体细胞胚胎发生

关于体细胞胚胎发生第一页，共四十四页，2022年，8月28日图4－1胚状体第二页，共四十四页，2022年，8月28日1.2体细胞胚胎发生

（somaticembryogenesis）由单细胞（体细胞）或一群细胞被诱导不断再生非合子胚，并萌发形成完整植株的发育过程称为体细胞胚胎发生。发生过程见图4－2（p61)。第三页，共四十四页，2022年，8月28日图4－2体细胞胚胎发生的各个时期单个细胞经过反复的细胞分裂形成一个小细胞团，它经历球形期、心形期和鱼雷形期的发育过程之后，最终由体细胞胚长成一个小植株。（Dodds和Roberts，1995）第四页，共四十四页，2022年，8月28日Kohlenbach关于胚的分类:(1)合子胚：由受精卵或合子形成的胚。(2)非合子胚：由合子之外的细胞形成的胚。体细胞胚—由孢子体细胞（除合子外）离体培养形成的胚。非体细胞胚—即指芽、短枝、愈伤组织、花粉胚、块茎、球茎等繁殖体。孤雌生殖胚—由未受精卵形成的胚。孤雄生殖胚—由雄配子体（小孢子花粉粒）形成的胚。第五页，共四十四页，2022年，8月28日2.

体细胞胚胎发生的途径直接途径：指从培养中的器官、组织、细胞或原生质体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎，中间不经过愈伤组织阶段(图4－3A，图4－3B)。这种“胚性细胞”是在胚胎发生之前就已“决定”了的。间接途径：指外植体先脱分化形成愈伤组织，再从愈伤组织的某些细胞，即重新“决定”为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎(图4－3C)。第六页，共四十四页，2022年，8月28日图4－3植物体细胞胚胎发生方式示意图A．由外植体外层细胞直接产生体细胞胚；B．由外植体组织内的细胞产生体细胞胚；C．愈伤组织表层细胞分化为体细胞胚(引自王亚馥等，2000)第七页，共四十四页，2022年，8月28日多数体细胞胚胎的形成是通过间接途径产生的。它通常分两个阶段完成：①胚胎发生丛（embryogenicclump，EC）的形成。②胚状体的发育。EC在转入降低或去除生长素、降低还原氮的培养基后，才能完成胚状体发育。第八页，共四十四页，2022年，8月28日关于体细胞胚胎的起源：体细胞胚胎究竟起源于单细胞还是多细胞，目前仍然有争论。但研究结果发现，绝大多数体细胞胚起源于单细胞（例子？）。但也有人认为它们起源于一个以上的细胞（证据？）体细胞胚发生的实质是细胞分化，即细胞在离体培养条件下，诱导部分基因开放，实现遗传信息的表达。第九页，共四十四页，2022年，8月28日3.影响体细胞胚胎发生的因子对于体细胞胚胎发生特别重要的是培养基中的两种成分，即生长素和氮源。第十页，共四十四页，2022年，8月28日

3.1生长素例子1：胡萝卜体细胞胚的发育（p65～66）

结论：在增殖培养基中生长素的存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少的。因此，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的“诱导培养基”。

第十一页，共四十四页，2022年，8月28日例子2：咖啡体细胞胚的发育（p66）

例子3：对甜橙驯化愈伤组织的详细研究，也证实了生长素对胚胎发生的重要作用（p66～67）

。最终结论：对于离体条件下体细胞胚胎发生来说，一个最低限度的内源或外源生长素是必不可少的。

第十二页，共四十四页，2022年，8月28日成功诱导体细胞胚胎发生的步骤：第一步，在生长素浓度高(2,4-D0.5～1mg／L)的培养基（增殖培养基）上诱导和增殖愈伤组织，高浓度生长素诱导愈伤组织局部细胞形成的分生组织细胞，称为胚性细胞团(EC)。第二步，将EC转移到极低水平生长素(0.01～0.1mg／L)或完全无生长素的培养基（胚发育培养基）上，EC发育为成熟胚胎。第十三页，共四十四页，2022年，8月28日其它激素的作用：细胞分裂素：BAP可促进胡萝卜愈伤组织的细胞分裂，但抑制它的成胚潜力；ZT促进；咖啡叶片愈伤组织要求激动素与生长素比例高。赤霉素：能抑制体细胞胚胎发生第十四页，共四十四页，2022年，8月28日3.2氮源除生长素外，培养基中氮源的形态也会显著影响离体条件下的胚胎发生。体细胞胚诱导和成熟需要大量氮素，通常为还原态氮如铵盐。例子1：野生胡萝卜体细胞胚诱导例子2：栽培胡萝卜体细胞胚诱导培养基中还原态氮和硝酸盐(NH4Cl＋NO3－)组合似乎更有利于许多培养体系的体细胞胚胎诱导。第十五页，共四十四页，2022年，8月28日欲使胡萝卜培养细胞形成体细胞胚，必须有一个最低数量的内源NH4＋存在(每千克鲜重的组织约5mmol)。如果内源NH4＋达不到这个临界值，细胞就不能进行胚胎分化。而要使细胞内NH4＋达到这个水平，不但需要有很少量的外源NH4＋存在(2.5mmol／L)，还需要供应相对浓度很高的NO3－(60mmol／L)。虽然对于胚胎发生来说，其他形式的还原态氮都不如NH4＋有效，但水解酪蛋白、谷氨酰胺和丙氨酸等也可用做可靠的代替品。第十六页，共四十四页，2022年，8月28日3.3其他因子钾的浓度：在野生胡萝卜中，高浓度的钾（20mmol／L）是胚胎发生所必需的。

溶解氧的含量：培养基中溶解氧的含量应低于一个临界值（1.5mg／L）。活性炭：培养基中加入活性炭也能提高胡萝卜细胞胚胎发生的频率。某些挥发性和非挥发性物质：抑制愈伤组织中的体细胞胚胎发生。

第十七页，共四十四页，2022年，8月28日4.体细胞胚胎发生的解剖学和细胞学在胡萝卜悬浮培养中，对愈伤组织形成和生长的解剖学和组织学的研究表明，在培养中存在着两种类型的细胞：①自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，一般不具胚胎发生潜力。②成簇成团存在的体积小而细胞质致密的细胞，具成胚潜力。第十八页，共四十四页，2022年，8月28日5.体细胞胚成熟和植株发育用脱落酸处理，体细胞胚可以发育成熟。高水平生长素能抑制茎尖分生组织发育，当胚性细胞悬浮液转入缺乏生长素的培养基时，胚胎常能发育成熟。与ABA结合，加入低水平的细胞分裂素（玉米素0.1µmol／L）可能有利于低密度细胞培养的胚胎发生。第十九页，共四十四页，2022年，8月28日体细胞胚胎发生可能重复发生，从成熟体细胞胚上又形成一些胚胎发生的新中心。体细胞胚的萌发阶段受到体细胞胚高度不同步发育的不利影响。各种物理因素也可能影响体细胞胚成熟，如温度、蔗糖浓度、光照等。第二十页，共四十四页，2022年，8月28日体细胞胚在无植物生长调节剂的琼脂培养基上萌发。单胚萌发的培养基最好添加低水平的玉米素(0.lmmol／L)。小植株形成大量叶片以后，应将其移栽到营养钵或蛭石中继续生长和发育。第二十一页，共四十四页，2022年，8月28日6.体细胞胚与合子胚的比较自学内容（p71~72）第二十二页，共四十四页，2022年，8月28日7.胚性培养物形态发生潜能的丧失7.1遗传假说培养细胞中细胞核物质变化，如多倍性、非整倍性和染色体结构突变，可能与长期培养物器官发生或胚胎发生潜能丧失有关。这种由遗传原因造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。第二十三页，共四十四页，2022年，8月28日7.2生理假说在某些情况下，形态发生潜力的下降可能是由于细胞或组织内激素平衡关系的改变造成的，或是由于细胞对外源生长调节物质敏感性的改变造成的。在这种情况下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化，但不一定就丧失了这种分化能力。因而，在这种情况下，如果改变外部处理条件，有可能够恢复细胞形态发生的潜能（器官和胚胎分化）。第二十四页，共四十四页，2022年，8月28日7.3竞争假说在复合多细胞外植体中，只有少数细胞能产生胚性细胞团，其余细胞没有细胞全能性。按照竞争假说，在有利于非胚性细胞生长的条件下，外植体中的非胚性细胞大量增殖，结果在不断反复继代培养的过程中导致胚性细胞逐渐消失。到了一定时期之后，培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。第二十五页，共四十四页，2022年，8月28日7.3竞争假说如果培养物中尚存少量胚性细胞，它们由于非胚性细胞的抑制作用，不能表达自身的细胞全能性，此时可以通过改变培养基成分，选择性地增殖具有胚发生全能性的细胞，有可能恢复培养物形态发生的潜能。第二十六页，共四十四页，2022年，8月28日8.体细胞胚胎发生的实际应用8.1无性繁殖由于胚性细胞生长和随后的体细胞胚发育可以在液体培养基中进行，所以将体细胞胚发生与工程技术结合，可以建立大规模的机械化或自动化培养体系。这种培养体系能循环生产大量的繁殖体（体细胞胚胎），且成本低廉。通过重复体细胞胚胎发生形成体细胞胚无性系。第二十七页，共四十四页，2022年，8月28日8.2人工（合成）种子的制备植物人工种子（plantartificialseed）概念最早由Murashige（1978）提出，它是指将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织（芽、愈伤组织、胚状体等）包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内形成的在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体（图4－4，图4－5）。第二十八页，共四十四页，2022年，8月28日图4－4人工种子第二十九页，共四十四页，2022年，8月28日图4－5人工种子萌发形成的幼苗第三十页，共四十四页，2022年，8月28日通过用人工种皮包被体细胞胚而制造人工种子（或称合成种子），用以繁殖遗传工程植物、减数分裂不稳定的基因型、自交不亲合植物、稀有的和珍贵的物种或远缘杂交种，以及通过人工授粉而得到的杂种等是当前的一个研究热点之一。第三十一页，共四十四页，2022年，8月28日8.2.1单胚人工种子的制造过程人工种子由包裹在防护层中的体细胞胚组成（图4－6），在制造单胚人工种子的时候，主要采用诸如藻酸钠一类的水凝胶作为体细胞胚的包被物质。当体细胞胚与藻酸钠混合以后，再滴人到硝酸钙或氯化钙溶液（100mmol／L）中，30min内表面即可完全络合，形成一层持久的种皮（图4－7，图4－8）。第三十二页，共四十四页，2022年，8月28日图4－6人工种子示意图（引自Redenbaugh，1990）第三十三页，共四十四页，2022年，8月28日图4－7用漏斗分离器生产藻酸钙包被的人工种子（引自Redenbaugh，1990）第三十四页，共四十四页，2022年，8月28日图4－8人工种子的制作第三十五页，共四十四页，2022年，8月28日表4－1可用于包被体细胞胚的几种水凝胶水凝胶浓度(％，W／V)络合剂浓度(mmol／L)藻酸钠0.5～5.0钙盐30～100藻酸钠及明胶2.05.0钙盐30～100角叉藻聚糖及洋槐豆胶0.2～0.80.4～1.0KCl或NH4CI500表4－1列出了可用做种皮材料的各种水凝胶。第三十六页，共四十四页，2022年，8月28日此外，在种皮基质中还可加入一些对体细胞胚有益的物质，如能促进生长的微生物、营养物质、生长调节物质、杀虫剂以及用于旱地播种的亲水性化合物等作为人工胚乳。

第三十七页，共四十四页，2022年，8月28日8.2.2工业化生产人工种子首先，必须建立起适当的组织培养技术体系，从中能产生高质量的大小一致和发育期同步的、功能像合子胚一样的体细胞胚。

促成体细胞胚同步发育的途径：（p75~76）（1）使用DNA合成抑制剂或低温培养（2）过筛（3）利用渗透压控制胚胎发育同步性

第三十八页，共四十四页，2022年，8月28日其次，还必须建立大规模自动化的液体培养体系，以便生产数量足够的体细胞胚。此外，生产具有适当水分含量的种皮的方法，掺入营养物质和其他附加物质的方法，以及用于包埋体细胞胚的设备等，也都有待改进。第三十九页，共四十四页，2022年，8月28日8.3分离可再生的原生质体的材料胚性愈伤组织、悬浮培养物和体细胞胚已作为许多植物原生质体分离的材料。这些培养体系中的细胞或组织在培养过程中表