免疫细胞的分离与检测课件

免疫细胞的分离与检测免疫细胞的分离与检测1

第一节免疫细胞的分类与分离一、免疫细胞的种类与特征二、免疫细胞的分离技术三、细胞的冻存与复苏第一节免疫细胞的分类与分离一、免疫细胞的种类与特征2免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征理化性状生物学特性2、免疫细胞的膜分子特征CD分子免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征3

免疫细胞的起源与分化红细胞血小板肥大细胞中性粒细胞巨噬细胞树突状细胞浆细胞T细胞NK细胞免疫细胞的起源与分化红细胞血小板肥4免疫细胞的分离技术1、密度梯度离心法2、黏附分离法3、荧光激活分离法4、磁性分离法5、其他分离法免疫细胞的分离技术1、密度梯度离心法5密度梯度离心法离心前离心后稀释抗凝血淋巴细胞分离液血浆单个核细胞粒细胞红细胞密度梯度离心法离心前离心后稀释抗凝血淋巴细胞分离液血浆单个核6沉降速度=2r2（Q—Q0）9xgQ=颗粒比重Q0=溶质比重r=颗粒半径=形状因子=颗粒摩擦系数/同体积球型颗粒摩擦系数=粘稠度g=相对离心力沉降速度=2r2（Q—Q0）9xgQ=颗粒比7人类血液有形成分的平均密度与直径密度直径（）血小板1.04—1.06淋巴细胞1.06—1.088—10粒细胞1.08—1.0913红细胞1.09—1.107.5人类血液有形成分的平均密度与直径8黏附分离法尼龙毛法贴壁法亲和板法吸附柱法黏附分离法尼龙毛法9荧光激活分离法（FACS）荧光检测器滤光片透镜接物镜激光束偏转板喷嘴细胞收集管流体护套样品荧光激活分离法（FACS）荧光检测器滤光片透镜接物镜激光束偏10流式细胞仪流式细胞仪11磁性分离法磁铁吸引法磁式细胞分类术法磁性分离法磁铁吸引法12MACS(阳性选择法）NSMACS(阳性选择法）NS13MACS(阴性选择法）NSMACS(阴性选择法）NS14免疫细胞的分离与检测课件15其他分离法花环沉降法细胞活化克隆法MHC分子四聚体法其他分离法花环沉降法16抗原肽-MHC分子四聚体技术T抗原肽-MHC分子四聚体技术T17细胞的冻存与复苏细胞冻存的原理与方法细胞复苏的原理与方法细胞的冻存与复苏细胞冻存的原理与方法18细胞冻存罐细胞冻存罐19

第二节免疫细胞膜分子的检测一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型二、免疫细胞膜分子的检测方法第二节免疫细胞膜分子的检测一、免疫细胞膜分子检测的原理20免疫细胞膜分子检测的原理与类型1、以抗体识别抗原2、以配体识别受体免疫细胞膜分子检测的原理与类型1、以抗体识别抗原21免疫细胞膜分子的主要检测方法1、免疫标记检测方法荧光抗体法酶免疫检测法免疫金银染色法2、补体依赖的细胞毒试验（CDC）3、花环形成试验免疫细胞膜分子的主要检测方法1、免疫标记检测方法22SmIg的荧光抗体检测法SmIg的荧光抗体检测法23SmIg的酶免疫检测法SmIg的酶免疫检测法24补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体25E-花环T细胞B细胞花环形成细胞绵羊红细胞E-花环T细胞B细胞花环形成细胞绵羊红细胞26免疫细胞的分离与检测课件27EA-花环EA-花环28EAC-花环EAC-花环29

第三节免疫细胞功能测定一、转化、增殖试验二、细胞毒试验三、抗体形成试验四、细胞吞噬与杀伤试验第三节免疫细胞功能测定一、转化、增殖试验301、淋巴细胞转化试验2、混合淋巴细胞培养转化、增殖试验1、淋巴细胞转化试验转化、增殖试验31免疫细胞的分离与检测课件32放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋巴细胞转化试验原理示意放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋巴细胞转化试验原理331、T细胞介导的细胞毒试验2、NK活性测定3、ADCC作用测定细胞毒检测试验1、T细胞介导的细胞毒试验细胞毒检测试验34放射性测定细胞毒试验原理示意靶细胞效应细胞分离上清放射性测定细胞毒试验原理示意靶细胞效应细胞分离上清351、直接溶血空斑试验2、间接溶血空斑试验3、SPA-SRBC溶血空斑试验抗体形成试验1、直接溶血空斑试验抗体形成试验36直接溶血空斑试验直接溶血空斑试验37间接溶血空斑试验间接溶血空斑试验38SPA-SRBC溶血空斑试验SPA-SRBC溶血空斑试验391、细胞吞噬功能试验2、细胞杀菌功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验1、细胞吞噬功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验40免疫细胞的分离与检测课件41吞噬百分率=吞有颗粒的吞噬细胞数计数的吞噬细胞数吞噬指数=吞噬细胞吞噬的总颗粒数计数的吞噬细胞数吞噬百分率=吞有颗粒的吞噬细胞数计数的吞噬细胞数吞噬指数42NBT还原试验原理：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黄色）甲月簪基（紫黑色）NBT还原试验原理：N-N-N-NH2四氮唑基（淡黄色）甲月43NBT还原试验方法：1、抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、镜检。正常值：NBT阳性细胞7.5-15%NBT还原试验方法：1、抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），44

第四节免疫细胞凋亡测定一、细胞凋亡的概念与原理二、细胞凋亡的检测方法第四节免疫细胞凋亡测定一、细胞凋亡的概念与原理45

细胞凋亡的概念与原理1、细胞凋亡的概念2、细胞凋亡的原理3、细胞凋亡的特点细胞凋亡的概念与原理1、细胞凋亡的概念46

细胞凋亡（apoptosis）细胞在内源性基因调控下发生的主动死亡过程，也称程序性死亡。细胞凋亡（apoptosis）细胞在内源性47

细胞凋亡的过程凋亡信号——凋亡受体——信号传导——凋亡基因启动——编码程序性死亡蛋白——细胞结构解体——细胞凋亡细胞凋亡的过程凋亡信号——凋亡受体——信号传导——凋亡基因48

细胞凋亡机制细胞凋亡机制49

细胞凋亡的特点1、细胞皱缩2、染色质边集3、凋亡小体出现细胞凋亡的特点1、细胞皱缩50

细胞凋亡细胞凋亡51

细胞凋亡的检测方法1、形态观察法2、生化检测法3、流式细胞仪检测法细胞凋亡的检测方法1、形态观察法52形态观察法普通光镜检测——HE染色甲基绿-派诺宁染色荧光显微镜检测——溴化丙锭染色透射电镜检测——典型形态改变形态观察法普通光镜检测——HE染色53生化检测法凝胶电泳法原位末端标记法二苯胺分光光度法生化检测法凝胶电泳法54凝胶电泳法原理：断裂DNA在凝胶中呈梯形排列（DNAladder）方法：提取总DNADNA凝胶电泳观察DNAladder现象凝胶电泳法原理：断裂DNA在凝胶中呈梯形排列55原位末端标记法（TUNEL）原理：利用标记的dUTP，在TdT作用下结合DNA断片的3’末端羟基，显示断链DNA，提示凋亡方法：制备组织切片标记物结合标记物显色镜检原位末端标记法（TUNEL）原理：利用标记的dUTP，在Td56二苯胺分光光度法原理：细胞凋亡可产生低分子量DNA，通过超速离心可与细胞核的高分子量DNA分离，分别测定两种DNA，即可得出凋亡百分率。方法：裂解细胞13000g超速离心分别提取DNA使DNA显色，测定二苯胺分光光度法原理：细胞凋亡可产生低分子量DNA，通过超速57凋亡百分率=上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值凋亡百分率=上清液OD值上清液OD值+沉淀OD值58流式细胞仪法原理：PI标记凋亡细胞，通过FACS可显示凋亡细胞的特征性亚二倍体峰。并可经计算分析得出凋亡百分率。方法：制备细胞悬液PI染色FACS检测流式细胞仪法原理：PI标记凋亡细胞，通过FACS可59本章小结1、免疫细胞的类型与分离技术2、细胞的冻存与复苏3、免疫细胞膜分子的检测原理与方法4、免疫细胞功能测定的原理与方法本章小结1、免疫细胞的类型与分离技术60免疫细胞的分离与检测免疫细胞的分离与检测61

第一节免疫细胞的分类与分离一、免疫细胞的种类与特征二、免疫细胞的分离技术三、细胞的冻存与复苏第一节免疫细胞的分类与分离一、免疫细胞的种类与特征62免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征理化性状生物学特性2、免疫细胞的膜分子特征CD分子免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征63

免疫细胞的起源与分化红细胞血小板肥大细胞中性粒细胞巨噬细胞树突状细胞浆细胞T细胞NK细胞免疫细胞的起源与分化红细胞血小板肥64免疫细胞的分离技术1、密度梯度离心法2、黏附分离法3、荧光激活分离法4、磁性分离法5、其他分离法免疫细胞的分离技术1、密度梯度离心法65密度梯度离心法离心前离心后稀释抗凝血淋巴细胞分离液血浆单个核细胞粒细胞红细胞密度梯度离心法离心前离心后稀释抗凝血淋巴细胞分离液血浆单个核66沉降速度=2r2（Q—Q0）9xgQ=颗粒比重Q0=溶质比重r=颗粒半径=形状因子=颗粒摩擦系数/同体积球型颗粒摩擦系数=粘稠度g=相对离心力沉降速度=2r2（Q—Q0）9xgQ=颗粒比67人类血液有形成分的平均密度与直径密度直径（）血小板1.04—1.06淋巴细胞1.06—1.088—10粒细胞1.08—1.0913红细胞1.09—1.107.5人类血液有形成分的平均密度与直径68黏附分离法尼龙毛法贴壁法亲和板法吸附柱法黏附分离法尼龙毛法69荧光激活分离法（FACS）荧光检测器滤光片透镜接物镜激光束偏转板喷嘴细胞收集管流体护套样品荧光激活分离法（FACS）荧光检测器滤光片透镜接物镜激光束偏70流式细胞仪流式细胞仪71磁性分离法磁铁吸引法磁式细胞分类术法磁性分离法磁铁吸引法72MACS(阳性选择法）NSMACS(阳性选择法）NS73MACS(阴性选择法）NSMACS(阴性选择法）NS74免疫细胞的分离与检测课件75其他分离法花环沉降法细胞活化克隆法MHC分子四聚体法其他分离法花环沉降法76抗原肽-MHC分子四聚体技术T抗原肽-MHC分子四聚体技术T77细胞的冻存与复苏细胞冻存的原理与方法细胞复苏的原理与方法细胞的冻存与复苏细胞冻存的原理与方法78细胞冻存罐细胞冻存罐79

第二节免疫细胞膜分子的检测一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型二、免疫细胞膜分子的检测方法第二节免疫细胞膜分子的检测一、免疫细胞膜分子检测的原理80免疫细胞膜分子检测的原理与类型1、以抗体识别抗原2、以配体识别受体免疫细胞膜分子检测的原理与类型1、以抗体识别抗原81免疫细胞膜分子的主要检测方法1、免疫标记检测方法荧光抗体法酶免疫检测法免疫金银染色法2、补体依赖的细胞毒试验（CDC）3、花环形成试验免疫细胞膜分子的主要检测方法1、免疫标记检测方法82SmIg的荧光抗体检测法SmIg的荧光抗体检测法83SmIg的酶免疫检测法SmIg的酶免疫检测法84补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体85E-花环T细胞B细胞花环形成细胞绵羊红细胞E-花环T细胞B细胞花环形成细胞绵羊红细胞86免疫细胞的分离与检测课件87EA-花环EA-花环88EAC-花环EAC-花环89

第三节免疫细胞功能测定一、转化、增殖试验二、细胞毒试验三、抗体形成试验四、细胞吞噬与杀伤试验第三节免疫细胞功能测定一、转化、增殖试验901、淋巴细胞转化试验2、混合淋巴细胞培养转化、增殖试验1、淋巴细胞转化试验转化、增殖试验91免疫细胞的分离与检测课件92放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋巴细胞转化试验原理示意放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋巴细胞转化试验原理931、T细胞介导的细胞毒试验2、NK活性测定3、ADCC作用测定细胞毒检测试验1、T细胞介导的细胞毒试验细胞毒检测试验94放射性测定细胞毒试验原理示意靶细胞效应细胞分离上清放射性测定细胞毒试验原理示意靶细胞效应细胞分离上清951、直接溶血空斑试验2、间接溶血空斑试验3、SPA-SRBC溶血空斑试验抗体形成试验1、直接溶血空斑试验抗体形成试验96直接溶血空斑试验直接溶血空斑试验97间接溶血空斑试验间接溶血空斑试验98SPA-SRBC溶血空斑试验SPA-SRBC溶血空斑试验991、细胞吞噬功能试验2、细胞杀菌功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验1、细胞吞噬功能试验细胞吞噬与杀伤功能试验100免疫细胞的分离与检测课件101吞噬百分率=吞有颗粒的吞噬细胞数计数的吞噬细胞数吞噬指数=吞噬细胞吞噬的总颗粒数计数的吞噬细胞数吞噬百分率=吞有颗粒的吞噬细胞数计数的吞噬细胞数吞噬指数102NBT还原试验原理：N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黄色）甲月簪基（紫黑色）NBT还原试验原理：N-N-N-NH2四氮唑基（淡黄色）甲月103NBT还原试验方法：1、抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），37。C孵育25min。2、推片染色、镜检。正常值：NBT阳性细胞7.5-15%NBT还原试验方法：1、抗凝血+硝基蓝四氮唑（NBT），104

第四节免疫细胞凋亡测定一、细胞凋亡的概念与原理二、细胞凋亡的检测方法第四节免疫细胞凋亡测定一、细胞凋亡的概念与原理105

细胞凋亡的概念与原理1、细胞凋亡的概念2、细胞凋亡的原理3、细胞凋亡的特点细胞凋亡的概念与原理1、细胞凋亡的概念106

细胞凋亡（apoptosis）细胞在内源性基因调控下发生的主动死亡过程，也称程序性死亡。细胞凋亡（apoptosis）细胞在内源性107

细胞凋亡的过程凋亡信号——凋亡受体——信号传导——凋亡基因启动——编码程序性死亡蛋白——细胞结构解体——细胞凋亡细胞凋亡的过程凋亡信号——凋亡受体——信号传导——凋亡基因108

细胞凋亡机制细胞凋亡机制109

细胞凋亡的特点1、细胞皱缩2、染色质边集3、凋亡小体出现细胞凋亡的特点1、细胞皱缩110

细胞凋亡细胞凋亡111

细胞凋亡的检测方法1、形态观察法2、生化检测法3、流式细胞仪检测法细胞凋亡的检测方法1、形态观察法112形态观察法普通光镜检测——HE染色甲基绿-派诺宁染色荧光显微镜检测——溴化丙锭染色透射电镜检测——典型形态改变形态观察法普通光镜检测——HE染色113生化检测法凝胶电泳法原位末端标记法二苯胺分光光度法生化检测法凝胶电泳法114凝胶电泳