEGF产量下降并不是因为蛋白合成容量下降，而是因为细胞裂解。pHpH值对外源蛋白合成也有影响。CadA启动子是一个pH调节启动子。Tolentino等［14］的研究指出,CadA启动子的最佳诱导pH值为5.5。对非pH调节启动子控制系统,pH也影响外源蛋白的表达。吴军研究rIL-2生产菌的高密度高表达时，在诱导阶段升高pH值提高了rIL-2的表达水平［15］,其原因可能是高pH值下乙酸对基因表达的抑制作用降低。我们在研究重组CTB的表达时发现升高pH值(7.2-8.4)可提高比表达水平2.14倍，原因尚待研究(未发表)。溶氧溶氧影响大肠杆菌的平均生长速率。溶氧浓度一般控制在临界氧浓度以上。Cutayer等报导，临界氧浓度与菌体密度有关，通常为10%-30%饱和氧浓度［16］。控制溶氧的措施有:提高搅拌转速、提高通气量、提高氧分压、降低培养温度、加氧载体、提高菌体富氧能力(如通过基因工程手段将VHb基因克隆到受体菌中)［17］。基因表达水平也受溶氧浓度的影响，如缺氧能促进CadA启动子控制的基因表达［14］。1.5比生长速率⑴)已有许多实验都证实，随P增加，质粒拷贝数单调降低。这提示p的改变将在基因剂量水平上影响产物的合成。Lee和Bailey的现象学模型［18］及Bentley和Kompala的结构动力学模型［19］均表明，随着p下降，质粒拷贝数增加,外源蛋白含量增加。Ryan等［20］的研究指出小降低，质粒拷贝数增加,产物表达量也增加;然而p降到0.38h-1以下时，产物表达量将随p降低而降低，尽管此时拷贝数仍呈上升趋势。1994年Laffend和Shuler建立了一个单细胞结构模型［21］，该模型与实验数据相吻合。该模型预测结果指出，当大量需求翻译"器件"时会出现核糖体蛋白限制。在高拷贝数系统中，核糖体蛋白mRNA就会与质粒mRNA竞争核糖体，核糖体蛋白翻译就会下降，从而限制外源蛋白的合成。在这种情况下，产物表达量将不会随基因剂量增加而无限增加。升温诱导时的p影响温度诱导型重组菌的表达。Ling-Ling等报导［22］,PST重组菌在p=0.4h-1时诱导的表达量为40%，是p=0.2h-1诱导时的二倍。Curless等［23］报导在p=0.2h-1诱导时IFN-aConA达量是p=0.025h-1诱导时的五倍。实验结果表明选择合适的p对获得高表达十分重要。2培养条件对产物活性、存在形式及释放的影响对产物活性及存在形式的影响培养温度及PH对产物活性和包含体的形成均有影响。Jensen等［9］的研究表明,30°C培养rMAE-hGH是以可溶形式存在,37°C培养则形成包含体。Chalmers等［13］研究了不同温度下(20C-37C)用IPTG诱导后B-内酰胺酶的存在形式，结果表明,低温下周质内B-内酰胺酶的包含体形成率降低，酶总活性显著增加。Strandberg等［24］研究了PR启动子制表达的融合蛋白RProteinA-p-Galactosidase存在形式，在39C-44C之间诱导时只有15%-20%的融合蛋白以包含体存在。该作者发现,42°C诱导时，包含体仅在最初几小时形成,其后重组蛋白则以可溶的活性状态存在。Sugimoto等［25］研究了pH鮭生长激素(trp启动子控制)包含体形成的影响，结果表明,pH6.6时包含体45%,pH7.6时包含体占85%。此外,Bowden［26］发现加入不能被代谢的糖能阻止p-内酰胺酶在周质中形成包含体，并提高酶比活三倍。这种效应与糖的种类和浓度有关。鼠李糖比蔗糖更有效。对产物胞外释放的影响大肠杆菌外膜具有渗透性屏障作用，它仅允许疏水性物质进行有限的扩散,并通过脂多糖覆盖面。大分子物质不能渗透过外膜,因此,许多分泌表达的产物仅能进入周质而不能释放到胞外。蛋白质的胞外释放与蛋白质的疏水性和构象、外膜的完整性有关。蛋白质的外膜转运与其质膜转运的不同之处在于［27,28］:1)蛋白质在通过外膜之前可能已形成三级结构或四级结构;2)蛋白质跨过外膜前已无信号肽,其转运机制可能和公认的分泌机制有关｝;3)外膜运输体(trasporter)与被转运蛋白之间可能存在分子识别，这种识别和表面基团有关。因此,影响蛋白质高级结构和表面基团以及外膜完整性的因素均可影响蛋白质的胞外释放。在培养基中加入一些化学试剂如EDTA、甲苯、吐温和TritonX-100等可影响细胞膜结构［29］，促进胞内酶的释放。3影响高密度及高表达培养的因素除上述各种因素外，高密度及高表达培养还会遇到高渗透压、代谢副产物积累和如何维持表达水平不下降等问题。高渗透压的影响在高密度培养中需要高浓度的营养物质，这将会影响菌体生长和基因表达，尤其是高浓度的无机盐。Jensen等［9］报导，当Na2SO4浓度75mM增加到300mM时，菌体最高密度从100OD降到74OD,并且rMAE-hGH的比生产率下降了三倍。代谢产物的积累高密度高表达的另一个困难是如何解决大量积累的乙酸对生长及表达的抑制。Jensen等［9］的研究指出当［HAc］26g/L就会完全抑制菌体生长;［HAc］22.4g/L时显著降低比产率。Han等［30］研究了各种氨基酸对消除乙酸抑制作用的影响。结果表明甘氨酸和蛋氨酸有正效应。在2g/L乙酸下，加0.5g/L甘氨酸或蛋氨酸能消除乙酸对野生菌生长的抑制，提高比生长速率。加入0.6g/L蛋氨酸能消除乙酸对重组菌生长的抑制，并大量合成B-内酰胺酶。连续培养究表明，蛋氨酸对重组菌表达的影响与稀释率D有关。在D>0.4h-1时，加入蛋氨酸促进B-内酰胺酶合成并降低乙酸生成速率。在D<0.3h-1时,加入蛋氨酸则降低酶的合成并促进乙酸的生成。高密度下的表达水平许多研究都表明，流加或间歇加入有机复合氮源能提高重组菌表达水平。Shimizu等［31］通过补加酪蛋白水解物,提高了B-半乳糖甘酶产量一倍(trp启动子)。有些作者尝试补加氨基酸来提高外源基因的表达水平。热休克及严紧反应均会诱导产生蛋白酶,造成外源基因表达蛋白的降解,若外源基因表达蛋白的氨基酸组成与菌体蛋白氨基酸组成差别越大越易被降解。假如流加某种或几种氨基酸来满足外源基因表达蛋白合成的个性需要,就可能提高产物表达水平及稳定性。如CAT蛋白组成中Phe占11.5%,而菌体蛋白平均组成中Phe占4.4%,Delia等［32］通过流加Phe提高了CAT的表达水平和性。Delia的研究结果还指出，流加的氨基酸不能干扰其它前体物质的合成（如His会干扰嘌呤的合成）。表1为大肠杆菌中平均蛋白质的氨基酸的组成［33］,可供参考。此外,也可以加入蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶的降解作用oYoon等［34］在解决高密度培养中重组牛生长激素（rbST）表达水平下降的问题时，加入2mMPMSF（苯基甲烷磺酰氟,一种蛋白酶抑制剂）抑制蛋白酶活性，结果提高了rbST的产量。他们的另一方面研究结果指出，通过流加酵母抽提物作为有机氮源也能有效地防止bST降解。综上所述，对下游工作者来说，提高高密度下外源基因的表达水平着重应解决高渗的抑制、乙酸的抑制、蛋白酶的降解和如何维持合适的比生长速率等问题。此外，还应考虑外源基因表达蛋白与菌体蛋白之间氨基酸组成的差异。表1大肠杆菌蛋白质的氨基酸组成氨基酸相对频率百分数氨基酸相对频率百分数Ala10013.0Thr354.6Glx8310.8Pro354.6Asx769.9Ile344.4Leu607.8Met293.8Gly607.8Phe253.2Lys547.0Tyr172.2Ser466.0Cys141.8Val466.0Trp81.0Arg415.3His50.6参考文献:AndersonKB,MeyenburgK.AregrowthratesofEscherichiacolibatchculturelimitedbyrespiration?JBacteriol,1983,144:114~123.PastanI,PerlmanR.Cyclicadenosinemonophosphateinbacteria.Science,1970,169:339~344.DeBellisD,SchwartzI.Regulatedexpressionofforeigngenesfusedtolac:Controlbyglucoselevelsingrowthmedium.NucleicAcidsRes,1990,18:1311.KapralekF,JecmenP,SedlacekJ,etal.Fermentationconditionsforhigh-levelexpressionofthetac-promoter-controlledcalfprochymosincDNAinEscherichiacoliHB101.BiotechnolBioeng,1991,37:71~79.方宏清，赵四清，于公义等.霍乱毒素B亚单位工程菌MM2的表达与lac启动子的关系.微生物学报,1997,37(4):265~269.MizutaniS，MoriH，ShimizuS，etal.EffectofaminoacidsupplementoncellyieldandgeneproductinEscherichiacoliharboringplasmid.BiotechnolBioeng，1986，28:204~209.RinasV，Kracke-HelmHA，SchugerlK.Glucoseasasubstrateinrecombinantfermentationtechnology.ApplMicrobiolBiotechnol，1989，31:163~167.ZhangQ,TsukagoshiN,MiyashiroS,etal.Increasedproductionofa-amylasebyBacillusamyloliquefacieusinthepresenceofglycine.ApplEnvironMicrobiol，1983,46:293~295.JensenEB,CarlsenS.ProductionofrecombinanthumangrowthhormoneinEscherichiacoli:expressionofdifferentprecursorsandphysiologicaleffectsofglucose,acetateandsalts.BiotechnolBioeng,1990,36:1~11.方宏清，冯尔玲,赵四清，等•培养基和溶氧对重组重组霍乱毒素B亚单位产量的影响.军事医学科学院院刊,1996,20:49~51.杨胜利,吴汝平,何建森,等.温度在转录水平调控青霉素酰化酶基因表达.生物工程学报,1988,4:32~37.OkitaB,ArcuriE,TurnerK,etal.EffectofinductiontemperatureontheproductionofmalariaantigensinrecombinantEscherichiacoli.BiotechnolBioeng,1989,34:854~862.ChalmersJJ,KimE,TelfordJN,etal.EffectoftemperatureonEscherichiacolioverproducing0-lactamaseorhumanepidermalgrowthfactor.ApplEnvironMicrobiol,1990,56:104~111.TolentinoGJ,MengSY,BennettGN,etal.ApH-regulatedpromoterfortheexpressionofrecombinantproteinsinEscherichiacoli.BiotechnolLett,1992;14:157~162.[15]吴军,冯尔玲,于公义.基因工程菌培养过程中乙酸的积累及其对工程菌生长和产物表达的影响.生物技术通讯,1996,7:71~74.[16]CutayerJM,PoillonD.HighcelldensitycultureofEscherichiacoliinafed-batchsystemwithdissolvedoxygenassubstratefeedindicator.BiotechnolLett,1989,11:155~160.[17]焦瑞身.发酵工程的进展.生物工程进展,1993,13(5):16~33.LeeSB,SeressiotisA,BaileyJE.BiotechnolBioeng,1985,27:1699~1709.BentleyWE,KompalaDS.Anovelstructuredkineticmodelingapproachfortheanalysisofplasmidinstabilityinrecombinantbacterialcultures.BiotechnolBioeng,1989,33:49~61.RyanW,ParulekarSJ.RecombinantproteinsynthesisandplasmidinstabilityincontinuousculturesofEscherichiacoliJM103harboringahighcopynumberplasmid.BiotechnolBioeng,1991,37:415~429.LaffendL,ShulerML.RibosomalproteinlimitationinEscherichiacoliunderconditionsofhightranslationalactivity.BiotechnolBioeng,1994,43:388~398.ChangL-L,HwangL-Y,HwangC-Fetal.StudyofhighdensityEscherichiacolifermentationforproductionofporcinesomatotropinprotein.AnnNYAcadSci,1991,646:259~272.CurlessC,PopeJ,TsaiL,etal.EffcetofpreinductionspecificgrowthrateonrecombinantaconsensusinterferonsynthesisinEscherichiacoli.BiotechnolProg,1992,6:149~152.StrandbergL,EnforsSO.FactorsinfluencinginclusingbodyformationintheproductionofafusedproetininEscherichiacoli.ApplEnvironMicrobiol,1991,57:1669~1674.SugimotoS,YokooY.HigherculturepHispreferableforinclusingbodyformationofrecombinantSalmongrowthhormne.BiotechnolLett,1991,13:385~388.BowdenGA,GeorgiousG.Theeffectsofsugarson0-lactamaseaggregationinEscherichiacoli.BiotechnolProg,1988,4:97~101.HirstTR,HolmgrenJ.Conformationofproteinsecretedacrossbacterialoutermembranes:astudyofenterotoxintranslocationfromVibriocholerae.ProcNatlAcadSciUSA,1987,84:7418~7422.PugsleyAP.Thecompletegeneralsecretorypathwayingram-negativebacteria.MicrobiolRev,1993,57:50~108.VaraM.Agentsthatincreasethepermeabilityoftheoutermembrane.MicrobiolRev,1992,56:395~411.HanK,HongJ,LimHC.RelievingeffectsofglycineandmethioninefromaceticacidinhibitioninEscherichiaco