实验十三流式细胞技术检测肿瘤治疗药物诱导的细胞凋

实验十三流式细胞技术检测肿瘤治疗药物诱导的细胞凋亡指导教师：唐颖1.实验目的了解细胞凋亡、及流式细胞技术原理等基本知识。学习细胞凋亡的形态学观察和流式细胞术检测的方法。学习流式细胞技术标本的制作方法，了解流式细胞仪的使用。2.实验原理2.1细胞凋亡的基础知识2.2流式细胞技术的一般原理及应用2.3用流式细胞术检测细胞凋亡的原理2.1细胞凋亡的基本知识：定义：细胞凋亡是细胞在一定程序控制下的自主死亡过程。细胞凋亡同细胞分裂、细胞分化一样是机体生存和发育离不开的最基本的生物现象，通过凋亡可以平衡机体内细胞的数目，清除衰老、过剩、有害的细胞。细胞凋亡异常会引起免疫性疾病或肿瘤等。

（一）、细胞坏死是细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应。早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。继而溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起炎症。细胞凋亡与坏死的区别细胞凋亡与坏死的区别（二）细胞凋亡cellapoptosis

Kerr（1972）最先提出，与细胞坏死的区别是：①细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；②凋亡小体内有结构完整的细胞器；③不引起炎症；④线粒体无变化，溶酶体活性不增加；⑤内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图谱呈梯状；⑥凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。细胞凋亡与坏死的区别胸腺细胞正常凋亡形态学检测流式细胞法检测DNALadder检测荧光法检测凋亡鉴定方法2.2流式细胞技术的一般原理及应用

流式细胞术(flowcytometry)是以流式细胞仪(flowcytometer，FCM)为工具，在液流系统中对悬液中的单个细胞、细胞器或生物粒子的生物、物理和化学特性进行快速测量并自动分析，并根据这些特性将所需要的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的高技术。它的主要特点是，可以在单细胞水平上对大量细胞进行快速、准确、多参数的定量分析及分选，借此判断细胞的体积、DNA含量、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等许多重要参数，并可在无菌状态下，对活细胞进行分类收集，收集的纯度可达99％。

流式细胞仪仪工作原理理流式细胞仪仪（FlowCytometer））集激光技技术、电子子物理技术术、光电测测量技术、、电子计算算机技术、、细胞荧光光化学技术术、单克隆隆抗体技术术为一体的的一种新型型高科技仪仪器。散射光信号号FALS

SensorLaser散射光信号号RightAngleLightDetectorCellComplexitySSCForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSCIncidentLightSource前向角散射射光（FSC,ForwardScatter）细胞相对大大小及其表表面积侧向角散射射光（SSC,SideScatter））细胞颗粒度度及细胞内内细胞器的的相对复杂杂性外周全血细细胞散射光光双参数点点图（红细细胞溶解后后）流式细胞仪仪的检测信信号荧光信号使用荧光标标记的单克克隆抗体染染色，做多多色分析荧光信号的的强弱，反反映了细胞胞抗原的表表达含量荧光信号双色直接染染色数据分析数据存储:LISTMODE数据显示:直方图(Histogram)二维点图(DotPlot)等高线图(ContourPlot)密度图(Density)三维图（3DPlot）等等数据分析直方图分析析数据分析点图分析数据分析等高图和密密度图分析析2.3用用流式细胞胞术检测细细胞凋亡的的原理利用流式细细胞仪测定定细胞光散散射可对凋凋亡细胞进进行分析。。凋亡早期期细胞因体体积减小，，胞浆及染染色质固缩缩，FSC变小，SSC增大大，凋亡晚晚期细胞FSC、SSC均变变小，坏死死细胞则因因细胞膜通通透性改变变，细胞肿肿胀，FSC、SSC变大，，胞膜破裂裂，胞内含含物释出后后FSC、、SSC均均变小。用流式细胞胞仪也可以以根据DNA含量不不同，从细细胞群体中中鉴别凋亡亡细胞。凋凋亡细胞在在G1峰前前出现亚二二倍体峰，，即凋亡峰峰（Ap峰峰）。通过过此峰下的的面积值可可得出凋亡亡细胞在所所测细胞群群中所占的的比率（用用凋亡软件件定量）。。另外外，，细细胞胞凋凋亡亡受受基基因因调调控控，，有有赖赖于于某某些些蛋蛋白白质质的的合合成成，，用用流流式式细细胞胞仪仪可可同同时时测测定定凋凋亡亡细细胞胞的的FSC/SSC及及DNA/蛋蛋白白质质，，进进行行多多参参数数分分析析以以研研究究不不同同的的凋凋亡亡诱诱导导作作用用机机制制。。3.实实验验材材料料、、用用品品实验验材材料料：：培培养养的的Hela细细胞胞实验验用用品品：：①仪仪器器与与用用具具C02培培养养箱箱，，超超净净工工作作台台，，倒倒置置显显微微镜镜和和离离心心机机等等。。微量量加加样样器器(1µµl-1ml)，，0.5ml和和1.5ml的的Eppendorf管管，，20µµl、、200µµl和和1ml吸吸头头，，10ml培培养养瓶瓶，，载载玻玻片片，，盖盖玻玻片片等等。。②试试剂剂放射射线线菌菌素素D（（诱诱导导细细胞胞凋凋亡亡的的肿肿瘤瘤治治疗疗药药物物，，如如喜喜树树碱碱、、紫紫杉杉醇醇、、中中药药砒砒霜霜等等））；；荧荧光光探探针针：：用用PBS(pH7.4)将将PI配配成成500µµg/ml的的贮贮液液，，在在-20℃℃冻冻存存。。FACSCalibur,BDBioscience4.实实验验步步骤骤Hela细细胞胞的的传传代代培培养养诱导导细细胞胞凋凋亡亡：：向向对对数数生生长长期期细细胞胞中中加加入入放放射射线线菌菌素素D（（可可结结合合科科研研采采用用其其他他诱诱导导细细胞胞凋凋亡亡的的肿肿瘤瘤治治疗疗药药物物））分分别别为为0.25、、0.5、、1、、2、、4mg/L,作作用用6小小时时。。用胰胰酶酶消消化化以以上上五五个个样样本本以以及及对对照照的的细细胞胞，，吹吹打打收收集集于于离离心心管管中中，，1000r/min下下离离心心8分分钟钟，，倒倒去去上上清清。。加约约1mlPBS重重悬悬细细胞胞，，用用注注射射器器迅迅速速注注入入到到4ml4℃℃的的70%的的酒酒精精中中，，固固定定8小小时时以以上上。。去上上清清，，用用PBS4ml重重悬悬细细胞胞，，再再1000r/min下下离离心心8分分钟钟，，去去上上清清控控干干液液体体后后加加0.3mlPBS，，加加入入RNA酶酶A至至终终浓浓度度为为50ug/ml，，37℃℃孵孵育育30分分钟钟。。将样样品品插插到到冰冰浴浴中中，，停停止止酶酶的的作作用用。。待待冷冷却却后后加加入入50ug/ml的的PI1.5ml,放放于于冰冰上上在在冰冰箱箱中中染染色色至至少少30分分钟钟。。3个个小小时时之之内内在在流流式式细细胞胞仪仪上上检检测测样样品品。。5.实实验验结结果果正常常凋亡亡化疗疗前前后后胃胃癌癌活活检检标标本本中中Caspase-3+细细胞胞化疗疗前前(3.49%)化疗疗后后(94.86%)26KeylabofMedicineSchoolofSuZhouUniversity细胞胞凋凋亡亡————PI分分析析PI-Fluorescence#Events凋亡亡细细胞胞正常常G0/G1期期细细胞胞6.注注意意事事项项细胞胞数数目目要要充充分分；；为为防防止止细细胞胞成成团团，，可可在在用用流流式式检检测测前前用用筛筛网网过过滤滤。。可结结合合科科研研，，将将课课题题组组项项目目中中研研究究的的一一些些凋凋亡亡诱诱导导剂剂作作为为研研究究对对象象进进行行分分析析。。并并在在此此综综合合实实验验中中掌掌握握动动物物细细胞胞的的传传代代技技术术，，细细胞胞凋凋亡亡的的形形态态学学分分析析及及流流式式细细胞胞技技术术。。7.思思考考题题制备备流流式式样