单纯疱疹病毒1型糖蛋白真核表达载体构建及

独创的研究成果，不包含本人或他人已申请或其他用途使用过的成果。与作者签名 日期保护知识校攻读期间工作的知识单位属第四。本人保证毕业作者签名 导师签名 日期学科专业：病原生物 师：吴兴安教辅导教师：讲Sp2/0第四二O一一年四月缩略语 中 前 文献回 正 材料方 方 结 讨 参考文 个人简历和研究成 致 缩略语缩略 英文全 中文全

Acquiredimmunedeficiency Base Bovineserum Chinesehamsterovary Cytomegalo巨细 centralnervous 细胞毒性T deoxyribonucleicacid Deoxyribonucleosidetriphosphate

humanimmunodeficiency人类免疫缺陷 herpessimplexkeratitis 疱疹毒角膜炎 herpessimplex单纯疱疹 Interferon Internalribosomalentry Kilobase messenger 信使 Molecularweight Roundsper Sodiumdodecylsulfateamidegel

a Thelp Tris/（hydroxymethyl）aminom-

Unique Unique ：党引利 师：吴兴安教第四基础部微生物学教研室，西安中单纯疱疹（herpessimplex,HSV）是一种流行于全世界的疱疹引起失明，后者则常伴有较重的神经系统后遗症且可能引起；HSV-2则主要通过性引起常见的疱疹。近年的研究还显示HSV可增强引起（acquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS）的人类免疫缺（humanimmunodeficiency,HIV）及的几率，因此，有效治疗HSV对于预防HIV的也具有重要的意义[2]。目前对于HSV尚无有效的治疗，临床主要应用抑制DNA类药物进行治疗，不用g-1和gD1联合免疫对小鼠的保护作用要优于g-1单独免疫，提示gC1有可能用于增强的免疫效果]。本研究期工作的基础上，利用分子S11/构建了表达HSV- gC蛋白的真核表达载体PCI-neo-MARs-mCMV-IRES-DHFR-名为PCI-neo-MARs-mCMV；其次构建DHFR-L22R（即编码第22位亮氨酸L的CTT用编码精氨酸R的CGG替换）。将HSV-1gC、IRES和定获得阳性重组质粒PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R，大量制稳定表达HSV-1gC蛋白的CHO-K1细胞系与Sp2/0细胞系的建立与筛选将大量的重组质粒PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R甲喋呤（MTX）双筛选压力下筛选稳定转染细胞系，Slotblot方法检测表明细胞能稳定表达目的蛋白HSV-1gC。HSV-1gC蛋白的表达与鉴定糖填料进行目的蛋白纯化，纯化后SDS和Westernblot分析表明，成功ConstructionandexpressionofHSV-1gCglycoproteineukaryoticexpressionCandidateformaster:DangYin-liSupervisor:WuXing-Departmentofmicrobiology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,ChinaTheprevalenceofHSVinfectionisconsiderablyworldwide.HSV-1isacommoncauseofmucosalherpes,herpetickeratitisandencephalitis.Herpetickeratitisistheleadinginfectiouscauseofblindness.Encephalitisisoftenpaniedbysevereneurologicsequelae.HerpesgenitalisisasexuallytransmittedinfectioncausedprimarilybyHSV-2.HSVinfectionincreasestherateofhumanimmunodeficiency(HIV)infectionandtransmission,whichcancauseacquiredimmunedeficiencysyndrome(AIDS).Untilnow,notreatmenthasshowobviousefficacytoHSVinfection.DrugswhichcanrestraintheviralDNAreplicationusedintheclinical,cannoteradicateHSVinfectionandeasytoproducedrug.Vaccinationhasremainedthebestmethodforpreventingspread,butHSVvaccineisstillunderpreclinicalphase.Onereasonisthecanprovideasurvivaladvantageinvivobyimmuneevasion.HSVgCisaC3bbindingcomplementregulatoryproteinwhilegE/gIformacomplexthatbindstheFc ofIgG,inhibitingactivationofcomplementandADCC.RecentstudiesshowthatcombinedimmunizationwithgC-1andgD-1conferredhigherprotectioninmicethangD-1alone,suggestinggC-1mayb use t enhanc th immun effec o th vaccineConstructionofeukaryoticexpressionvectorPCI-neo-MARs-mCMV--IRES-DHFR-WeconstitutedplasmidPCI-neo-MARs-mCMVusingMARs-mCMVtoreplacethepriorpromoterhCMV.TheDHFR-L22Rgenewasconstructed(thecodeCTTwassubstitutedforthecodeCGGwhichencodedaminoacidfromLeutoArg).HSV-1gCgene,IRESgene,DHFR-L22RgenewereclonedintoeukaryoticexpressionvectorPCI-neo-MARs-mCMV.The binantplasmidPCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22Rwasgotanddigestedwithrestrictionendonucleases.Alargeamountofthe binantplasmidwaspreparedandpurified.Stableandhighlevelexpressionoftheherpessimplextype1(HSV-1)glycoproteinC(gC)geneinCHO-K1andSp2/0cells. binantplasmidwastransfectedintoCHO-K1andSP2/0cellsbytheinstructionofLipofectamineTM2000forstableexpression.ThestableexpressioncellstrainswereselectedbyG418andmethotrexate(MTX).CHO-K1andSP2/0cellsstablyexpressingHSV-1gCproteinwereestablishedanddetectedbySlotblot.Stablytransfectedcellswerecultivatedabundantly,andtheculturedsupernatantswascollectedandconcentrated.TheexpressedgC-1proteinwaspurifiedwithHis-NiSepharosecolumn.Afterpurification,gC-1proteinexhibitedamajorCoomassieblue-stainedbandonSDS-polyacrylamidegelsandwasdetectedbyWesternysiswithanti-HismAb.TheresultsshowedthatthegC-1proteinwasexpressedandithasaspecificbinding：HSV;gC;expression;CHO-K1; 单纯疱疹（herpessimplex,HSV）是一种流行于全世界的疱疹性疾病病原体[1]，其有两种型，即HSV-1和HSV-2，两型的DNA有50%的同源性。HSV-1主要人的口腔、皮肤黏膜、眼黏膜及中枢神经系统，引起龈口炎、唇疱疹、咽炎、角膜炎和疱疹性脑炎；HSV-2通常为体一旦HSV，很难被有效清除[2]。在发展中国家，HSV-2流行率高达41%-83%，且HSV-2和HIV呈明显相关[6]。而在，大约有58%的人HSV-1，17%的人HSV-2[3]，且其每年新发数达到70万，复发的约有1000万。近年来我国的HSV迅速上升，其中HSV-1的显著增多[7]。多处于临床前研究阶段，格兰素史克公司（GlaxoSmithKline，GSK）发了2型HSV（HSV-2）糖蛋白D（gD-2）的亚单位，该只对HSV-1和HSV-2的女性有效，而对于和HSV-1阳性女性群体，预防HSV-2的效果均不理想，该结果如获得进一步证实后有可能上市。而以逃避机体的免疫反应。研究发现，gC与gE/gI复合物与HSV的免疫逃避机毒的致病力将大大降低[5-8]。鉴于此作用，我们构建了HSV-1gC真核表达载gC细胞株并鉴定，为疱疹的研究和奠定基础。文献回一、单纯疱疹研究进单纯疱疹概（herpessimplexkeratitis，HSK）是最常见的性眼病之一，其是一种严态[12]，在机体免疫力低下时,潜伏的HSV-1可重新活化,引起HSK的复增强引起（acquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS）的人类免疫缺陷（humanimmunodeficiency ,HIV）及的几率[19-20]。单纯疱 研究现从开始发现HSV到现在，其发展经历了相当长的过程，随着灭活及其亚单位对于HSV的研究始于70年前，最早的灭活HSV是将在细胞中培养的用化学方法灭活制成的，KernandSchiff,Skinner,Dundarov,Kavaklova等研究者都过此种是有效的[21-23]，但是这种早期的白的污染、清除大量的和清除残余的DNA来达到[24-25]。此[27]和Skinner，而Skinner是部分纯化的HSV-1包膜糖蛋白，但试验发现其对HSV-2也有交叉保护作用。另一类灭活亚单位是围绕以上大部分试验性亚单位的临床前评估都证明其对于动物（鼠，豚鼠，兔子）的致死性HSV有保护作用；作为预防性，其只能减少携带神经节细胞的数目，不能完全建立潜伏状态；而作为治疗性，其可以限制潜伏状态的建立，所以重新活化的频率和才起作用，这样在重新活化之前，对于免疫时间和免疫剂量就有比较严格的要求。另外发现，在接种时所用的佐剂对于发挥作用也至关重要，据Bourne，HSVgD2亚单位与铝佐剂和3ˊ-脱酰单磷酸脂质A（3-dMPL）联合使用HSV-1HSV-2的，都可以起到有效的保护作用，而且可以减少豚鼠的HSV再发，这种佐剂对于人类同样重组HSVDNA的方法来获得大量纯化的HSV糖蛋白成为可能。人们在大肠杆菌和/或哺乳动物细胞等多种表达系统HSV12HSV包膜糖蛋白中绝大多数重组HSV的研究都集中于HSVgB和gD糖蛋白的研究，这主要取决于HSVgB和gD在吸附和穿入宿主细胞过程中发挥着HSVgDHSVgD中和抗体可以抑制穿入宿主细胞[31]；后来发现，HSVgD还可以与细gD1和gD2TNF受体相互作用[32-33]。HSVgB与易感细胞表面的氨基葡聚糖结合，介导吸附；同时HSVgB至少有五个连续抗原表位和非连续抗原表位，其中两个与中和抗体反应；另外，HSVgB498-505抗原表位与特异性细胞毒性T淋巴细胞反应[34]。和皮下局部，而且对HSV-2引起的也起到交叉保护作不同的是，gC单独免疫没有保护作用[35]，而gE对眼部的HSV有一定的保护作用。HSVgB、gD和gE三种糖蛋白混合制成的多价亚单位对于角膜疱疹非常有效，而且成功的降低了豚鼠HSV-2的复发频率。需要注意的是，所有以上的亚单位的作用都是佐剂和抗原剂量依赖的。对给小鼠起到保护作用[36]，HSZP免疫时也可以得出相似的结果。而对于人类，约100μg亚单位与铝佐剂联合使用能引起适中的免疫反应，试验发现反应接种后，其中40-60%的人中和抗体ELISA检测呈此类重组亚单位的研究较多，目前代表性为已进入Ⅲ期临床试验的HSVgD2gB2-MF59和HSVgD2-铝剂-MPL。Chiron公司终止了HSVgD2gB2-MF59的研发，gD2gB2-MF59是将重组HSVgD2HSVgB2糖蛋白与佐剂MF59配伍制成，临床研究显示，该可以诱导机体产生高效价的中和性抗体，但不能有效抑制HSV-2的[37]；格兰素史克的亚单位，其含两种佐剂，分别为铝佐剂和3ˊ-脱酰单磷酸脂质A阳性的女性群体和所有则无明显保护作用，之后GSK公司正在与减毒活减毒活是通过敲除等方法将HSV的毒力、潜伏期或等相关删除，使其无致病性或致病力低，但仍然能够保持的增殖能力和免疫原性。HSV的编码约有80个，编码各类型的蛋白，包膜糖白gB和gD对于在体内增殖是必不可少的，而那些与增殖无关紧要的糖蛋白（比如gE），也可能与在体内神经中枢中扩散相关，所以筛选（ICP27）和/US1（US/UL接头处，编码立即早期调控蛋白ICP22），通过这些敲除来达到减毒目的，这些缺陷虽然可以诱导特异性T细胞反应，但不能产生子代[39]；Forrester等研制出一种新的减毒活HSVgHdel突变体，接种小鼠耳部研究发现，这体，其免疫原性在动物模型豚鼠中已经验证，而且这种缺陷可以减小致株的潜伏范围，同时对于急性角膜炎有保护效应[43]；Keadle等发现敲除HSVUL41（编码宿主关闭蛋白vhs，可以通过关闭宿主细胞发[44]；WachsmanHSV-2毒株中敲ICP10/RR（核糖核苷酸还原酶大亚基）的突变体免疫小鼠后，再用致病性HSV-2毒株经皮内或进[]Whitle株了R7017（TK–）重组体，其是敲除了TK以及UL/US交接处，目的是去除部分编码立即早期蛋白的和神经毒性相关是在R7017的基础上，重新将TK到UL/US交接处，不幸的是，DNADNA分成两类：第一类为（或细菌）DNA，是将目的基因重组到其他不致病（或细菌）组中；第二类是DNA，是一般接种于肌肉和/或皮下，肌肉细胞或表皮细胞表达的抗原随后由质粒免疫后，对于致病性HSV-1都有很明显的预防效果；对于内HSV-，表达HSV-2gD和gB的质粒联合免疫起到的保护效果优于gD2DNA疫苗单独免疫[49]。先前有研究，杆状表达HSV糖蛋白gB，gC，gD，一些编码细胞因子的质粒与DNA共同免疫后可起到佐剂作用HSVgDDNA与IL-8cDNA和/或化学诱导物RANTES共注射，可以增TH1型免疫反应；IL-12，与HSVgD2DNA共同免疫小鼠，可以增IL-18和IFN-γ质粒与HSV-1gB质粒共同免疫，同样起到佐剂作用：其中CpG序列与HSVgBDNA联合免疫可以保护小鼠免受HSV-2毒株的[53]二、单纯疱 包膜糖蛋白C研究现单纯疱疹糖蛋白C的结构和功分C3b，其是补体级联反应的一个重要蛋白。HSVgC糖蛋白与哺乳动物补体HSV-1UL44编码，其有四个不同的区域介导C3b结合，有八个半胱氨酸残基形成四个链内二硫键；HSVgC-2是一个480个氨基酸的蛋白，通过HSV-2UL44编码，有三个介导C3b结合的区域，其半胱氨酸的位置与注：SIG表示信号序列；TM表示穿膜区域；黑色圆球表示可能的N-糖基化位点；C表示半胱氨酸；黑色椭圆球表示C3b结合区域；两个半胱氨酸之间连线表示链内二硫键。图1单纯疱疹gC-1和gC-2线性结构图Fig.1SchematicfiguresofHSVgC-1andgC-（JohnLubinski,etal.CellDevelopmentalBiology,1998,0242:329-HSV-2的其它蛋白干扰C3b的结合；在转染和细胞，HSVgC-1保护细胞和gC突变株比野生型毒株大约有效50倍[54]HSVgC-1是一个多功能的蛋白，除了抑制补体激活外，还能介导33-123150周围的不仅如此，最近有研究显示，HSVgC与gE通过中和抗体对gB-gD间、gD-gH/gL间或gB-gH/gL间相互作用的干扰，而其彼此之间的相互作用2HSVgCgEFig.2FiguresoftheinteractionofHSVgCand（HookLM,etal.JVirol,2008,82(14):6935-单纯疱疹gC在研究中的应HSVgE/gIIgGFc段的复合物，阻HSVIgG的激活补体和ADCC作用通过Fc区结合；而HSVgC是C3b结合补体调控蛋白，同时还能介导结合细胞表面硫酸乙酰肝素。补体和抗体是抗的两条重要的抵御主线，而HSV可以过gE/gI和gC干扰机体的免疫反应，这些协同的免疫逃逸行为能使逃避宿主的，对体内和体外的提供生存优势。有研究者发现，在小鼠体内经过所产生的抗HSVgC的抗体并不能HSVgC在介导、参与的免疫逃逸以及诱导宿主免疫反应研发新型，有效的预防和治疗疱疹具有重要的现实意义。 单纯疱疹1型糖蛋白C真核材菌种与载体E.coliJM109：型recA1supE44endA1hsdR17(rk－，mk＋)gyrA96relA1thiA△(Lac-proAB)F′[traD36proAB+LacIqLacZ△M15]，由本保存。用Inoue法感受态细胞，以200l/管分装后-70℃冻存备用。pCI-3与核糖体进入位点（InternalRibosomalEntrySite,IRES）由本室前期克隆入真核表达质粒pCI载体中保存，命名Fig.3pCI-neoandpCIvectorcircle细胞与细胞培养液滤膜过滤除菌。完全培养液含2%或10%热灭活的新生牛（购自杭州四，1%0.1M7.2左右，4℃保存备用。不含的为不完全培养液细胞小液L-G溶液（0.2M：称取2.9克L-谷氨酰胺（分子量146.15，用纯水溶解至100ml，0.22m滤器过滤除菌，分装青霉素小瓶，-20℃冻存。双抗溶液（青、链霉素（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸N′-2-ethanesulfonicacid,N-2-羟乙基哌嗪N′-2-乙基磺酸，分子量238.3)，用纯水溶解至100ml，过滤除菌，分装青霉素小瓶，4℃冻存。中，0.22m滤器过滤除菌，分装青霉素小瓶，-20℃冻存。细胞冻存液的配制：5ml新生牛+4ml不完全RPMI-1640+1ml工具酶及试剂工具T4DNA连接酶、TaqDNADNA主要试剂试剂名 来抗HSV单克隆抗体（mAb）4C9 本前期小鼠抗His Invitrogen公IRDye800CW-抗小鼠IgG LI-COR公司 HisNiSepharose纯化填 GE公 细菌培养基peextract、5NaCl，搅拌溶5NNaOHPH7.0，定1L。高琼脂氨苄平板：称量1.2克琼脂粉，加入100ml2×YT培养基中，提前灭菌的直径为90mm的培养皿中，凝固后倒置，4℃保存备用。常用缓冲液体系SDS缓冲液系统（Lowerbuffer1.5mol/LTris·HCl(pH8.8)Tris溶解800ml纯水中0.1mol/LHClpH8.8，定容至1000ml。 buffer1.0(pH6.8)Tris800ml0.1mol/LHClpH6.8，定容1000ml。0.150ml1MDTT50mMDTT。10×电泳缓冲液：Tris15.1g94g，SDS5g，溶解加水定容至1000ml，室温保存，用时稀释10倍。染色液：考蓝R-2500.1%，25%异丙醇，10%冰醋酸脱色液：100ml醋酸，50ml1L，混匀后使用，可以反复使用3-5次。Western-Blot缓冲液系统Tris1L。TBS缓冲液：Tris2.42克，NaCl8.761L，室温TBST缓冲液：TBS0.05Tween-200.01MPBS（pH7.4：140mMNaCl，27mMKCl，8mMNa2HPO4，1.5mMKH2PO4。封闭液：5%脱脂奶溶1×TBS主要仪器 CO2恒温培养 Heraeus公 Boney公司 Costar公司 BIO-RAD公司Mini-PROTEAN®产 LI-COR公30K超滤 ThermoForma公司方Inoue法 JM109感受态细胞3716-20h2-3mm。挑取一个单菌落接5ml2×YT培养基中，37℃摇床（250rpm）8-10h。将上述初始培100ml2×YT5μl25μl，第30minOD600=0.55时，将培养物迅速置于冰10min100ml4ml1.5ml预冷离心的Inoue转化缓冲液，用枪头轻轻混匀重悬沉淀，然后再分成两支（200μl/支），15μlDMSO3～4次，混匀后冰上放置5-10min。预先在塑料袋中装些液氮，放入的感受态，再用镊子袋口，将剩余液氮倒出，好的感受态细胞迅速于-80℃冰箱中保存抗HSV单克隆抗体（mAb）4C9腹水的HSV单克隆抗体（mAb）4C937℃水浴迅速融化，将细胞悬液移入37℃预热的5mlRPMI-1640无培养液中，1000rpm离心5min，弃上清。沉淀加入含10%新生牛的RPMI-1640培养液，转入培养瓶，置于5%CO2、37℃孵箱培养，次日换液。BALB/c小鼠预将培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm10min，弃去上清，用无1～2×106/ml0.5ml腹（注意使小鼠头部抬高只小鼠一次可抽腹水1-3ml2～31～3次。将抽取的腹水经改造PCI-neo载BglⅡ和NheⅠ双酶切pCI-MARs-mCMV-IRES与PCI-neo载体，将切下HSV-1gC的合根据GenBank中HSV-1组序（序列号NC_001806选取gC-1胞外区1-457a.a编码，并对编码碱基进行优化，为利于表达的重组蛋序列为MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG，在5’端加入NheI酶切位点和6×His尾用于纯化，3’端加上终止码TAA和克隆用的MluI酶切位点，片段大小共1390bp(序列见结果部分)，交由TaKaRa公司进行全合成，合成后克隆至pMD19-TSimple载体中，命名为pMD19-T-gC1。L22R突变型DHFR的构L22RDHFR(1-96bp)合根据GenBank国仓鼠DHFR序列，合成5′端起始码和EcoRI之间1－96bp的序列，并把编码22位亮氨酸（L）的CTT用编码精氨酸（R）的CGG替换，两端分别加入克隆所需的XbaI和EcoRI酶切位点，基DHFR(1-96bp)。DHFR（97-468bp）的线性化，突变后未改变氨基酸编码。根据GenBank国仓鼠上游引物u5′-CCGGAATTCAATTCCAAAGAATGACCACCAC-3（以上引物由金斯瑞生物科技合成PCR扩增DHFR（97-468bp）片DHFR质粒模 10×PCR缓冲 25mM 25nM 上游引物 下游引物 Taq 总体 50PCR反应条件：953min；9430sec，5030sec，721min，共30个循环；循环完后72℃延伸10min；4℃保存。5µlPCR1PCR产物采用小量DN段快速胶回收试剂盒回收纯化，具体操作见试剂盒说明书。回收后取1µl电泳鉴定，其余置于-20℃保存备用。pMD19-T-DHFR-L22R的构EcoRINotIpMD19-T-DHFR(1-96bp)PCR纯化后的DHFR（97-468bp），胶回收试剂盒回收。16℃连接过夜，取连接产8µlInoueE.coliJM109100µl细菌中，涂布于氨苄抗并经EcoRI和NotI双酶切鉴定，筛选阳性克隆后证实，命名为PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R真核表达载体的构建NheI和MluIpMD19-T-gC1质粒，MluIXbaI双酶切分别胶回收获取gC1、IRES和DHFR-L22R全长，先后克隆入PCI-neo-MARs-mCMV载体，酶切鉴定筛选阳性克隆，命名为真核细胞CHO-K1Sp2/0G418MTX的敏感度确700g/ml、800g/ml、900g/ml、1000g/mlCHO-K1的生稳定转染CHO-K1细胞系与稳定转染Sp2/0细胞系的建立与筛选夜，观察细胞密度达到90%~95%时做转染，参照Lipofectamine2000reagent脂转染说明书进行。PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R和空载体质粒各10g分别与10L的Lipofectamine2000reagent混合后转染，转染6h后换成含10％新生牛（无抗生素）的RPMI1640培养液。转染48h后换含终浓度为800mg/L的G418完全培养基筛选15-25天，待有新的抗性细胞克为800mg/L的G418、300nmol/L的MTX完全培养基筛选3周左右，按照BIO-RAD公司提供的蛋白Slotblot检测说明书进行细胞培养上清中蛋白检隆化，适时进行换液及蛋白Slotblot检测，取高表达阳性单克隆孔继续进行再次克隆化，检测取高表达阳性单克隆孔细胞转入24孔板，继而转入25cm23×105~5×105Sp2/0细胞690%~95%时做转染，方法同上。转染48h后换含终浓度为250mg/L的G418完全培养基筛选15-25天，待有新的抗性细胞克隆生长起来，将新的抗性细胞铺于96250mg/LG418、20nmol/LMTX完全培养基3BIO-RADSlotblot检测说明书进行细CHO-K1Sp2/025cm2培养瓶中长满后，其中2/3冻存，剩余1/3继续培养。稳定转染细胞系的无培养：将CHO-K1稳转细胞系与Sp2/0稳20mL30K1mLHisNiSepharose纯化填料进行纯化，收集的洗脱液用8%的分离胶做SDS。每孔上样量约为15μl，电泳完后，转移至PVDF膜。用5%的脱脂牛奶室温封闭2h，TBST漂洗膜3.0SDS检测目的蛋白gC-收集稳转细胞培养上清80ml，用30K超滤管超滤2mL，并用HisNiSepharose纯化填料进行纯化，收集的洗脱液用8%的分离胶跑SDS，然后用考蓝R-250染色液染色20min，之后换脱色液脱结HSV-1gC优化结我们对gC-1进行了全序列优化，将真核细胞编码使用率较低的密κ轻链前导肽序列替换了原的前导肽序列，促进表达蛋白的分泌，改变的编码数约占总数的20％。原序列与优化序列比对如下：第一行是GenBank中HSV-1组序列（序列号NC_001806第重组质粒PCI-neo-MARs-mCMV酶切鉴定BglNhe4700bp大小的条带，MARs-mCMVPCI-neo载体的启动子hCMV（见图4）。M:DNAwiderangeL1:PCI-neo-MARs-mCMVdigestedbyBglⅡandNheⅠ图4PCI-neo-MARs-mCMV重组质粒酶切鉴定图Fig.4Restrictiveenzymedigestionysis binantDHFR（97-468bp）的PCR结为450bp，与预期大小一致（见图5M:100bpmarker 图5DHFR（97-468bp）PCR结果Fig.5PCRproductofDHFR(97-PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR- 真核表达载体的构建MARs-mCMV片段、HSVgC1、IRES和DHFR-L22RPCI-neoIRES的两端（6 Nhe Mlu Xba Sal图6PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R重组质粒Fig.6SchematicfiguresofPCI-neo-MARs-mCMV-真核表达载体重组质粒的酶切鉴定7L1NheIMluI1400bp大小的条带，L2XbaISalI双酶切出600bp大小的条带，与预期573bp条带相符，即目的片段DHFR-L22R大小并经证实；L3是MluI和XbaI双酶切出约700bp大小的条带，即IRES大小；HindIII和EcoRI单切

M1:DNAwiderangemarker；M2:200bpLadderL1:NheIMluI双酶切重组质粒；L2:XbaISalIL3:MluIXbaI双酶切重组质粒；L4:HindIIIL5:EcoRI单切重组质粒图7PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R重组质粒酶切鉴Fig.7Restrictiveenzymedigestionysis binant真核细胞CHO-K1Sp2/0G418MTX的敏感度确300M；Sp2/0G418250g/ml，MTX筛选时用浓度为20M。稳定转染细胞系的筛用PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R转染CHO-K1细胞后G418MTX3Slotblot检测筛88SlotblotCHO-K1细胞高表达孔B1E4Fig.8StableandhighlevelexpressionofHSV-1gCgeneinCHO-K1cellE6、G3、G5G6（9E6、G3、G5和G6进行两次亚克隆，筛选出稳定转染高表达细胞系。Fig.9StableandhighlevelexpressionofHSV-1gCgeneinSp2/0cell用Westernblot分析PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22R真核100,000处出现目标条带（10），Mr105,000gC-1糖并不是其全长。M：Marker；1：gC蛋白样；2：空载体对照10HSV-1gCWesternblot检测结果Fig.10TheWesternblotysisofexpressedHSV-1gCSDS结果M：Marker；1：gC蛋白样；2：空载体对照11HSV-1gC蛋白SDS结果Fig.11SDS- ysisofthepurifiedHSV-1gC稳转细胞系稳定性检测和无培养，可以大规模悬浮培养，稳转Sp2/0细胞系无培养，状态较差，还需讨关于哺乳动物细胞表达系统由于哺乳动物细胞结构、功能和表达调控的复杂性，外源在哺需的元件。外源在哺乳动物细胞中的表达包括的转录、mRNA翻转化效率高、表达效果好，CHO细胞与Sp2/0细胞均具有以上特点，所以被（tPA）、人促红细胞生成素（EPO）、表面抗原（HBsAg）、干扰素胞中得到表达。在已的大约73种蛋白药物生产中，应用哺乳动物细胞培养的有35种，CHO细胞培养的就占27种，还有一些是用Sp2/0细胞HSVgC的表达比较，早期的研究表达gC的稳定转染细胞系甚至需要用HSV细胞进行辅助才能获得蛋白，虽然用昆虫细胞表达可以部关于载体本研究为提高HSVgC的表达效果采取了多项措施，首先我们对真核表同时在载体中克隆入核基质附着区(MatrixAttaentRegions,MARs)，其是真核生物染色质中与核基质(或核骨架)特异结合的DNA序列，此序列也有很大降低，pH7.65时只有野生型的1/4,000，pH值接近5时才与野生型相的表达低，如不考虑其他因素，理论上只有DHFR表达量较高的细胞才细胞几乎不能形成抗MTX的细胞克隆，而转染后的细胞可以表达DHFR-关于无培成培养基的基础上，引入成分完全明确的或部分明确的替代成分，使培题。进入20世纪80年代后，新的无培养基不断问世，人们经过研究发growthfactor,EGF）等，不少细胞即能在无供应的情况下生长，尤其是本实验中CHO细胞与Sp2/0细胞稳定转染细胞系均用无无动物组分培养基培养，CHO细胞基本能适应无培养基，但Sp2/0细胞大部分关于HSVgC-HSV-1gC是编码的免疫逃避分子之一：gC-1可以直接结合补体C3b，进而抑制补体介导的中和反应[56]Hook等选用HSV-1阳性、HSV-的患者研究HSVgC和gE对中和的影响，结果显示对gC/gE突变的中和能力要强于对野生型的中和能力，说明HSVgC和用HSVgC-1免疫小鼠提取的免疫球蛋白（Ig）可gC-1与C3b的结合，用1×106PFUHSV-1小鼠，未免疫的小鼠全部，10ng和50nggD单独免疫保护率分别为60％和90％，而10μggC和10ng或50nggD联合免疫保护本研究表达的分泌型HSVgC-1在Slotblot条件下可以和本室前期的性，用抗His抗体进行Westernblot检测可以检测出一Mr为100000的蛋白，天然HSVgC-1Mr为120,000左右，根据氨基酸序列推导的Mr为69,000，分子量区，去除了gC-1的C端54个氨基酸残此该表达产物应小于天然gC-1，他条带，以上均结果说明我们的表达产物比较完整。虽然我们已成功地用CHO-K1细胞表达了HSV可溶性gC-1，且目前已经获得能用SDS检测 构建了含HSV-1gC蛋白与DHFR-L22R的真核表达载PCI-neo-MARs-mCMV-gC1-IRES-DHFR-L22RgC-1蛋白CHO-K1Sp2/0细胞系，且其His-Ni琼脂糖填料进行目的蛋白gC-1，且其具有良好的特异性结合活性。参考文谷鸿喜,.医学微生物学.第一版,医学,2008:贾文祥,,,等.医学微生物学.第一版,:人民卫,2009:395-SitaAwasthiJohnM,LubinskiRoselynJ,etal.AnHSV-1gDmutantasanentry-impairedlivevaccine.Vaccine,2008,26(9):1195-1203.CoreyL,LangenbergAG,AshleyR. binantglycoproteinvaccineforthepreventionofgenitalHSV-2infection:tworandomizedcontrolledtrials.JAMA,1999,282(4):331-340. 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