基因工程制药苏州培训

基因工程制药简介张义浜2017-05-20概述目的基因的获得基因的表达基因工程菌的培养基因工程药物的分离纯化传统制药（生化制药）存在的问题:1.材料来源或制造技术困难而无法研制出产品；

2.从动物脏器中提取易感染病毒；

3.存在免疫原性，使用受限制。基因工程制药的优点大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽提供足够数量的生理活性物质发现更多的内源性生理活性物质利用基因工程和蛋白质工程对生理活性物质进行修饰和改造，提高药效价值获得新型化合物，扩大药物筛选来源基因工程技术所生产的药物

用传统方法很难生产的，主要是药用活性蛋白质/多肽，包括：（1）免疫相关蛋白各种抗原、单克隆抗体。（2）细胞因子如IFN、IL、CSF、EGF、VIII、EPO（3）激素胰岛素、生长激素、心钠素、人脑激素、人松驰激素。（4）酶类尿激酶、链激酶、葡聚糖酶、组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂、SOD、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制剂。早期部分基因工程产品的研制、开发、上市时间产品研制国家用途上市国家人生长激素释放抑制素(SRM)1977日本巨人症人胰岛素1978美国糖尿病1982欧洲人生长激素（HGH）1979美国侏儒症1985美国人α-干扰素（IFN）1980美国病毒1985欧洲乙肝疫苗1983美国乙肝1986欧洲人白细胞介素（IL）1984美国肿瘤1989欧洲人促红细胞生成素（EPO）日本贫血1988欧洲人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美国人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）血栓症1987美国我国批准上市的部分生物技术药物批准年份药品批准年份药品1989IFN-α1b1999125AlaIL-2、人胰岛素、Anti-CD3鼠源单抗1992IFN-α2a2000人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表皮生长因子（EGF）、EGF衍生物霍乱疫苗（rBS-WC）1994白介素2（IL-2）2001抗IL-8鼠源单抗凝乳剂1995乙肝疫苗（酵母）2003IL-11、肿瘤细胞细胞核嵌合抗体注射液重组葡激酶（r-SAK）1996IFN-α2b，乙肝疫苗（CHO）粒细胞集落刺激因子（G-CSF）2004重组人p53腺病毒注射液抗EGFR人源单抗1997粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）重组链激酶（γ-SK）、EPO2005重组人脑利钠肽、重组人血管内皮抑素重组人5型腺病毒注射液（H101）、rhTNF-α、rhTPO1998IFN-γ、125SerIL-2、生长激素（GH）痢疾疫苗、牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）2006重组TNFR-Fc融合蛋白

什么是基因工程技术？ 基因工程（geneticengineering）：也称基因操作、遗传工程，重组体DNA技术，基因克隆或分子克隆，指将不同生物的遗传物质——基因，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体（质粒、噬菌体或病毒等）转入微生物、植物或动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。制备基基因工工程药药物的的基本本过程程获得目目的基基因↓↓构构建重重组质质粒↓↓组组建基基因工工程菌菌(或细胞胞)↓↓培养工工程菌菌↓↓产产物物分离离纯化化↓↓除除菌菌过滤滤↓↓半半成品品检定定↓↓成成品品检定定↓↓包包装装上游阶段选择表表达系系统主主要考考虑：：必须保保证所所表达达的蛋蛋白质质具有有生物物活性性考虑基基因工工程蛋蛋白质质表达达量的的多少少蛋白质质分离离纯化化的难难易程程度下游阶段基因的的克隆工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基目的基基因的的获得得一、反反转录录法二、反反转录录PCR三、化化学合合成法法常用的的方法法:一、反反转录录法为了克克隆编编码某某种特特异蛋蛋白质质多肽的的DNA序列，，可以以从产产生该该蛋白质的的真核核细胞胞中提提取mRNA,以其为模模板，，在反反转录录酶的的作用用下，，反转录录生成成该蛋蛋白质质mRNA互补DNA（cDNA第一链链），，再以以cDNA第一链链为模模板，，在DNA聚合酶酶Ⅰ作用下，，最终终合成成编码码该多多肽的的双链链DNA序列。。cDNA克隆示意图DNA聚合酶ImRNA

反转录酶ss-DNAds-cDNAds-cDNA核酸酶S1二、反反转录录PCR提取组组织或或细胞胞中的的总RNA，以其其中的的mRNA作为模模板，采采用Oligo(dT)或随机机引物物利用用逆转转录酶酶反转转录成成cDNA第一链，直直接以以其为为模板（不需需要合合成cDNA第二链链）进行行PCR扩增，获得得目的基基因，，用于于重组组、克克隆。。三、化化学合合成法法前提：：核苷苷酸序列已已知；；或已知知其蛋蛋白质质的氨氨基酸酸序列列，再再推导导出核核苷酸酸序列列限制性性：1）不能能直接合成太太长的的基因因；2）遗传传密码码的简简并性性可导导致中中性突突变；；3）成本较高DNA合成仪基因的克隆隆与表表达基因表表达：：基因在在生物物体中中的转转录、、翻译译及所所有加加工过过程。。基因高高效表表达：：外源源基因因在某某种宿宿主细细胞中中的表表达活活动，，即剪剪切下下一个个外源源基因因片段段，重重组到到另一一个基基因表表达体体系中中，使使其能能获得得既有有原生生物活活性又又可高高产的的表达达产物物。基因表表达研研究的的主要要问题题：目目的基基因的的表达达产量量、表表达产产物的的稳定定性、、产物物的生生物学学活性性和表表达产产物的的分离离纯化化。建立最最佳的的基因因表达达体系系，是是基因因表达达设计计的关关键一、宿宿主菌菌的选选择宿主菌菌应满满足以以下要要求：：具有高高浓度度、高高产量量、高高产率率；能利用用易得得廉价价原料料；不致病病、不不产生生内毒毒素；；发热量量低，，需氧氧低，，适当当的发发酵温温度和和细胞胞形态态；容易进进行代代谢调调控；；方便重重组DNA操作；产物容容易提提取纯纯化。。1.原核细细胞（1）大肠肠杆菌菌表达产产物的的形式式：细细胞内内不溶溶性表表达(包涵体体)、胞内内可溶溶性表表达、、细胞胞周质质表达达，极极少数数情况况下也也可分分泌到到细胞胞外。。不同同的表表达形形式具具有不不同的的表达达水平平及完完全不不同的的杂质质。大肠杆杆菌表表达外源基基因的的优势势全基因因组测测序，，遗传传背景景清楚楚（共共4405ORF）基因克克隆表表达系系统成成熟完完善繁殖迅迅速、、培养养简单单、操操作方方便、、遗传传稳定定被美国国FDA批准为为安全全的基基因工工程受受体生物缺陷缺乏对对真核核生物物蛋白白质的的复性性功能能缺乏对对真核核生物物蛋白白质的的修饰饰加工工系统统内源性性蛋白白酶降降解空空间构构象不不正确确的异异源蛋蛋白细胞周周质内内含有有种类类繁多多的内内毒素素（2）枯草草芽孢孢杆菌菌分泌能能力强强，可可将蛋蛋白质质产物物直接接分泌泌到培培养液液中，，不形形成包涵体；不能能使蛋蛋白质质糖基基化，，另外外由于于它有有很强强的胞胞外蛋蛋白酶酶，会会对产产物进进行不不同程程度的的降解（3）链霉霉菌重要的的工业业微生生物。。不致致病、、使用用安全全，分分泌能能力强强，可可将表表达产产物直直接分分泌到到培养养液中中，具有一一定的的糖基化能力2、真核细胞胞（1）酵母特点：真核生物细细胞，表达达产物能糖糖基化；基因组小，，仅为大肠肠杆菌的4倍；世代时间短短，繁殖迅迅速；基因操作与与原核生物物相似；建立了有分分泌功能的的表达系统统，将产物物分泌出胞胞外，分离离纯化工艺艺相对简单单。（2）丝状真菌菌特点：有很强的蛋蛋白分泌能能力；能正确进行行翻译后加加工，包括括肽剪切和和糖基化等等;其糖基化方方式与高等等真核生物物相似；丝状真菌（（如曲霉等等）等被确确认是安全全菌株，有有成熟的发发酵和后处处理工艺。。真核生物和和原核生物物基因表达过程示意图图克隆载体:克隆了外源DNA后，转入宿宿主细胞中中进行繁殖殖，使克隆的DNA片段数量大大大增加表达载体:将外源基因或或DNA片段在宿主主细胞中表表达蛋白质插入型载体体:将外源基因因或DNA插入其中置换型载体体:切除载体部分DNA，代之以外外源基因或或DNA。载体（vector）质粒（plasmid）质粒是生物物细胞内固固有的、能能独立于寄寄主细胞染染色体外而而自主复制制、并被稳稳定遗传的的一类核酸酸分子。绝大多数数质粒是DNA型的，天然然DNA质粒具有共共价、封闭闭、环状的的分子结构构，即cccDNA。基因克隆的的载体质粒粒DNA分子都具有有复制子、、选择性标标记、克隆隆位点。原核细胞表达载体非融合型pKK223-3分泌型PINⅢ-ompA1融合蛋白表表达载体pGEX结构包涵体型pBV220结构融合蛋白表表达载体非融合型表表达载体分泌型表达达载体包涵体型表表达载体（一）表达达载体表达载体必必须具备的的条件：载体能够独独立的复制制；具有灵活的的克隆位点点和方便的的筛选标记记,且克隆位点点应在启动动子序列后后，以便外外源基因表表达；具有很强的的启动子，，能为大肠肠杆菌的RNA聚合酶识别别；具有阻遏子子，使启动动子受到控控制，只有有当诱导时时才能进行行转录；具有很强的的终止子，，使RNA聚合酶集中中力量转录录克隆的外外源基因，，而不转录录无关的基基因；所产生的mRNA必须具有翻翻译的起始始信号，即即起始密码码AUG和SD序列，以便便转录后能能顺利翻译译。（二）影响响目的基因因在大肠杆杆菌中表达达的因素外源基因的的剂量外源基因的的表达效率率：A、启动子的的强弱：将将目的基因因插入大肠肠杆菌RNA聚合酶能识识别的强启启动子下游游B、核糖体结结合位点的的有效性C、SD序列和起始始密码的间间距D、密码子组组成：设计计引物或合合成基因时时选择大肠肠杆菌“偏偏爱”的密密码子表达产物的的稳定性：：A、组建融合合蛋白；B、利用信号号肽将真核核基因产物物搬至周质质空隙中；；C、位点特异异性突变，，增加蛋白白的稳定性性；D、采用蛋白白酶缺陷型型大肠杆菌菌，减弱降降解作用细胞的代谢谢负荷：A、宿主细胞胞的生长与与外源基因因的表达分分开；B、宿主细胞胞的生长与与重组质粒粒的复制分分开；C、形成不溶溶性的包涵涵体工程菌的培培养条件（三）真核核基因在大大肠杆菌中中表达的形形式1.以融合蛋白白的形式表表达药物基基因其氨基端是是原核序列列，羧基端端是真核序序列，以原原核多肽和和真核蛋白白结合在一一起，称融融合蛋白。。优点：操作作简便，表表达蛋白在在菌体内稳稳定，不易易被细菌酶类降降解；易实实现高效表表达；缺点：有免免疫原性，，需切除原原核多肽2.以非融合蛋蛋白的形式式表达药物物基因非融合蛋白白指在大肠肠杆菌中表表达的蛋白白质以真核核蛋白的mRNA的AUG为起始，在在其氨基端端不含细菌菌多肽序列列。优点：保持持原有蛋白白活性；缺点：易被被蛋白酶破破坏；可能能引起人体体免疫反应应3.分泌型表达达蛋白药物物基因将外源基因因融合到编编码信号肽肽序列的下下游。常用的信号号肽有：碱碱性磷酸酶酶信号肽；；膜外周质质蛋白信号肽；霍霍乱弧菌毒毒素B亚单位；优点：在周周质中稳定定，有活性性，不含甲甲硫氨酸残残基；缺点：产量量不高，信号肽不被切割或或不在特定定位置上切切割。酵母中的基因表达达（一）表达达载体1.载体的复制制序列（1）YEp类（酵母附附加体质粒粒）（2）YRp类（酵母复复制型质粒粒）（3）YCp类（酵母着着丝粒质粒粒）（4）YIp类（酵母整合型型质粒）2.克隆载体向酵母载体体中引入大大肠杆菌质质粒pBR322的ori部分和Ampr或Tetr部分，这样样构成的克克隆载体同同时带有细菌和酵酵母的复制制原点和选选择标记。。酵母常用的的选择性标标记：氨基基酸或核苷苷酸合成酶酶系基因，对对抑制酵母母生长的药药物具有抵抵抗力的抗抗性基因3.表达载体普通表达载载体：只能能方便地引引入外源基基因并进行行表达，对表达达产物的组组成，特别别是对其N末端氨基酸酸是否增减并并无严格要要求。精确表达载载体：要求求在启动子子或前导肽肽编码序列列的适当部位有有内切酶位位点，以利利于接入外外源基因，，并使它在表达达和加工后后N末端氨基酸酸序列与天天然产物相同，既无无多余的氨氨基酸，也也无缺失的的氨基酸。。（二）影响响目的基因因在酵母菌菌中表达的的因素1.外源基因的的剂量：质质粒拷贝数数及其在宿宿主细胞内内的稳定性性2.外源基因的的表达效率率：A、启动子B、分泌信号号的效率C、终止序列列的影响3.外源蛋白的的糖基化4.宿主菌株的的影响：A、菌体生长长力强；B、菌体内源源蛋白酶要要弱；C、菌株性能能稳定；D、分泌能力力强基因工程菌菌的培养基因工程菌菌发酵的基基本操作方方式有：分批培养分批培养操操作简单，，但因不能能控制生长长，获得的的菌体密度度也有限半连续培养养（补料分分批）在一次投料发发酵的基础础上，流加加一定量的的营养，使使细胞进一一步的生长，或得到更更多的代谢谢产物连续培养不断地流加加营养，并并不断地取取出发酵液液。连续培培养则多用用于动力学学特性和稳稳定性等研研究。透析培养固定化培养养基因工程菌菌培养方式式补料分批培培养补料分批培培养是将种种子接入发发酵反应器器中进行培培养，经过过一段时间间，间歇或或连续地补补加新鲜培培养基，使使菌体进一一步生长的的培养方法法。在分批培养养中，为保保持基因工工程菌生长长所需的良良好微环境境，延长其其生长对数数期，获得得高密度菌菌体，通常常把溶氧控控制和流加加补料措施施结合起来来，根据基基因工程菌菌的生长规规律来调节节补料的流流加速率。。连续培养连续培养是是将种子接接入发酵反反应器中，，搅拌培养养至菌体浓浓度达到一一定程度后后，开动进进料和出料料蠕动泵，，以一定稀稀释率进行行不间断培培养。连续培养可可以为微生生物提供恒恒定的生活活环境，控控制其比生生长速率，，为研究基基因工程菌菌的发酵动动力学、生生理生化特特性、环境境因素对基基因表达的的影响等创创造了良好好的条件。。但由于基因因工程菌的的不稳定性性，连续培培养比较困困难。为了了解决这一一问题，人人们将工程程菌的生长长阶段和基基因表达阶阶段分开，，进行两阶阶段连续培培养。在这这样的系统统中关键的的控制参数数是诱导水水平、稀释释率和细胞胞比生长速速率。优化化这三个参参数以保证证在第一阶阶段培养时时质粒稳定定，菌体进进入第二阶阶段后可获获得最高表表达水平或或最大产率率。透析培养透析培养技技术是利用用膜的半透透性原理使使培养物和和培养基分分离，其主主要目的是是通过去除除培养液中中的代谢产产物来解除除其对生产产菌的不利利影响。采用膜透析析装置是在在发酵过程程中用蠕动动泵将发酵酵液抽出打打入罐外的的膜透析器器的一侧循循环，其另另一侧通入入透析液循循环，在补补料分批培培养中，大大量乙酸在在透析器中中透过半透透膜，降低低培养基中中的乙酸浓浓度，并可可通过在透透析液中补补充养分而而维持较合合适的基质质浓度，从从而获得高高密度菌体体。膜的种类、、孔径、面面积，发酵酵液和透析析液的比例例，透析液液的组成，，循环流速速，开始透透析的时间间和透析培培养的持续续时间段都都对产物的的产率有影影响固定化培养养基因工程菌菌培养的一一大难题是是如何维持持质粒的稳稳定性。有有人将固定定化技术应应用到这一一领域，发发现基因工工程菌经固固定化后，，质粒的稳稳定性大大大提高，便便于进行连连续培养，，特别是对对分泌型菌菌更为有利利。由于这这一优点，，基因工程程菌固定化化培养研究究已得到迅迅速开展。。基因工程菌菌发酵中试试基因工程菌菌中试应考考虑的问题题：适宜商商品化生产产的工程菌菌，设计发发酵反应器器，选择反反应过程，，发酵培养养基组分，，维持生产产工艺最佳佳化的方法法，工艺监监测方法，，工艺控制制方法，工工艺自动化化使用方法法，生物催催化剂使用用，产品提提取方法的的选择，分分离精制技技术的选择择。基因工程菌菌的不稳定定性主要表现在重组组质粒的不不稳定性，，两种表现形式：：1）结构不稳定定性重组DNA分子上某一一区域发生生缺失、重重排、修饰饰，导致其其表观生物物学功能的的丧失2）分配不稳定定性整个重组DNA分子从受体体细胞中逃逸基因工程菌菌不稳定性性的可能产产生机制：受体细胞中限制修饰饰系统对外源重组组DNA分子的降解解外源基因的的高效表达达严重干扰扰受体细胞胞正常生长代代谢能量、物质的匮乏乏和外源基基因表达产产物的毒性性诱导受体体细胞产生生应激反应应：关闭合合成途径，，启动降解解程序重组质粒在在受体细胞胞分裂时的的不均匀分配重组质粒逃逸的基本本原因受体细胞中中内源性的的转座元件件促进重组组分子的缺缺失重排培养基比生长速率率限制性基质温度pH和溶氧外源基因表达遗传特性影响基因工工程菌稳定定性的因素素载体的选择择宿主的选择择外源基因整整合到宿主主染色体上上发酵工艺1.培养基一些基因重重组菌在复复合培养基基中显示较较高的质粒粒稳定性微生物在含含有有机氮氮源如酵母母抽提物、、蛋白胨等等营养丰富富的复合培培养基中培培养时，由由于培养基基提供了生生长必须的的氨基酸和和其他物质质，微生物物的生长较较基本培养养基快。培养条件对对基因工程菌菌稳定性的影影响2.比生长速率率基因重组菌菌的比生长长速率对质质粒稳定性性有很大影影响。提高高比生长速速率有助于于提高质粒粒稳定性。。基因重组菌菌的比生长长速率与培培养环境有有关，如温温度，pH，溶氧，限限制性营养养物质浓度度，有害代代谢产物浓浓度等。在在一定的温温度和pH下，限制性性基质浓度度往往是决决定比生长长速率的主主要因素。。3.限制性基质质一般培养基基中各成分分并不是完完全平衡的的，经过一一段时间的的培养，微微生物的生生长通常会会受到一种种或几种物物质的限制制。限制性性基质的种种类对重组组菌有不同同的影响4.pH和溶解氧pH和溶氧是影响响微生物生生长的重要要参数，在在发酵罐培培养基因重重组菌时，，通常都需需要维持一一定的pH和溶氧水平平。在基因因重组菌的的高密度培培养时，为为了维持所所需的溶氧氧水平，除除了提高搅搅拌转速和和通气量，，往往还要要在通入的的空气中补补充氧气，，以提高发发酵罐的供供氧能力。。5.外源基因的的表达外源基因的的表达会引引起重组质质粒的不稳稳定；尤其其当外源基基因高效表表达时，有有可能因竞竞争利用物物质、能量量、核糖体体等干扰宿宿主细胞的的正常代谢谢活动，并并造成质粒粒不稳定。。例如，吲哚哚丙烯酸（（IAA）是trp操纵子阻遏遏物的部分分去阻遏剂剂，在培养养大肠杆菌菌MV12（pVH5）时，在培培养基中加加入不同量量的IAA，发现随IAA量的增加，，pVH5带有的分支支酸合成酶酶和色氨酸酸合成酶基基因的表达达水平有很很大提高，，同时比生生长速率下下降，培养养液中Trp－的比例上升升。电泳分分析表明60%～70%色氨酸合成成能力丧失失是由于质质粒结构的的变化，其其余是由于于质粒丢失失造成。1、改进载体受体系系统以增加质粒稳稳定性为目目的的构建建方法包括括：1）将R1质粒上的parB基因引入表表达型载体体中，其表表达产物可可以选择性性地杀死由由于分配不不均匀所产产生的无质质粒细胞2）正确设置置载体上的的多克隆位位点，禁止止DNA片段插在稳稳定区内3）将受体细细胞的致死死性基因安安装在载体体上，同时时构建条件件致死性的的相应受体体系统，如如大肠杆菌菌的ssb基因（DNA单链结合蛋蛋白编码基基因）提高基因工工程菌稳定定性的策略略2、施加选择压力根据载体上上的抗药性性标记，向向培养系统统中添加相相应的抗生生素药物和食品品生产时禁禁止使用抗抗生素；加加入大量的的抗生素会会使生产成成本增加；；添加一些些容易被水水解失活的的抗生素，，只能维持持一定时间间；添加抗抗生素选择择压力对质质粒结构不不稳定无能能为力载体上的营营养缺陷型型标记，向向培养系统统中添加相相应的营养养组份培养基复杂杂，成本较较高提高基因工工程菌稳定定性的策略略3、分阶段控制培培养因外源基因因表达造成成质粒不稳稳定时，可可以考虑将将发酵过程程分阶段控控制在生长阶段段使外源基基因处于阻阻遏状态，，避免因表表达造成不不稳定性问问题的发生生；在获得得需要的菌菌体密度后后，再去阻阻遏或诱导导外源基因因表达。连续培养时时可以考虑虑采用多级级培养，如如在第一级级进行生长长，维持菌菌体的稳定定性，在第第二级进行行表达。提高基因工工程菌稳定定性的策略略4、控制目的基因的的过量表达达使用可控型型启动子控控制目的基基因的定时时表达及表表达程度使用可控型型复制子控控制质粒的的定时增殖殖或降低质质粒的拷贝贝数5、优化基因工程菌菌的培养工工艺培养基组成成：限制培培养基比丰丰富培养基基更有利于于稳定培养温度：较低低的培养温度度有利于重重组质粒的的稳定提高基因工工程菌稳定定性的策略略6、控制培养条件有些含质粒的菌菌对发酵环环境的改变变比不含质质粒的菌反反应慢，因因而采用间间隙改变培培养条件的的方法以改改变这两种种菌的比生生长速率，，从而改善善质粒的稳稳定性。通通过间隙供供氧的方法法和通过改改变稀释速速率的方法法都可提高高质粒的稳稳定性。例如研究表达干扰素的大肠杆菌W3110(pEC901)在不同比生生长速率下下的质粒稳稳定性，随随着稀释率率的增加，，质粒稳定定性明显增增加，干扰扰素的比效效价也明显显增大.提高基因工工程菌稳定定性的策略略7、固定化培养固定化可以以提高基因因重组大肠肠杆菌的稳稳定性基因重组大大肠杆菌进进行固定化化后，质粒粒的稳定性性及目的产产物的表达达率都有了了很大提高高。在游游离重组菌菌系统中常常用抗生素素，氨基酸酸等选择性性压力稳定定质粒的手手段，往往往在大规模模生产中难难以应用。。而采用固固定化方法法后，这种种选择压力力则可被省省去。不同同的宿主菌菌及质粒在在固定化系系统中均表表现出良好好的稳定性性。提高基因工工程菌稳定定性的策略略基因工程药药物的分离离纯化目的产物在初始始物料中的的含量较低低；含目的产物物的初始物物料组成复复杂，除目目的产物外外，还有大大量的细胞胞、代谢物物、残留培培养基、无无机盐等，，特别是产产物类似物物对目的产产物的分离离纯化影响响很大；目的产物的的稳定性差差，具有生生物活性的的物质对pH、温度、金金属离子、、有机溶剂剂、剪切力力、表面张张力等十分分敏感，容容易失活、、变性；种类繁多，，包括大、、中、小分分子、结构构简单或复复杂的有机机化合物，，以及结构构和性质复复杂又各异异的生物活活性物质；；应用面广，，对其质量量、纯度要要求高，甚甚至要求无无菌、无热热原。基因工程药药物或生物物技术产品品特点一、建立分分离纯化工工艺需了解解的各种因因素1.含目的产物物的初始物物料的特点点（1）菌种类型及其代代谢特性（2）原材料和和培养基的的来源及质质量是否稳稳定（3）生产工艺艺和条件（4）初始物料的物理理、化学和和生物学特特性2.物料中杂质质的种类和和性质3.目的产物特特性4.产品质量的的要求二、分离纯纯化的基本本过程基因工程药药物的分离离纯化主要要分为5个步骤，包括细胞破破碎、固液液分离、浓浓缩与初步步纯化、高高度纯化直至得得到纯品，，以及成品品加工。分离纯化目目的产物主主要依赖于于色谱分离离技术。色谱技术分分为：离子交换色色谱亲和色谱凝胶过滤色色谱高效液相色色谱等三、重组蛋白质的分分离纯化产物的主要要特性及在在分离纯化化中的作用用基因工程药药物生产中中常用的分分离纯化方方法基因工程药药物制造实实例干扰素是真真核细胞对对各种刺激激作出反应应而自然形形成的一组组复杂的蛋蛋白质。干干扰素除具具有广谱抗抗病毒活性性，还具有有抑制细胞胞分裂，特特别是抑制制肿瘤细胞胞生长和免免疫调节等等功能，作作为一种生生物活性蛋蛋白有着良良好的临床床应用价值值。干扰素在我我国已经批批准上市的的基因工程程药物。早期获得方方法：用病病毒诱导人人白血球(白细胞)产生，产量量低，价格格贵。300L人血才提取取1mg（一）干扰扰素2003年抗非典期期间，江南南大学与丽丽珠集团苏苏州新宝制制药厂合作作攻关，通通过发酵工工程和生物物制药工程程研制成功功了重组人人α-2b干扰素口鼻鼻腔喷雾剂剂，解决了了干扰素常常温保存稳稳定性问题题。在疫区区特殊人群群捐赠使用用，效果显显著。诱生的白细细胞或者成成纤维细胞胞提取核酸酸↓通过寡dT-纤维素柱提提取mRNApBR322质粒↓↓↓5%-23%蔗糖密度梯梯度离心提提取12S-mRNA内切酶切割割↓↓由mRNA转录成cDNA切割段位于于β内酰胺基酶酶基因内↓结结果果导致内酰酰胺基酶失失活，不抗抗青霉素双链cDNA用末端Pst-I酶切割↓再用DNA转移酶接上上dT或者者dG在pBR322质粒粒DNA的切切割割段段加加上上dA或者者dC++++++++++++++++退火火获获得得杂杂交交质质粒粒↓↓转转化化大大肠肠杆杆菌菌K-12扩增增杂杂交交质质粒粒↓↓筛选选能能够够抗抗四四环环素素、、但但是是对对氨氨苄苄青青霉霉素素敏敏感感的的细细菌菌克克隆隆株株↓采用用杂杂交交翻翻译译法法挑挑选选含含有有干干扰扰素素cDNA的克克隆隆↓↓将将干干扰扰素素cDNA克隆隆进进表表达达载载体体↓↓在在大大肠肠杆杆菌菌中中进进行行高高效效表表达达↓（进进入入下下游游工工艺艺））工程程菌菌构构建建工程程菌菌的的发发酵酵生生产产人干干扰扰素素a-2b的基基因因工工程程菌菌为为SW-IFNa-2b/E.coli——DH5a。质质粒粒使使用用PL启动动子子，，含含有有氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因。。种种子子培培养养液液含含1%蛋白白胨胨、、0.5%酵母母提提取取物物、、0.5%NaCl。↓↓基基因因工工程程菌菌接接种种到到4个1000ml三角角烧烧瓶瓶之之中中，，每每个个烧烧瓶瓶内内装装有有250ml种子子培培养养基基，，30℃℃摇床床培培养养10小时时，，作作为为发发酵酵罐罐的的种种子子。。↓↓用用15L发酵酵罐罐进进行行发发酵酵，，装装发发酵酵培培养养基基10L发酵酵培培养养基基组组成成如如下下（（1%蛋白白胨胨、、0.5%酵母母提提取取物物、、0.05%NaCl、0.01%NH4Cl、0.6%Na2HPO4、0.001%CaCl2、0.3%KH2PO4、0.01%MgSO4、0.4%葡萄萄糖糖、、50mg/ml氨苄苄青青霉霉素素、、少少量量防防泡泡沫沫剂剂。。pH=6.8。））↓↓搅搅拌拌转转速速500r/min、通通气气量量为为1：1v/v*min、溶溶氧氧量量为为50%30℃℃发酵酵8小时时（（细细菌菌增增殖殖阶阶段段））42℃℃诱导导2-3小时时（（产产物物生生产产阶阶段段））↓↓[监控控手手段段：：每每隔隔不不同同时时间间，，取取2毫升升发发酵酵液液，，10000r/min离心心除除去去上上清清液液，，称称量量菌菌体体湿湿重重。。]发酵酵物物质质4000r/min离心心30min，除除去去上上清清液液。。得得湿湿菌菌，，从从其其中中取取100g。悬悬浮浮于于20mmol/L磷酸酸缓缓冲冲液液（（pH=7.0）500ml之中中，，冰冰浴浴条条件件下下进进行行超超声声破破碎碎。。↓↓4000r/min离心心30min，除除去去上上清清液液。。沉沉淀淀部部分分用用100ml抽提提液液在在室室温温条条件件下下，，进进行行搅搅拌拌抽抽提提2小时时，，抽抽提提液液组组成成配配方方[8mol/L尿素素、、20mmol/L磷酸酸缓缓冲冲液液（（pH=7.0）、、0.5mmol/LDTT]。↓↓抽抽