医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件

医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测安徽省细菌耐药监控中心安徽医科大学临床检验诊断学教研室安徽医科大学第一附属医院检验科徐元宏医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测安徽省细菌耐药监控中心1一、医院感染1、定义医院感染(nosocomialinfection)是指患者在入院时既不存在，亦不处于潜伏期，而在医院内发生的感染，包括医院内获得而在出院后发病的感染。随着医疗技术发展，各种侵入性操作和器官移植推广，化疗、糖皮质激素、抗生素等广泛应用，医院感染是当今医学领域中的重要问题。一、医院感染1、定义22、病原学细菌为最常见的病原体，细菌的种类与分布因感染类型、医院类别、患者基础疾病和治疗措施不同各异。目前，以革兰阴性杆菌为主(如肠杆菌科和非发酵菌)，近十余年来抗生素大量应用，常见耐甲氧西林葡萄球菌医院感染，留置导尿、人工心脏瓣膜等的医院感染中凝固酶阴性葡萄球菌感染率上升，手术切口和尿路肠球菌感染也不少见。厌氧菌和深部真菌作为机体正常菌群常引起内源性感染，如腹腔、盆腔感染、菌血症等。2、病原学33、感染源引起医院感染的病原体来源于住院病人、医务人员、探视者、陪护人员，来自于医院环境及未彻底消毒灭菌的医疗器械、血液制品的污染菌等，大多为条件性致病菌，且有程度不同的耐药性。4、易感人群免疫力低下状态的住院患者成为感染的易感人群，同时住院期间接受不同种类药物治疗和某些治疗措施为病原体感染创造了入侵和繁殖条件。3、感染源4二、医院感染病原体的确定

1、感染菌的鉴定：引起医院感染的致病菌的鉴定比一般的致病菌的鉴定要求要高，实验室必须鉴定到种的水平。细菌鉴定依据表型生化反应，八进制的编码鉴定法，必要时辅助血清学鉴定。二、医院感染病原体的确定1、感染菌的鉴定：52、药敏试验的鉴定：药敏试验的方法有K-B法、微量液体稀释法和E-test法，药敏试验的结果除了能提示用于控制感染的药物外，还提供感染菌的耐药谱，根据来自同一感染源的感染菌具有相同耐药谱的特征，作出医院内感染的判断。2、药敏试验的鉴定：63、耐药表型的检测：医院内感染菌常常是一些耐药菌，实验室应对这些细菌的耐药表型进行检测。肠杆菌科（大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、变形杆菌）应作超广谱β内酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）、耐糖肽类抗生素的肠球菌（VRE）。3、耐药表型的检测：74、医院内感染的分子生物学检测：（1）多位点酶电泳（multilocusenzymeelectrophoresis,MLEE）将菌株培养物破碎，离心取上清液，在淀粉胶上进行电泳，电泳完成后将胶切成小条，分别与不同的酶底物作用进行酶染色，不同的酶分子在不同的电泳位置显影，组成了菌株的电泳型。当酶分子的基因发生一个或多个位点变异时，电泳迁移率相应发生变化。4、医院内感染的分子生物学检测：8（2）限制性片段长度多态性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）将菌株培养物破碎，提取DNA，以限制性内切酶进行切割后，在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳后作溴乙啶染色，通过分析电泳区带图谱对菌株进行鉴别；可以将电泳分离的核酸片段转印到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用标记的探针与之杂交，用于菌株的鉴别。（2）限制性片段长度多态性分析（restrictionfr9（3）多态DNA的随机放大(randomamplificationofpolymorphicDNA,RAPD)多态DNA的随机放大又称随机引物PCR，在菌株的DNA提取物中加入约10个碱基的随机引物，进行PCR扩增，然后将PCR产物进行电泳和溴乙啶染色，分析染色图谱可用于菌株的鉴别。（3）多态DNA的随机放大(randomamplifica10（4）脉冲场凝胶电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE）将菌体包埋于琼脂中，先后用酶破坏细胞壁和分解蛋白质，以切点较少的内切酶剪切细菌的DNA，以随时变更电场方向的电泳装置对大片段DNA进行电泳，根据电泳图谱对菌株进行识别。（4）脉冲场凝胶电泳（pulsed-fieldgelel11医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件12（5）放大片段长度的多态性分析（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）对菌株的DNA进行限制性酶切，然后用特定的引物从限制性片段中将相应的片段选出，经PCR扩增后再进行电泳分析。（6）核酸序列分析(nucleotidesequenceanalysis)用PCR的方法将菌株DNA的某一片段进行扩增放大，然后进行测序，对各分离菌株的序列进行比较。（5）放大片段长度的多态性分析（amplifiedfrag13三、药敏试验药敏试验中药敏纸片选用：临床医生经常反映，实验室所报告的药敏试验结果，临床根本或很少使用这类药物，实验室药敏试验中药物是敏感，临床使用无效。如何联合用药、合理用药？实验室人员应根据可能的细菌种类、细菌的菌属，合理选用药敏纸片，报告检验结果。实验室应根据美国FDA推荐临床微生物实验室苛养菌和非苛养菌分组的药物选用，它将药物分为四组：A组，一级试验并常规报告的抗生素；B组，一级有选择报告的抗生素；C组，补充试验，有选择报告的抗生素；U组，用于泌尿道补充试验的药物。三、药敏试验药敏试验中药敏纸片选用：临床医生经常反映14例如对于肠杆菌科细菌常规报告的抗生素有氨苄西林、头孢唑啉、头孢噻吩、庆大霉素；选择报告的抗生素有阿米卡星、阿莫西林/棒酸或氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、头孢孟多或头孢尼西或头孢呋辛、头孢吡肟、头孢美唑、头孢哌酮、头孢替坦、头孢西丁、头孢噻肟或头孢唑肟或头孢曲松、环丙沙星或左氧氟沙星、亚胺培南或美罗培南、美洛西林或哌拉西林、替卡西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑。例如对于肠杆菌科细菌常规报告的抗生素有氨苄西林、头孢唑啉、头15对于铜绿假单胞菌和不动杆菌常规报告的抗生素有头孢他啶、庆大霉素、美洛西林或替卡西林、哌拉西林，选择报告的抗生素有阿米卡星、氨曲南、头孢哌酮、头孢吡肟、环丙沙星、亚胺培南或美罗培南、妥布霉素。对于铜绿假单胞菌和不动杆菌常规报告的抗生素有头孢他啶16对于葡萄球菌常规报告的抗生素有苯唑青霉素、青霉素，选择报告的抗生素有阿奇霉素或克拉霉素或红霉素、克林霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、万古霉素。对于肠球菌常规报告的抗生素有青霉素/氨苄西林，选择报告的抗生素有万古霉素。对于葡萄球菌常规报告的抗生素有苯唑青霉素、青霉素，选择报告的17对于嗜血杆菌常规报告的抗生素有氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑，选择报告的抗生素有头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟或头孢曲松、头孢呋辛钠（针剂）、氯霉素、美罗培南。对于嗜血杆菌常规报告的抗生素有氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑18对于肺炎链球菌常规报告的抗生素有红霉素、青霉素（苯唑青霉素）、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑，选择报告的抗生素有格帕沙星、左氧氟沙星或司氟沙星、氧氟沙星、四环素、万古霉素。对于肺炎链球菌常规报告的抗生素有红霉素、青霉素（苯唑青霉素）19对于除肺炎链球菌以外其它链球菌常规报告的抗生素有红霉素、青霉素、氨苄西林，选择报告的抗生素有氯霉素、克林霉素、万古霉素、头孢吡肟或头孢他啶或头孢曲松、左氧氟沙星、氧氟沙星、Linezolid、奎奴普汀/达福普汀。对于除肺炎链球菌以外其它链球菌常规报告的抗生素有红霉素、青霉20对于淋球菌常规报告β-内酰胺酶结果，如β-内酰胺酶阳性提示青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药，但淋球菌更多的是染色体介导的耐药，需要做补充药敏试验，选择报告的抗生素有头孢克肟或头孢噻肟或头孢泊肟或头孢唑肟或头孢曲松、头孢美唑、头孢替坦、头孢西丁、头孢呋辛、环丙沙星、格帕沙星或氧氟沙星、青霉素、大观霉素、四环素。对于淋球菌常规报告β-内酰胺酶结果，如β-内酰胺酶阳性提示青21遵循严格的操作方法、施加质量控制：纸片扩散法（K-B））法、液体稀释法必须遵循NCCLS规定，它对纸片厚度、药物浓度、培养基、培养环境、孵育温度、操作方法都有详细规定。E-test必须按照其说明要求进行。遵循严格的操作方法、施加质量控制：22运用丰富的理论知识，提示临床用药：对于肠道分离的沙门菌和志贺菌属，常规仅测试氨苄西林、一种喹诺酮类药物和TMP/SMZ药物，1、2代头孢菌素尽管体外敏感，但临床治疗无效，实验室不能做此药敏试验。对于肠道外分离株，沙门氏菌属还一定要测试并报告氯霉素和某一种三代头孢菌素。对于MRSA、MRSCON、ESBLs、高耐庆大霉素肠球菌、AmpC-β-内酰胺酶应有所选择性报告药敏结果，有时体外药敏结果是敏感的也要报告耐药。运用丰富的理论知识，提示临床用药：对于肠道分离的沙门菌和志贺231.药敏试验种类和方法：（1）细菌药敏试验纸片扩散法液体稀释法E-test法（2）酵母样真菌药敏试验纸片扩散法液体稀释法E-test法浅部真菌目前尚没有标准方法。1.药敏试验种类和方法：24细菌药敏试验-纸片扩散法Kirby-BaueragardiskdiffusionPaperdiskcontainingantibioticisplacedonlawnofbacteria,thenincubatedovernight.DiameterofzoneofinhibitionisinverselyrelatedtoMIC(usedtoestablishinterpretivebreakpoints).Standardizedforcommonlyisolated,rapidlygrowingorganisms.细菌药敏试验-纸片扩散法Kirby-Baueragard25医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件26细菌药敏试验-液体稀释法Minimalinhibitoryconcentration(MIC)Referencemethod.Addstandardinoculumtodilutionsofantibiotic.Incubateovernight.MICislowestconcentrationthatinhibitsgrowth(canalsobeperformedbyagardilution).Interpretation(SorR)isbasedonachievabledruglevels104

cfu420mg/ml细菌药敏试验-液体稀释法Minimalinhibitory27细菌药敏试验-E-test法E-testStripscontainingagradientofantibioticareplacedonlawnofbacteriaandincubatedovernight.MICisdeterminedatpointwherezoneofinhibitionintersectsscaleonstrip.CombineseaseofKBwithanMICmethod.ParticularlyusefulforS.pneumoniae.细菌药敏试验-E-test法E-test28四、细菌耐药机制的检测1.甲氧西林葡萄球菌的检测：MRSA(Methicillin-resistantStaphylococusaureus)、MRSCON（Methicillin-resistantcoagulatase-negativeStaphylococcalspecies）检验：四、细菌耐药机制的检测1.甲氧西林葡萄球菌的检测：29（1）．纸片扩散（K-B）法由于苯唑青霉素较甲氧西林青霉素稳定，不易失活，通常使用苯唑青霉素代替甲氧西林青霉素测定葡萄球菌。M-H琼脂平板，直接菌落悬液法，苯唑青霉素纸片含量为1μg/片，35℃24小时孵育，抑菌圈直径《10mm。2004年NCCLS推荐耐甲氧西林葡萄球菌评判标准:采用头孢西丁纸片（30μg）,孵育24小时,对于金黄色葡萄球菌抑菌圈≤19mm为MRSA，≥20mm为MSSA;对于凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈≤24mm为MRSCON，≥25mm为MSSCON.（1）．纸片扩散（K-B）法30医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件31(2).琼脂稀释法筛选试验：苯唑青霉素耐药培养基：含NaCL的M-H琼脂（4%W/V；0.68mol/l）抗生素含量：6μg/ml苯唑青霉素或10μg/ml甲氧西林接种：直接菌落悬液约0.5麦氏比浊管，用拭子浸润菌悬液后，在平板表面点种或划线。培养条件：35℃空气培养时间：24小时，对于甲氧西林/苯唑青霉素耐药的凝固酶阴性葡萄球菌，孵育48小时后再检测最可靠。结果：>1菌落=耐药推荐质控菌：金黄色葡萄球菌ATCC29213—敏感，金黄色葡萄球菌ATCC43300-耐药(2).琼脂稀释法32目前治疗方案：MRS轻度感染：利福平、SMZ-TMP、环丙沙星；严重感染：万古霉素。对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌称之为VRSAVancomycin-risistantS.aureus只能用链阳霉素治疗。目前金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药尚不多见，国外学者将肠球菌耐万古霉素基因转移到金黄色葡萄球菌中已获得成功；日本、香港散在报道且仅万古霉素低度耐药（MIC8μg/ml），且国际上尚未承认；2002年6月美国从一40岁患有糖尿病、慢性肾脏衰竭患者导管中分离到对苯唑青霉素MIC>16μg/ml,对万古霉素MIC>128μg/ml的耐万古霉素的金黄色葡萄球菌，VRSA就在我们眼前。目前治疗方案：MRS轻度感染：利福平、SMZ-TMP、环丙332.肠球菌的检测：肠球菌是一种重要的病原微生物，实验室应做高耐庆大霉素肠球菌的检测。若高耐庆大霉素，则不能和作用细胞壁的药物（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）协同使用。有条件的实验室还应作VanA,VanB,VanC耐药基因监测。治疗原则：VanA：青霉素敏感（S），氨基糖苷类非高耐--青霉素+庆大霉素；青霉素耐药（R），氨基糖苷类非高耐--青霉素/头孢类+壁霉素+庆大霉素。VanB：氨基糖苷类非高耐株--壁霉素+庆大霉素。氨基糖苷类高耐株--壁霉素，新生霉素+氟喹诺酮类。多重耐药的肠球菌目前尚无有效的治疗方案。2.肠球菌的检测：34医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件35（2）．肠球菌高水平氨基糖苷类耐药和万古霉素耐药筛选试验（琼脂稀释法）筛选试验庆大霉素HLAR抗生素含量：500ug/ml接种：液体生长法或直接菌落法至0.5麦氏比浊管。琼脂-10ul0.5麦氏比浊管悬液点种在琼脂表面。孵育条件35℃空气孵育时间24小时结果：琼脂：>1菌落=耐药；肉汤：任何生长=耐药,耐药-不能和作用细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素），敏感-可以和敏感的作用于细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药（2）．肠球菌高水平氨基糖苷类耐药和万古霉素耐药筛选试验（琼36筛选试验

链霉素HLAR抗生素含量：

肉汤1000ug/ml、琼脂2000ug/ml接种：肉汤-推荐标准肉汤稀释法。液体生长法或直接菌落法至0.5麦氏比浊管。琼脂-10ul0.5麦氏比浊管悬液点种在琼脂表面。孵育条件：35℃空气孵育时间：24-48小时（如孵育24小时为敏感时，需继续孵育）结果：琼脂：>1菌落=耐药；肉汤：任何生长=耐药,耐药-不能和作用细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素），敏感-可以和敏感的作用于细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药筛选试验链霉素HLAR37筛选试验：

万古霉素耐药抗生素含量：6ug/ml接种：肉汤-推荐标准肉汤稀释法。液体生长法或直接菌落法至0.5麦氏比浊管。1-10ul0.5麦氏比浊管悬液点种在琼脂表面。孵育条件：35℃空气孵育时间：24小时结果：

>1菌落=耐药进行万古霉素MIC测定和动力试验产生的色素来区别获得性耐药（VanA,VanB）和那些对万古霉素天然的中水平耐药（VanC）如敦鸡肠球菌、铅肠球菌和黄肠球菌，它们通常在万古霉素筛选平板上生长。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药筛选试验：万古霉素耐药383.超广谱β–内酰胺酶检测：超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯氏菌等革兰氏阴性杆菌在抗生素选择压力下产生。它是质粒介导的对第一、二、三头孢菌素、氧亚氨基β-内酰胺抗生素耐药，有时尽管体外试验是敏感的，是β-内酰胺酶基因Tem-1,Tem-2,SHV-1突变而来。ESBLs编码基因在质粒上，易在不同菌株间播散，表现为多重耐药。目前将ESBLs分为TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型。共同特点是能被β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。

3.超广谱β–内酰胺酶检测：39治疗原则是：1.碳青霉烯类抗生素，2.β-内酰胺类/酶抑制剂,3.氨基糖苷类抗生素如阿米卡星，4.头霉烯抗生素如头孢西丁。在超广谱β-内酰胺酶检测条件不具备的地方，临床可以通过实验室报告的作推测治疗，若药敏报告提示三代头孢例如头孢泼肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松有二者以上耐药极有可能是产超广谱β-内酰胺酶。治疗原则是：1.碳青霉烯类抗生素，2.β-内酰胺类/酶抑制40(1)．纸片初筛：培养基：Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度:头孢泼肟10ug或头孢他啶30ug或氨曲南30ug或头孢噻肟30ug或头孢曲松30ug（使用两个以上纸片做筛选试验可提高检出灵敏度）接种：按标准纸片扩散法孵育条件：35℃大气环境孵育时间：16-18小时结果：头孢泊肟抑菌环≤22mm，头孢他啶抑菌环≤22mm，氨曲南抑菌环≤27mm，头孢噻肟抑菌环≤27mm，头孢曲松抑菌环≤25mm，=可能产生ESBL。建议质控方法:大肠埃希菌ATCC25922（参考NCCLS抑菌标准）

肺炎克雷伯菌ATCC700603:头孢泼肟抑菌环9-16mm,头孢他啶抑菌环10-18mm,氨曲南抑菌环9-17mm,头孢噻肟抑菌环17-25mm,头孢曲松抑菌环16-24mm。(1)．纸片初筛：41纸片确证试验：培养基：Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度：头孢噻肟30ug、头孢噻肟/棒酸30ug/10ug和头孢他啶30ug、头孢他啶/棒酸30ug/10ug（确证试验须使用头孢噻肟、头孢他啶及两者与棒酸的混合纸片）接种：按标准纸片扩散法孵育条件：35℃大气环境孵育时间：16-18小时结果：混合棒酸药物纸片的抑菌圈直径比无棒酸药物纸片的直径大5mm以上=ESBL建议质控方法：大肠埃希菌ATCC25922单独药物和混合棒酸药物两种纸片的抑菌环直径相差不大于2mm。肺炎克雷伯菌ATCC700603：头孢他啶单独药物和混合棒酸药物纸片抑菌环较头孢他啶单独药物纸片抑菌环直径增大5mm以上，头孢噻肟单独药物和混合棒酸药物纸片抑菌环较头孢噻肟单独药物纸片抑菌环直径增大3mm以上。纸片确证试验：42医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件43液体稀释法初筛:培养基：CAMHB（调节好阳离子的M-H肉汤）抗生素浓度：头孢泼肟4ug/ml或头孢他啶1ug/ml或氨曲南1ug/ml或头孢噻肟1ug/ml或头孢曲松1ug/ml（使用1种以上药物做筛选试验可提高检出灵敏度）接种：按标准肉汤稀释法的规定进行孵育条件：35℃；空气孵育时间：16-18小时结果判读：生长=可疑有ESBLS的产生（即头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松MIC≥2ug/ml；头孢泼肟MIC≥8ug/ml

）质控建议：大肠埃希氏菌ATCC25922不长肺炎克雷伯氏菌ATCC700603，头孢泼肟MIC≥8ug/ml液体稀释法初筛:44液体稀释法确证:

培养基: CAMHB药物浓度: 头孢他啶0.25-128ug/ml,头孢他啶/克拉维酸0.25/4-128/4ug/ml和头孢噻肟0.25-64ug/ml,头孢噻肟/克拉维酸0.25/4-64/4ug/ml。确证试验需要同时使用头孢他啶、头孢噻肟，单独和联合克拉维酸复合制剂。接种: 按标准肉汤稀释法的规定进行孵育条件: 35℃空气孵育时间: 16-20小时结果判读: 对2个中任何一个药物的MIC，在加入克拉维酸后，MIC与不加克拉维酸的MIC值降低3个以上对倍稀释度，判定为ESBLs（如头孢他啶的MIC=8ug/ml，头孢他啶/克拉维酸的MIC为1ug/ml）。质控建议:肺炎克雷伯菌ATCC700603：联合克拉维酸的复合制剂的MIC与单药的MIC相比，应当降低3个以上对倍稀释度。液体稀释法确证:452005年NCCLS新增奇异变形杆菌的ESBL试验药物纸片筛选(mm)MIC筛选(µg/ml)大肠/肺克MIC筛选(µg/ml)奇异变形头孢泊肟10μg1782*头孢他啶30

μg

2222氨曲南不用2不用头孢噻肟30

μg

2722头孢曲松不用2不用*只用于奇异变形杆菌(大肠杆菌和肺克是8µg/ml)

2005年NCCLS新增奇异变形杆菌的ESBL试验药物纸片46用标准ESBL表型确证试验,无改变RoutinescreeningnotrecommendedPerformESBLtestwhenclinicallyrelevant(e.g.,bacteremia)ConsultwithmedicalstafftodeterminewhentotestPracticalapproach,teststerilebodysiteisolatesUsestandardESBLscreentestwithslightmodificationDrug DiskScreenMICScreen用标准ESBL表型确证试验,无改变47ESBL试验QC频率纸片法和MIC法筛选试验表型确证试验每天/每周QC肺克ATCC700603*或大肠杆菌ATCC25922QA肺克ATCC700603*每天/每周QC

肺克ATCC700603*和大肠杆菌ATCC25922*ESBL基因在质粒上;QC株必需储存在-60C或以下ESBL试验QC频率纸片法和MIC法筛选试验表型484、D试验-克林霉素诱导耐药试验：葡萄球菌对大环内酯类抗生素耐药表现为：①由msrA基因介导的主动外排机制，即M型耐药；②抗生素作用靶位的改变，即由erm基因编码的RNA甲基化酶对细菌核糖体50S亚基23SrRNA进行特定核苷酸残基甲基化，使药物与靶位的结合能力下降，导致对具有相同靶位的大环内酯类、林可酰胺类、链阳菌素B三类药物同时耐药，临床称为MLS型耐药。体外药敏试验又可将MLS型分为结构型（cMLS型）和诱导型（iMLS型）；cMLS型为红霉素和克林霉素均耐药；iMLS型红霉素耐药、克林霉素敏感。4、D试验-克林霉素诱导耐药试验：49

对大环内酯耐药的葡萄球菌可能对克林霉素的耐药,通过erm基因编码的23SrRNA甲基化也称为MLSB（大环内酯、林可和B型链阳霉素）耐药，或只对大环内酯类耐药（由msrA基因编码的外排机制）。对大环内酯耐药的葡萄球菌可能对克林霉素的耐药,通50

M-H平板或血平板，纸片相邻试验，对于葡萄球菌，距红霉素纸片（15μg/片）边缘15～26mm处放置克林霉素纸片(2μg/片)来进行检测；对于β-溶血链球菌，将克林霉素纸片(2μg/片)和红霉素纸片（15μg/片）贴在相邻的位置，纸片边缘相距12mm。M-H平板或血平板，纸片相邻试验，对于葡萄球菌51

35℃空气，16-24h孵育后，克林霉素抑菌环不出现“截平”现象，应报告分离株对其敏感。邻近红霉素纸片侧克林霉素抑菌环出现“截平”现象（称为“D”抑菌环），提示存在可诱导的克林霉素耐药，应报告分离株对其耐药，在报告中应注明“通过诱导克林霉素耐药试验，推测此菌株对克林霉素耐药，克林霉素对某些病人可能仍有效”；若无“截平”现象，则应报告菌株对克林霉素敏感。35℃空气，16-24h孵育后，克林霉素抑菌环52医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件53谢谢！谢谢！541、Geniusonlymeanshard-workingallone'slife.(Mendeleyer,RussianChemist)

天才只意味着终身不懈的努力。.202011:0311:03:10Aug-2011:032、Ourdestinyoffersnotonlythecupofdespair,butthechaliceofopportunity.(RichardNixon,AmericanPresident)命运给予我们的不是失望之酒，而是机会之杯。二〇二〇年八月五日2020年8月5日星期三3、Patienceisbitter,butitsfruitissweet.(JeanJacquesRousseau,Frenchthinker)忍耐是痛苦的，但它的果实是甜蜜的。11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.20204、Allthatyoudo,dowithyourmight;thingsdonebyhalvesareneverdoneright.----R.H.Stoddard,Americanpoet做一切事都应尽力而为，半途而废永远不行8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:105、Youhavetobelieveinyourself.That'sthesecretofsuccess.----CharlesChaplin人必须相信自己，这是成功的秘诀。-Wednesday,August5,2020August20Wednesday,August5,20208/5/20206、Almostanysituation---goodorbad---isaffectedbytheattitudewebringto.----LuciusAnnausSeneca差不多任何一种处境---无论是好是坏---都受到我们对待处境态度的影响。11时3分11时3分5-Aug-208.5.20207、Althoughtheworldisfullofsuffering,itisfullalsooftheovercomingofit.----HellenKeller,Americanwriter虽然世界多苦难，但是苦难总是能战胜的。20.8.520.8.520.8.5。2020年8月5日星期三二〇二〇年八月五日8、Formanismanandmasterofhisfate.----Tennyson人就是人，是自己命运的主人11:0311:03:108.5.2020Wednesday,August5,20209、Whensuccesscomesinthedoor,itseems,loveoftengoesoutthewindow.-----JoyceBrothers成功来到门前时，爱情往往就走出了窗外。11:038.5.202011:038.5.202011:0311:03:108.5.202011:038.5.202010、Lifeismeasuredbythoughtandaction,notbytime.——Lubbock衡量生命的尺度是思想和行为，而不是时间。8.5.20208.5.202011:0311:0311:03:1011:03:1011、Tomakealastingmarriagewehavetoovercomeself-centeredness.要使婚姻长久，就需克服自我中心意识。Wednesday,August5,2020August20Wednesday,August5,20208/5/202012、Treatotherpeopleasyouhopetheywilltreatyou.你希望别人如何对待你，你就如何对待别人。11时3分11时3分5-Aug-208.5.202013、Todowhateverneedstobedoneto

preservethislastandgreatestbastionof

freedom.(RonaldReagan,AmericanPresident)为了保住这最后的、最伟大的自由堡垒，我们必须尽我们所能。20.8.520.8.5Wednesday,August5,202014、Wherethereisawill,thereisaway.(ThomasEdison,Americaninventor)有志者，事竟成。11:01:1911:01:1911:018/5/202011:01:19AM15、

Everymanisthemasterofhisownfortune.----RichardSteele每个人都主宰自己的命运。20.8.511:01:1911:01Aug-205-Aug-2016、Asselfishnessandcomplaintcloudthemind,solovewithitsjoyclearsandsharpensthevision.----HelenKeller自私和抱怨是心灵的阴暗，愉快的爱则使视野明朗开阔。11:01:1911:01:1911:01Wednesday,August5,202017、Donot,foronerepulse,giveupthepurposethatyouresolvedtoeffect.----WillianShakespeare,Britishdramatist不要只因一次失败，就放弃你原来决心想达到的目的。20.8.520.8.511:01:1911:01:19August5,202018、Thereisnoabsolutesuccessintheworld,onlyconstantprogress.世界上的事没有绝对成功，只有不断的进步。2020年8月5日星期三上午11时1分19秒11:01:1920.8.519、Nothingismorefataltohappinessthantheremembranceofhappiness.

没有什么比回忆幸福更令人痛苦的了。2020年8月上午11时1分20.8.511:01August5,202020、Nomanishappywhodoesnotthinkhimselfso.——PubliliusSyrus认为自己不幸福的人就不会幸福。2020年8月5日星期三11时1分19秒11:01:195August202021、Theemperortreatstalentastools,usingtheirstrongpointtohisadvantage.

君子用人如器，各取所长。上午11时1分19秒上午11时1分11:01:1920.8.5谢谢观看THEEND1、Geniusonlymeanshard-worki55医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测安徽省细菌耐药监控中心安徽医科大学临床检验诊断学教研室安徽医科大学第一附属医院检验科徐元宏医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测安徽省细菌耐药监控中心56一、医院感染1、定义医院感染(nosocomialinfection)是指患者在入院时既不存在，亦不处于潜伏期，而在医院内发生的感染，包括医院内获得而在出院后发病的感染。随着医疗技术发展，各种侵入性操作和器官移植推广，化疗、糖皮质激素、抗生素等广泛应用，医院感染是当今医学领域中的重要问题。一、医院感染1、定义572、病原学细菌为最常见的病原体，细菌的种类与分布因感染类型、医院类别、患者基础疾病和治疗措施不同各异。目前，以革兰阴性杆菌为主(如肠杆菌科和非发酵菌)，近十余年来抗生素大量应用，常见耐甲氧西林葡萄球菌医院感染，留置导尿、人工心脏瓣膜等的医院感染中凝固酶阴性葡萄球菌感染率上升，手术切口和尿路肠球菌感染也不少见。厌氧菌和深部真菌作为机体正常菌群常引起内源性感染，如腹腔、盆腔感染、菌血症等。2、病原学583、感染源引起医院感染的病原体来源于住院病人、医务人员、探视者、陪护人员，来自于医院环境及未彻底消毒灭菌的医疗器械、血液制品的污染菌等，大多为条件性致病菌，且有程度不同的耐药性。4、易感人群免疫力低下状态的住院患者成为感染的易感人群，同时住院期间接受不同种类药物治疗和某些治疗措施为病原体感染创造了入侵和繁殖条件。3、感染源59二、医院感染病原体的确定

1、感染菌的鉴定：引起医院感染的致病菌的鉴定比一般的致病菌的鉴定要求要高，实验室必须鉴定到种的水平。细菌鉴定依据表型生化反应，八进制的编码鉴定法，必要时辅助血清学鉴定。二、医院感染病原体的确定1、感染菌的鉴定：602、药敏试验的鉴定：药敏试验的方法有K-B法、微量液体稀释法和E-test法，药敏试验的结果除了能提示用于控制感染的药物外，还提供感染菌的耐药谱，根据来自同一感染源的感染菌具有相同耐药谱的特征，作出医院内感染的判断。2、药敏试验的鉴定：613、耐药表型的检测：医院内感染菌常常是一些耐药菌，实验室应对这些细菌的耐药表型进行检测。肠杆菌科（大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、变形杆菌）应作超广谱β内酰胺酶（ESBLs）、耐甲氧西林的葡萄球菌（MRS）、耐糖肽类抗生素的肠球菌（VRE）。3、耐药表型的检测：624、医院内感染的分子生物学检测：（1）多位点酶电泳（multilocusenzymeelectrophoresis,MLEE）将菌株培养物破碎，离心取上清液，在淀粉胶上进行电泳，电泳完成后将胶切成小条，分别与不同的酶底物作用进行酶染色，不同的酶分子在不同的电泳位置显影，组成了菌株的电泳型。当酶分子的基因发生一个或多个位点变异时，电泳迁移率相应发生变化。4、医院内感染的分子生物学检测：63（2）限制性片段长度多态性分析（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）将菌株培养物破碎，提取DNA，以限制性内切酶进行切割后，在琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳后作溴乙啶染色，通过分析电泳区带图谱对菌株进行鉴别；可以将电泳分离的核酸片段转印到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用标记的探针与之杂交，用于菌株的鉴别。（2）限制性片段长度多态性分析（restrictionfr64（3）多态DNA的随机放大(randomamplificationofpolymorphicDNA,RAPD)多态DNA的随机放大又称随机引物PCR，在菌株的DNA提取物中加入约10个碱基的随机引物，进行PCR扩增，然后将PCR产物进行电泳和溴乙啶染色，分析染色图谱可用于菌株的鉴别。（3）多态DNA的随机放大(randomamplifica65（4）脉冲场凝胶电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE）将菌体包埋于琼脂中，先后用酶破坏细胞壁和分解蛋白质，以切点较少的内切酶剪切细菌的DNA，以随时变更电场方向的电泳装置对大片段DNA进行电泳，根据电泳图谱对菌株进行识别。（4）脉冲场凝胶电泳（pulsed-fieldgelel66医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件67（5）放大片段长度的多态性分析（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）对菌株的DNA进行限制性酶切，然后用特定的引物从限制性片段中将相应的片段选出，经PCR扩增后再进行电泳分析。（6）核酸序列分析(nucleotidesequenceanalysis)用PCR的方法将菌株DNA的某一片段进行扩增放大，然后进行测序，对各分离菌株的序列进行比较。（5）放大片段长度的多态性分析（amplifiedfrag68三、药敏试验药敏试验中药敏纸片选用：临床医生经常反映，实验室所报告的药敏试验结果，临床根本或很少使用这类药物，实验室药敏试验中药物是敏感，临床使用无效。如何联合用药、合理用药？实验室人员应根据可能的细菌种类、细菌的菌属，合理选用药敏纸片，报告检验结果。实验室应根据美国FDA推荐临床微生物实验室苛养菌和非苛养菌分组的药物选用，它将药物分为四组：A组，一级试验并常规报告的抗生素；B组，一级有选择报告的抗生素；C组，补充试验，有选择报告的抗生素；U组，用于泌尿道补充试验的药物。三、药敏试验药敏试验中药敏纸片选用：临床医生经常反映69例如对于肠杆菌科细菌常规报告的抗生素有氨苄西林、头孢唑啉、头孢噻吩、庆大霉素；选择报告的抗生素有阿米卡星、阿莫西林/棒酸或氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、头孢孟多或头孢尼西或头孢呋辛、头孢吡肟、头孢美唑、头孢哌酮、头孢替坦、头孢西丁、头孢噻肟或头孢唑肟或头孢曲松、环丙沙星或左氧氟沙星、亚胺培南或美罗培南、美洛西林或哌拉西林、替卡西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑。例如对于肠杆菌科细菌常规报告的抗生素有氨苄西林、头孢唑啉、头70对于铜绿假单胞菌和不动杆菌常规报告的抗生素有头孢他啶、庆大霉素、美洛西林或替卡西林、哌拉西林，选择报告的抗生素有阿米卡星、氨曲南、头孢哌酮、头孢吡肟、环丙沙星、亚胺培南或美罗培南、妥布霉素。对于铜绿假单胞菌和不动杆菌常规报告的抗生素有头孢他啶71对于葡萄球菌常规报告的抗生素有苯唑青霉素、青霉素，选择报告的抗生素有阿奇霉素或克拉霉素或红霉素、克林霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、万古霉素。对于肠球菌常规报告的抗生素有青霉素/氨苄西林，选择报告的抗生素有万古霉素。对于葡萄球菌常规报告的抗生素有苯唑青霉素、青霉素，选择报告的72对于嗜血杆菌常规报告的抗生素有氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑，选择报告的抗生素有头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟或头孢曲松、头孢呋辛钠（针剂）、氯霉素、美罗培南。对于嗜血杆菌常规报告的抗生素有氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑73对于肺炎链球菌常规报告的抗生素有红霉素、青霉素（苯唑青霉素）、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑，选择报告的抗生素有格帕沙星、左氧氟沙星或司氟沙星、氧氟沙星、四环素、万古霉素。对于肺炎链球菌常规报告的抗生素有红霉素、青霉素（苯唑青霉素）74对于除肺炎链球菌以外其它链球菌常规报告的抗生素有红霉素、青霉素、氨苄西林，选择报告的抗生素有氯霉素、克林霉素、万古霉素、头孢吡肟或头孢他啶或头孢曲松、左氧氟沙星、氧氟沙星、Linezolid、奎奴普汀/达福普汀。对于除肺炎链球菌以外其它链球菌常规报告的抗生素有红霉素、青霉75对于淋球菌常规报告β-内酰胺酶结果，如β-内酰胺酶阳性提示青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药，但淋球菌更多的是染色体介导的耐药，需要做补充药敏试验，选择报告的抗生素有头孢克肟或头孢噻肟或头孢泊肟或头孢唑肟或头孢曲松、头孢美唑、头孢替坦、头孢西丁、头孢呋辛、环丙沙星、格帕沙星或氧氟沙星、青霉素、大观霉素、四环素。对于淋球菌常规报告β-内酰胺酶结果，如β-内酰胺酶阳性提示青76遵循严格的操作方法、施加质量控制：纸片扩散法（K-B））法、液体稀释法必须遵循NCCLS规定，它对纸片厚度、药物浓度、培养基、培养环境、孵育温度、操作方法都有详细规定。E-test必须按照其说明要求进行。遵循严格的操作方法、施加质量控制：77运用丰富的理论知识，提示临床用药：对于肠道分离的沙门菌和志贺菌属，常规仅测试氨苄西林、一种喹诺酮类药物和TMP/SMZ药物，1、2代头孢菌素尽管体外敏感，但临床治疗无效，实验室不能做此药敏试验。对于肠道外分离株，沙门氏菌属还一定要测试并报告氯霉素和某一种三代头孢菌素。对于MRSA、MRSCON、ESBLs、高耐庆大霉素肠球菌、AmpC-β-内酰胺酶应有所选择性报告药敏结果，有时体外药敏结果是敏感的也要报告耐药。运用丰富的理论知识，提示临床用药：对于肠道分离的沙门菌和志贺781.药敏试验种类和方法：（1）细菌药敏试验纸片扩散法液体稀释法E-test法（2）酵母样真菌药敏试验纸片扩散法液体稀释法E-test法浅部真菌目前尚没有标准方法。1.药敏试验种类和方法：79细菌药敏试验-纸片扩散法Kirby-BaueragardiskdiffusionPaperdiskcontainingantibioticisplacedonlawnofbacteria,thenincubatedovernight.DiameterofzoneofinhibitionisinverselyrelatedtoMIC(usedtoestablishinterpretivebreakpoints).Standardizedforcommonlyisolated,rapidlygrowingorganisms.细菌药敏试验-纸片扩散法Kirby-Baueragard80医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件81细菌药敏试验-液体稀释法Minimalinhibitoryconcentration(MIC)Referencemethod.Addstandardinoculumtodilutionsofantibiotic.Incubateovernight.MICislowestconcentrationthatinhibitsgrowth(canalsobeperformedbyagardilution).Interpretation(SorR)isbasedonachievabledruglevels104

cfu420mg/ml细菌药敏试验-液体稀释法Minimalinhibitory82细菌药敏试验-E-test法E-testStripscontainingagradientofantibioticareplacedonlawnofbacteriaandincubatedovernight.MICisdeterminedatpointwherezoneofinhibitionintersectsscaleonstrip.CombineseaseofKBwithanMICmethod.ParticularlyusefulforS.pneumoniae.细菌药敏试验-E-test法E-test83四、细菌耐药机制的检测1.甲氧西林葡萄球菌的检测：MRSA(Methicillin-resistantStaphylococusaureus)、MRSCON（Methicillin-resistantcoagulatase-negativeStaphylococcalspecies）检验：四、细菌耐药机制的检测1.甲氧西林葡萄球菌的检测：84（1）．纸片扩散（K-B）法由于苯唑青霉素较甲氧西林青霉素稳定，不易失活，通常使用苯唑青霉素代替甲氧西林青霉素测定葡萄球菌。M-H琼脂平板，直接菌落悬液法，苯唑青霉素纸片含量为1μg/片，35℃24小时孵育，抑菌圈直径《10mm。2004年NCCLS推荐耐甲氧西林葡萄球菌评判标准:采用头孢西丁纸片（30μg）,孵育24小时,对于金黄色葡萄球菌抑菌圈≤19mm为MRSA，≥20mm为MSSA;对于凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈≤24mm为MRSCON，≥25mm为MSSCON.（1）．纸片扩散（K-B）法85医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件86(2).琼脂稀释法筛选试验：苯唑青霉素耐药培养基：含NaCL的M-H琼脂（4%W/V；0.68mol/l）抗生素含量：6μg/ml苯唑青霉素或10μg/ml甲氧西林接种：直接菌落悬液约0.5麦氏比浊管，用拭子浸润菌悬液后，在平板表面点种或划线。培养条件：35℃空气培养时间：24小时，对于甲氧西林/苯唑青霉素耐药的凝固酶阴性葡萄球菌，孵育48小时后再检测最可靠。结果：>1菌落=耐药推荐质控菌：金黄色葡萄球菌ATCC29213—敏感，金黄色葡萄球菌ATCC43300-耐药(2).琼脂稀释法87目前治疗方案：MRS轻度感染：利福平、SMZ-TMP、环丙沙星；严重感染：万古霉素。对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌称之为VRSAVancomycin-risistantS.aureus只能用链阳霉素治疗。目前金黄色葡萄球菌对万古霉素耐药尚不多见，国外学者将肠球菌耐万古霉素基因转移到金黄色葡萄球菌中已获得成功；日本、香港散在报道且仅万古霉素低度耐药（MIC8μg/ml），且国际上尚未承认；2002年6月美国从一40岁患有糖尿病、慢性肾脏衰竭患者导管中分离到对苯唑青霉素MIC>16μg/ml,对万古霉素MIC>128μg/ml的耐万古霉素的金黄色葡萄球菌，VRSA就在我们眼前。目前治疗方案：MRS轻度感染：利福平、SMZ-TMP、环丙882.肠球菌的检测：肠球菌是一种重要的病原微生物，实验室应做高耐庆大霉素肠球菌的检测。若高耐庆大霉素，则不能和作用细胞壁的药物（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）协同使用。有条件的实验室还应作VanA,VanB,VanC耐药基因监测。治疗原则：VanA：青霉素敏感（S），氨基糖苷类非高耐--青霉素+庆大霉素；青霉素耐药（R），氨基糖苷类非高耐--青霉素/头孢类+壁霉素+庆大霉素。VanB：氨基糖苷类非高耐株--壁霉素+庆大霉素。氨基糖苷类高耐株--壁霉素，新生霉素+氟喹诺酮类。多重耐药的肠球菌目前尚无有效的治疗方案。2.肠球菌的检测：89医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件90（2）．肠球菌高水平氨基糖苷类耐药和万古霉素耐药筛选试验（琼脂稀释法）筛选试验庆大霉素HLAR抗生素含量：500ug/ml接种：液体生长法或直接菌落法至0.5麦氏比浊管。琼脂-10ul0.5麦氏比浊管悬液点种在琼脂表面。孵育条件35℃空气孵育时间24小时结果：琼脂：>1菌落=耐药；肉汤：任何生长=耐药,耐药-不能和作用细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素），敏感-可以和敏感的作用于细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药（2）．肠球菌高水平氨基糖苷类耐药和万古霉素耐药筛选试验（琼91筛选试验

链霉素HLAR抗生素含量：

肉汤1000ug/ml、琼脂2000ug/ml接种：肉汤-推荐标准肉汤稀释法。液体生长法或直接菌落法至0.5麦氏比浊管。琼脂-10ul0.5麦氏比浊管悬液点种在琼脂表面。孵育条件：35℃空气孵育时间：24-48小时（如孵育24小时为敏感时，需继续孵育）结果：琼脂：>1菌落=耐药；肉汤：任何生长=耐药,耐药-不能和作用细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素），敏感-可以和敏感的作用于细胞壁的药物协同（如氨苄西林、青霉素、万古霉素）。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药筛选试验链霉素HLAR92筛选试验：

万古霉素耐药抗生素含量：6ug/ml接种：肉汤-推荐标准肉汤稀释法。液体生长法或直接菌落法至0.5麦氏比浊管。1-10ul0.5麦氏比浊管悬液点种在琼脂表面。孵育条件：35℃空气孵育时间：24小时结果：

>1菌落=耐药进行万古霉素MIC测定和动力试验产生的色素来区别获得性耐药（VanA,VanB）和那些对万古霉素天然的中水平耐药（VanC）如敦鸡肠球菌、铅肠球菌和黄肠球菌，它们通常在万古霉素筛选平板上生长。质控菌株：粪肠球菌ATCC29212-敏感；粪肠球菌ATCC51299-耐药筛选试验：万古霉素耐药933.超广谱β–内酰胺酶检测：超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯氏菌等革兰氏阴性杆菌在抗生素选择压力下产生。它是质粒介导的对第一、二、三头孢菌素、氧亚氨基β-内酰胺抗生素耐药，有时尽管体外试验是敏感的，是β-内酰胺酶基因Tem-1,Tem-2,SHV-1突变而来。ESBLs编码基因在质粒上，易在不同菌株间播散，表现为多重耐药。目前将ESBLs分为TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型。共同特点是能被β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦所抑制。

3.超广谱β–内酰胺酶检测：94治疗原则是：1.碳青霉烯类抗生素，2.β-内酰胺类/酶抑制剂,3.氨基糖苷类抗生素如阿米卡星，4.头霉烯抗生素如头孢西丁。在超广谱β-内酰胺酶检测条件不具备的地方，临床可以通过实验室报告的作推测治疗，若药敏报告提示三代头孢例如头孢泼肟、头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松有二者以上耐药极有可能是产超广谱β-内酰胺酶。治疗原则是：1.碳青霉烯类抗生素，2.β-内酰胺类/酶抑制95(1)．纸片初筛：培养基：Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度:头孢泼肟10ug或头孢他啶30ug或氨曲南30ug或头孢噻肟30ug或头孢曲松30ug（使用两个以上纸片做筛选试验可提高检出灵敏度）接种：按标准纸片扩散法孵育条件：35℃大气环境孵育时间：16-18小时结果：头孢泊肟抑菌环≤22mm，头孢他啶抑菌环≤22mm，氨曲南抑菌环≤27mm，头孢噻肟抑菌环≤27mm，头孢曲松抑菌环≤25mm，=可能产生ESBL。建议质控方法:大肠埃希菌ATCC25922（参考NCCLS抑菌标准）

肺炎克雷伯菌ATCC700603:头孢泼肟抑菌环9-16mm,头孢他啶抑菌环10-18mm,氨曲南抑菌环9-17mm,头孢噻肟抑菌环17-25mm,头孢曲松抑菌环16-24mm。(1)．纸片初筛：96纸片确证试验：培养基：Muller-Hinton琼脂药敏纸片浓度：头孢噻肟30ug、头孢噻肟/棒酸30ug/10ug和头孢他啶30ug、头孢他啶/棒酸30ug/10ug（确证试验须使用头孢噻肟、头孢他啶及两者与棒酸的混合纸片）接种：按标准纸片扩散法孵育条件：35℃大气环境孵育时间：16-18小时结果：混合棒酸药物纸片的抑菌圈直径比无棒酸药物纸片的直径大5mm以上=ESBL建议质控方法：大肠埃希菌ATCC25922单独药物和混合棒酸药物两种纸片的抑菌环直径相差不大于2mm。肺炎克雷伯菌ATCC700603：头孢他啶单独药物和混合棒酸药物纸片抑菌环较头孢他啶单独药物纸片抑菌环直径增大5mm以上，头孢噻肟单独药物和混合棒酸药物纸片抑菌环较头孢噻肟单独药物纸片抑菌环直径增大3mm以上。纸片确证试验：97医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件98液体稀释法初筛:培养基：CAMHB（调节好阳离子的M-H肉汤）抗生素浓度：头孢泼肟4ug/ml或头孢他啶1ug/ml或氨曲南1ug/ml或头孢噻肟1ug/ml或头孢曲松1ug/ml（使用1种以上药物做筛选试验可提高检出灵敏度）接种：按标准肉汤稀释法的规定进行孵育条件：35℃；空气孵育时间：16-18小时结果判读：生长=可疑有ESBLS的产生（即头孢他啶、氨曲南、头孢噻肟、头孢曲松MIC≥2ug/ml；头孢泼肟MIC≥8ug/ml

）质控建议：大肠埃希氏菌ATCC25922不长肺炎克雷伯氏菌ATCC700603，头孢泼肟MIC≥8ug/ml液体稀释法初筛:99液体稀释法确证:

培养基: CAMHB药物浓度: 头孢他啶0.25-128ug/ml,头孢他啶/克拉维酸0.25/4-128/4ug/ml和头孢噻肟0.25-64ug/ml,头孢噻肟/克拉维酸0.25/4-64/4ug/ml。确证试验需要同时使用头孢他啶、头孢噻肟，单独和联合克拉维酸复合制剂。接种: 按标准肉汤稀释法的规定进行孵育条件: 35℃空气孵育时间: 16-20小时结果判读: 对2个中任何一个药物的MIC，在加入克拉维酸后，MIC与不加克拉维酸的MIC值降低3个以上对倍稀释度，判定为ESBLs（如头孢他啶的MIC=8ug/ml，头孢他啶/克拉维酸的MIC为1ug/ml）。质控建议:肺炎克雷伯菌ATCC700603：联合克拉维酸的复合制剂的MIC与单药的MIC相比，应当降低3个以上对倍稀释度。液体稀释法确证:1002005年NCCLS新增奇异变形杆菌的ESBL试验药物纸片筛选(mm)MIC筛选(µg/ml)大肠/肺克MIC筛选(µg/ml)奇异变形头孢泊肟10μg1782*头孢他啶30

μg

2222氨曲南不用2不用头孢噻肟30

μg

2722头孢曲松不用2不用*只用于奇异变形杆菌(大肠杆菌和肺克是8µg/ml)

2005年NCCLS新增奇异变形杆菌的ESBL试验药物纸片101用标准ESBL表型确证试验,无改变RoutinescreeningnotrecommendedPerformESBLtestwhenclinicallyrelevant(e.g.,bacteremia)ConsultwithmedicalstafftodeterminewhentotestPracticalapproach,teststerilebodysiteisolatesUsestandardESBLscreentestwithslightmodificationDrug DiskScreenMICScreen用标准ESBL表型确证试验,无改变102ESBL试验QC频率纸片法和MIC法筛选试验表型确证试验每天/每周QC肺克ATCC700603*或大肠杆菌ATCC25922QA肺克ATCC700603*每天/每周QC

肺克ATCC700603*和大肠杆菌ATCC25922*ESBL基因在质粒上;QC株必需储存在-60C或以下ESBL试验QC频率纸片法和MIC法筛选试验表型1034、D试验-克林霉素诱导耐药试验：葡萄球菌对大环内酯类抗生素耐药表现为：①由msrA基因介导的主动外排机制，即M型耐药；②抗生素作用靶位的改变，即由erm基因编码的RNA甲基化酶对细菌核糖体50S亚基23SrRNA进行特定核苷酸残基甲基化，使药物与靶位的结合能力下降，导致对具有相同靶位的大环内酯类、林可酰胺类、链阳菌素B三类药物同时耐药，临床称为MLS型耐药。体外药敏试验又可将MLS型分为结构型（cMLS型）和诱导型（iMLS型）；cMLS型为红霉素和克林霉素均耐药；iMLS型红霉素耐药、克林霉素敏感。4、D试验-克林霉素诱导耐药试验：104

对大环内酯耐药的葡萄球菌可能对克林霉素的耐药,通过erm基因编码的23SrRNA甲基化也称为MLSB（大环内酯、林可和B型链阳霉素）耐药，或只对大环内酯类耐药（由msrA基因编码的外排机制）。对大环内酯耐药的葡萄球菌可能对克林霉素的耐药,通105

M-H平板或血平板，纸片相邻试验，对于葡萄球菌，距红霉素纸片（15μg/片）边缘15～26mm处放置克林霉素纸片(2μg/片)来进行检测；对于β-溶血链球菌，将克林霉素纸片(2μg/片)和红霉素纸片（15μg/片）贴在相邻的位置，纸片边缘相距12mm。M-H平板或血平板，纸片相邻试验，对于葡萄球菌106

35℃空气，16-24h孵育后，克林霉素抑菌环不出现“截平”现象，应报告分离株对其敏感。邻近红霉素纸片侧克林霉素抑菌环出现“截平”现象（称为“D”抑菌环），提示存在可诱导的克林霉素耐药，应报告分离株对其耐药，在报告中应注明“通过诱导克林霉素耐药试验，推测此菌株对克林霉素耐药，克林霉素对某些病人可能仍有效”；若无“截平”现象，则应报告菌株对克林霉素敏感。35℃空气，16-24h孵育后，克林霉素抑菌环107医院感染病原微生物鉴定及其耐药机制检测课件108谢谢！谢谢！1091、Geniusonlymeanshard-workingallone'slife.(Mendeleyer,RussianChemist)

天才只意味着终身不懈的努力。.202011:0311:03:10Aug-2011:032、Ourdestinyoffersnotonlythecupofdespair,butthechaliceofopportunity.(RichardNixon,AmericanPresident)命运给予我们的不是失望之酒，而是机会之杯。二〇二〇年八月五日2020年8月5日星期三3、Patienceisbitter,butitsfruitis