基因工程的工具课件

专题1基因工程现代生物科技专题转基因抗虫棉普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)重组DNA导入形成基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达基因工程的概念识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是原核生物4000种。1、来源：2、种类：3、作用：4、结果：形成两种末端黏性末端平末端一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”1’2’3’4’5’脱氧核苷酸的结构3’端5’端3’端5’端G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯键磷酸二酯键8限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。限制性内切酶作用过程点击播放你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。基因的针线：DNA连接酶

G

AA

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CC

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GG

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CC

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C

G用同种限制酶切割ATGCATGC连接酶连接磷酸二酯键DNA连接酶的作用过程：二、DNA连接酶——“分子缝合针”作用部位：是磷酸二酯键（扶手）不是氢键（梯子）DNA连接酶将两条DNA链连接起来的酶。核苷酸分子的连接：ATGCATGCDNA聚合酶连接单链，把单个脱氧核苷酸连接到DNA片段上DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象

作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA连接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键E.coliDNA连接酶：连接黏性末端T4DNA连接酶：连接黏性末端平末端DNA连接酶种类2.载体的必要条件1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择4）必须是安全的，对受体细胞无害。5）载体DNA分子应大小适中，以便于提取和操作3.载体的种类①质粒②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4

DNA连接酶运载工具具备的条件1、2、3、4、5、质粒、噬菌体、动植物病毒第二节基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取目的基因主要是指______________________获取目的基因的常用方法①从基因文库中获取（基因组文库，部分基因文库）②利用PCR技术扩增目的基因（变性，复性，延伸）③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成编码蛋白质的结构基因基因文库基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）1.基因文库将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库（一）从基因文库中获得目的基因2.基因文库的构建方法①鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离（直接分离法）（一）从基因文库中获得目的基因②反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶核酸酶H2.基因文库的构建方法DNA聚合酶双链DNA(目的基因)（一）从基因文库中获得目的基因（二）利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制_____________的核酸合成技术③条件：____________________、

_______________、___________(做启动子)、___________等②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制模板DNA四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增（二）利用PCR技术扩增目的基因⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：目的基因DNA受热变性，解链b、复性（55℃-65℃）：引物与单链互补结合c、延伸（70℃-75℃）：合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸（二）利用PCR技术扩增目的基因三、根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量_____________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶切口DNA连接酶相同的黏性末端二、基因表达载体的构建质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种4.过程:二、基因表达载体的构建5.基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因二、基因表达载体的构建基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。终止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停止下来。标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。二、基因表达载体的构建小结：一、获取目的基因的常用方法①从基因文库中获取（鸟枪法构建基因组文库，逆转录法构建部分基因文库，目的基因在细胞内复制）②利用PCR技术扩增目的基因（目的基因在细胞外复制）③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种过程:二、基因表达载体的构建基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因二、基因表达载体的构建基因工程的基本操作程序第二课时转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达三、将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍（2）原理及适用范围三、将目的基因导入受体细胞2、将目的基因导入动物细胞三、将目的基因导入受体细胞显微注射法：转基因动物中采用最多，最为有 效的方法操作程序：表达载体提纯从雌性动物体内取出卵显微注射胚胎早期培养胚胎移植显微注射仪固定吸管微量注射针针尖极细（0.1至0.5μm）3、将目的基因导入微生物细胞（1）常用大肠杆菌：

（2）大肠杆菌的转化方法

首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。检测鉴定：①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交抗原抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源的DNA分子①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因方法——DNA分子杂交复性RNADNA②检测目的基因是否转录出了mRNA方法——③检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原抗体杂交鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等1.2基因工程的基本操作程序基因工程程序总结一、获取目的基因的常用方法①从基因文库中获取（鸟枪法构建基因组文库，逆转录法构建部分基因文库，目的基因在细胞内复制）②利用PCR技术扩增目的基因（目的基因在细胞外复制）③通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因二、基因表达载体的构建转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达三、将目的基因导入受体细胞检测鉴定：①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交抗原抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定1）以下说法正确的是A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来C随堂练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是

A、能复制

B、有多个限制酶切点

C、具有标记基因

D、它是环状DNAD随堂练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是

A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来

B、限制性内切酶用于目的基因的获得

C、目的基因须由运载体导入受体细胞

D、运载体和目的基因用同一种限制酶处理A随堂练习4）有关基因工程的叙述正确的是A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D随堂练习5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的