药物分析 第十六章 抗生素类药物的分析课件

第十六章

抗生素类药物的分析药物分析教研室1Contents概述1β-内酰胺类2氨基糖苷类3四环素类4高分子杂质检查52第一节概述在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称定义3抗生素药物的分类567抗菌药物的主要作用部位喹诺酮类林可霉素类氨基糖苷类酮康唑环丝氨酸利福平红霉素制霉菌素杆菌肽甲氧苄胺嘧啶四环素类两性霉素B万古霉素磺胺药氯霉素多粘菌素类β-内酰胺类核酸合成细胞蛋白合成细胞膜渗透性细胞壁8细菌的耐药机制产生钝化酶使抗菌药物失效药物作用靶位的结构和数量改变——抗菌药不易与细菌结合主动外排机制——药物被泵出菌体外10

鉴别：理化方法(主要方法)、微生物法官能团的显色反应，如：β-内酰胺环的羟肟酸铁反应；链霉素的麦芽酚反应、坂口反应；光谱法：红外光谱及紫外吸收光谱的鉴别。色谱法：HPLC和TLC法，采用标准品对照品对照法；生物学法：比较抑菌能力，现已少用。抗生素质量分析12

效价：每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。由单位（u）或微克（μg）表示。各种抗生素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定的。

1mg青霉素钠定为1670单位；1mg庆大霉素定为590单位。相应的盐可以通过分子量与标准盐类进行换算。抗生素活性表示方法14含量/效价测定：

微生物法：与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大

理化方法：准确度与专属性较高,且操作简便；但与临床疗效有偏差15第二节β–内酰胺类6-aminopenicillanicacid简称6-APA青霉素类7-aminocephalosporanicacid,简称7-ACA头孢菌素类氢化噻唑环氢化噻嗪环＊＊＊＊16第二节β–内酰胺类青霉素(苄青霉素)(penicillins)氨苄西林阿莫西林17第二节β–内酰胺类头孢氨苄头孢拉定头孢羟氨苄头孢噻吩钠18第二节β–内酰胺类3.UV青霉素类：苯环取代基头孢菌素类：母核有共轭结构260nm204.β–内酰胺环(四元环张力+酰胺键)第二节β–内酰胺类干燥条件较稳定，溶液不稳定某些氧化剂、金属离子、温度21第二节β–内酰胺类23第二节β–内酰胺类(三)呈色反应1）羟肟酸铁反应——β–内酰胺环β–内酰胺类NH2OH·HClNaOH羟肟酸

Fe3+H+显色（红、棕、褐）2）类似肽键（-CONH-）a.茚三酮反应——α-氨基24第二节β–内酰胺类3）其他呈色反应（偶合）青霉素钾和青霉素钠呈红棕色(四)各种盐的反应焰色反应——K+、Na+26第二节β–内酰胺类(聚合物、有关物质、异构体等)1.聚合物头孢他啶中聚合物测定—分子排阻色谱凝胶色谱分子筛机制主成分自身对照法面积归一化法限量法自身对照外标法

萄聚糖凝胶立体网状结构图27第二节β–内酰胺类2.有关物质与异构体头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查

取本品适量，精密称定，加流动相制成约含0.25mg/ml的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成2.5g/ml的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3.5倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，其中E异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积之和(1.0%)，△3-异构体峰面积不得大于1.5倍(1.5%)，其余单个杂质峰面积的和不得大于3倍(3.0%)。(供试品溶液中任何小于对照品溶液主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计)28第二节β–内酰胺类4.有机溶剂：用GC法或者HPLC法5.结晶性第一法(偏光显微镜法)第二法(X射线粉末衍射法)30碘量法汞量法酸碱滴定法羟肟酸比色法

HPLC法第二节β–内酰胺类31阿莫西林克拉维酸钾片色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.4±0.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；流速为0.7ml/min；检测波长为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5

测定法

取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。第二节β–内酰胺类32第三节氨基糖苷类碱性环己多元醇+氨基糖→苷链霉素(Streptomycin)33巴龙霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脱氧链霉胺巴龙胺D－核糖巴龙霉糖巴龙二糖胺第三节氨基糖苷类34庆大霉素(Gentamycin)351）溶解度（氨基、羟基）：水溶性2）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐；溶于水，但不溶于有机溶剂；3）旋光性（糖）：多个手性碳4）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解；临床使用时对pH值有很高的要求；5）紫外吸收光谱第三节氨基糖苷类361.茚三酮反应——羟基胺类,α-氨基酸△第三节氨基糖苷类372.Molisch试验——五碳糖或六碳糖结构红紫色羟甲基糠醛(含六碳糖结构氨基糖苷类酸性水解产物)a.α-萘酚b.萘酮蓝紫色第三节氨基糖苷类383.N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物对二甲氨基苯甲醛H+红色第三节氨基糖苷类394.麦芽酚反应——链霉糖特有反应H+第三节氨基糖苷类40紫红麦芽酚415.坂口反应——链霉胍特有反应（或α-萘酚）42坂口反应麦芽酚反应N-甲基葡萄糖胺反应第三节氨基糖苷类436.硫酸盐反应7.色谱法：TLC和HPLC法8.光谱法：IR、UV第三节氨基糖苷类441.链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查来源：发酵中产生方法：TLC中的对照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的检查(TLC)3.庆大霉素C组分的测定第三节氨基糖苷类45微生物检定法平行反应，检测同等量下供试品和对照品对微生物的抑制作用；管碟法：利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品和供试品对菌群产生的抑菌圈大小；浊度法：通过抗生素在液体培养基中对细菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品和供试品抑菌程度，测定供试品效价；--该法优点：灵敏度高、量少、直观；与临床要求一直；使用范围广；是效价测定的最基本方法；目前分子结构复杂、多组分抗生素，首选该法测效价。--该法缺陷：操作步骤多，时间长，误差大。第三节氨基糖苷类46HPLC法有紫外吸收—紫外、荧光检测器无紫外吸收—衍生化；电化学检测器或蒸发光散射法第三节氨基糖苷类47第四节四环素类ABCD123456789101112四个并苯或萘并萘481）两性：

-OH→酸性N(CH3)2→碱性

Ca2+、Mg2+生成不溶性盐；Fe3+形成红色配合物；Al3+形成黄色配合物；pH3~7.5多价阳离子与酚二酮→荧光

与酸、碱均可成盐；临床多用盐酸盐；强酸或强碱中溶解度↑

2）旋光性3）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基)第四节四环素类494）UV和荧光盐酸土霉素经酸或碱降解，呈绿色荧光，加热转为蓝色；盐酸金霉素经碱降解，呈蓝色荧光；盐酸四环素经碱降解，呈黄色荧光。可区别不同四环素类抗生素50弱酸性（pH2-6）A环C-4异构化差向四环素酸性（pH<2）C环脱水脱水四环素碱性C环开环，形成内酯异四环素5）不稳定性A.差向异构化蓝色荧光淡黄→黑第四节四环素类51AApH2.0~6.0（氢键，土霉素、多西环素不易差向异构化）第四节四环素类52B.酸性脱水降解λmax=445nmλmax=435nmDDDCBBCBC第四节四环素类53C.碱性脱水降解OH-第四节四环素类541、HPLC2、TLC(正相分配薄层色谱)薄层板中加入EDTA→克服痕量金属造成的拖尾现象3、IR4、UV：最大吸收波长和制定浓度下的吸光度；5、显色法浓硫酸三氯化铁第四节四环素类55561.有关物质——HPLC2.杂质吸光度——UV淡黄色→黑色脱水四环素橙红色差向脱水四环素

砖红色第四节四环素类57第五节高分子杂质的检查高分子杂质：药物中分子量大于药物本身的杂质的总称，1000~5000Da。与过敏反应有关。生产过程贮存过程使用不当高分子杂质内源性(药物自身聚合物)外源性(蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物)发酵过程控制重点来源581.基本结构青霉素族多肽（青霉素噻唑多肽）聚合物母核参于反应侧链参于反应头孢菌素族与母核有关的N型聚合反应侧链参与反应的L型聚合反应第五节高分子杂质的检查592.特点（1）生产工艺中产生杂质发酵中产生（2）降解（3