免疫学常用实验方法课件

Ag-Abreation:

ELISA,Immunohistochemistry,FACS,Westernblot,Hybridoma&monoclonalantibodyCellfunction:

proliferation3H－TdRMTTCFSECytotoxicity51CrAnimalexperimentAg-Abreation:proliferation3H1非共价键结合I.Antigen-AntibodyReaction抗体的互补决定区(CDRs)抗原决定簇(antigenicdeterminant)又称表位(epitope)非共价键结合非共价键结合I.Antigen-AntibodyReac2CDR1CDR2CDR3CDR1CDR2CDR3CDR:ComplementarityDeterminingRegionFR:FrameworkRegionFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4HLComplementarity-determiningregions(CDRs):

CDR1CDR2CDR3CDR1CDR2CDR3CDR:C3AntigenicDeterminantAntigenicDeterminant4Specificity特异性

FeaturesofAg-AbReactionSpecificity特异性FeaturesofAg5Reversibility可逆性

Ag+Ab→Ag·Ab

解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。在一定条件下(如低pH、高浓度盐等)可以解离。Reversibility可逆性解离后的抗原或抗体均能6Ratio最适比例Ratio最适比例7Sensitivity敏感性化学比色法：mg/ml酶反应测定法：5-10μg/ml(免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿)标记的免疫测定法：ng/ml水平(例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml)

Sensitivity敏感性化学比色法：mg/ml8ELISA------酶联免疫吸附试验Immunohistochemistry--------免疫组织化学FACS------流式细胞术WesternBlotting-------免疫印迹技术OftenusedmethodsELISA------酶联免疫吸附试验Immunohisto91.ELISA(酶联免疫吸附试验EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)RIA(radioimmunoassay,Berson&Yalow，1960)IRMA(immunoradiovelricassay,Miles&Hiles,1968)E(L)I(S)A(Engvall&Perlmann,vanWeemenandSchuurs,1971)1.ELISA(酶联免疫吸附试验EnzymeLink10Copyright©2019AmericanAssociationforClinicalChemistryLequin,R.M.ClinChem2019;51:2415-2418Estimatesofthenumberofarticlespublishedper5-yearperiodfrom1960to2019Figure.Estimatesofthenumberofarticlespublishedper5-yearperiodfrom1960to2019.ThesearchwasdoneinFebruary2019inPubMed/NationalLibraryofMedicine,NIH,withthesearchterms:enzyme-immunoassay,enzyme-linkedimmunosorbentassay(EIA/ELISAcombined),andRIA.(Ordinate),numberofarticlesinwhichthekeywordsarequoted.(Abscissa),5-yearperiodsfrom1960to2019.

,combinedEIA/ELISA;

,RIA.[Note:Idonotpretendthatthenumbersinthisfigureareprecise;thetrends,however,areevident.]

Copyright©2019AmericanAssoc11基础:抗原或抗体的固相化抗原或抗体的酶标记用途：目标蛋白的定性或定量分析

三个必要试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）;（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。

ELISA基础:抗原或抗体的固相化用途：目标蛋白的定性或定量分析三个12a.包被b.抗原抗体反应c.酶促反应,显色d.终止显色，读取数据。ELISA基本的实验过程对照和标准曲线阳性对照阴性对照定量测定：标准品制作标准曲线待测样品的合理稀释a.包被ELISA基本的实验过程对照和标准曲线阳性对照13不同类型的检测方法不同类型的检测方法14免疫学常用实验方法课件152.Immunohistochemistry(免疫组化)原理：抗原抗体反应，抗体标记技术（荧光、酶）用途：组织或细胞内抗原的定性和定位流程：2.Immunohistochemistry(免疫组化)16Copyright©2019AmericanAssociationforCancerResearchZhao,X.etal.CancerRes2019;67:4443-4450Figure3.mTNFinducesinfiltrationofinnateimmunecellsandangiostasisintumorsfromTNFR1–/–butnotTNFR1–/–/R2–/–mice.AtoF,TNFR1–/–miceorTNFR1–/–/R2–/–micewereinjecteds.c.with5x106ofJ-mTNF10cells.Tendaysaftertumorcellchallenge,tissuesectionsoftheinjectionsitewerestainedforMac-1+(AandB),Gr-1+(CandD),andCD31+(EandF)cellsasindicated.GandH,forconfocalmicroscopyanalysis,tissuesectionswerestainedwithCy3-labeledanti-CD31forbloodvesselendothelialcells(green)andtheVasoTACSinsitukittodetectapoptosis(red).Arrows,apoptoticendothelialcellsinthetumor.Copyright©2019AmericanAssoc17成败的关键因素：组织的固定、包埋抗体（特异性、浓度、孵育温度和时间）非特异性抗原的封闭内源性酶或自发荧光的消减显色思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片？成败的关键因素：思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于183.FlowCytometricanalysis(流式细胞术)FACS:(Fluorescence-ActivatedCellSorter)BDFACSVantageBD-Calibur3.FlowCytometricanalysis(流19测量对象

大小悬浮在溶液中的相互离散颗粒大小范围：0.2μm-300μm

高等真核细胞类型酵母细胞类型细菌 多细胞的聚集体，如胰岛等。细胞核非生命颗粒染色体其它细胞器以及乳化微球等。

测量对象大小悬浮在溶液中的相互离散颗粒20细胞表型分析胞内细胞因子的检测细胞周期和DNA倍体分析细胞分选主要用途细胞表型分析主要用途21（1）多参数定量分析每一个细胞；

（2）细胞分选；高纯度：99%以上；可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、单细胞克隆等。

(3）高通量（分析分选）．分析150，000个/秒分选100，000个/秒

特点（1）多参数定量分析每一个细胞；特点22

基本结构基本结构23工作原理工作原理24二色镜

123带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光a.光信号收集分离，导向，各探测通道接收并转化为电信号。二色镜带通滤波片激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光25FSCSSCFL1FL2FL3对数

线性线性

线性

对数脉冲处理，模数转换光信号电信号记录数据，显示结果b.数据处理FSCSSCFL1FL26c.细胞分选488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetectorc.细胞分选488nmlaser+-ChargedP27外周全血细胞散射光双参数点图

（红细胞溶解后）颗粒度细胞大小流式细胞仪数据分析非荧光信号外周全血细胞散射光双参数点图

（红细胞溶解后）颗粒度细胞大小28直方图分析荧光信号直方图分析荧光信号29点状图分析点状图分析30设门分析

可以通过设“门”(Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。设门分析可以通过设“门”(Gate)，分析、分选31

实验对照的设计

阴性对照：常用同型抗体对照阳性对照：单阳性对照（多色分析时用于仪器校正）

抗体的选择

首选直标抗体荧光分子

实验标本的处理

单细胞悬液的制备抗体浓度非特异结合的去除：洗涤和封闭

实验对照的设计阴性对照：常用同型抗体对照抗体的选择324.WesternBlott4.WesternBlott335.HybridomaTechnique&MonoclonalAntibodyPreparationJerme，KöhlerandMilstein1984NobelPrizeBcellMyelomaSecreteAbClonalAclonalcelllinesecretingspecificAb?5.HybridomaTechnique&Monoc34BcellMyelomaFusionBcellBcell+BcellBcell+MyelomaMyelomaMyeloma+MyelomaaliveBcellMyelomaFusionBcellBcel35Bcell+MyelomaMyelomaMyeloma+MyelomaDNAA(氨基喋呤)HGPRT+，TK+

H,次黄嘌呤

T,胸腺嘧啶HGPRT-，TK-DieHGPRT-，TK-

H,次黄嘌呤

T,胸腺嘧啶AclonalcelllinesecretingspecificAb---HybridomaHGPRT次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)TK胸腺嘧啶激酶(Thymidinekinase)Bcell+MyelomaMyelomaMyeloma+M36免疫学常用实验方法课件37PreparingmAbsfrommurineascitesPristane(i.p.)Hybridoma(i.p.)ascitesMonoclonalantibodyELISAPreparingmAbsfrommurineasc38II.AssayforcellfunctionProliferation:Tcell,tumorcell,…Cytotoxicassay:Tcell,NKcell,…II.AssayforcellfunctionPro39CellProliferationStimulatorsNonspecific:Mitogen:LPS,ConA,PHASuperantigen(超抗原):SEBCytokine:IL2,IL4,TNFAntibody:CD3,TCR,CD28Specific:specificantigen:破伤风类毒素，PPD(纯结核蛋白衍生物)MHC:同种异体细胞(MLR,混合淋巴细胞培养)CellProliferationStimulators40AssayforTcellproliferation3H-TdRwashStimulateAssaya.3H-TdRAssayforTcellproliferatio41b.MTTAssayMechanism:

操作简单，重复性差b.MTTAssayMechanism:

42c.CFSEFigure15.67FollowingcellproliferationinhumanperipheralbloodlymphocytesusingtheCellTraceCFSECellProliferationKitC34554).HumanperipheralbloodlymphocyteswereharvestedandstainedwithCellTraceCFSE(carboxyfluoresceindiacetate,succinimidylester;5(6)-CFDA,SE)onDay0.AportionofthepopulationwasarrestedattheparentgenerationusingmitomycinC(redpeak).Theremainderofthesamplewasstimulatedwithphytohemagglutininandallowedtoproliferatefor5days.Sbes.invitrogen/handbook/figures/2018.html

CELLproliferationc.CFSEFigure15.67Following43AssayforTcellcytotoxicityTargetcell51CrlabeledTargetcellCTLTargetcellCr51releaseAssayCTL51CrreleaseAssayforTcellcytotoxicity44Isolationofstemcells密度梯度离心法单抗贴壁铺展法免疫磁珠分选流式细胞分选法III.TechnologyinvolvedinstemcellresearchIsolationofstemcells密度梯度离心法45IndentificationofstemcellsFACS：造血干细胞可鉴定如下marker—CD34，CD33，Sca-1，c-Kit显微镜技术：生长形态，核型人类骨髓干细胞体内分化：胚胎干细胞在裸鼠体内生长分化，形成包含三个胚层来源的良性畸胎瘤基因芯片：分析基因表达差异IndentificationofstemcellsF46Cultureofisolatedstemcells以鼠胚胎干细胞培养为例：1，饲养细胞的培养2，饲养层的制备—MEF分离3，小鼠胚胎干细胞分离培养1）内细胞团的分离与培养2）ES样细胞扩增3）单细胞克隆建系4）鉴定—丝裂霉素C处理或Gγ射线照射Cultureofisolatedstemcell47DifferentiationofStemCells悬浮培养法—不同的培养基及细胞因子共培养—与不同的支持细胞共培养DifferentiationofStemCells悬48III.AnimalexperimentImmunedeficientmice裸小鼠(nudemice)，无毛，先天性胸腺发育不良，T细胞功能缺失。III.AnimalexperimentImmune49SCID：Severecombinedimmunedeficiency严重联合免疫缺陷小鼠T、B淋巴细胞功能均缺失Avarietyofknock-outmice:

μMT,RAG1-/-,RAG2-/- IFNγ-/-,IL4R-/-…SCID：Severecombinedimmunede50Transgenicmice:GFP-transgenicmiceTransgenicmice:GFP-transgeni51GenerationoftransgenicmiceGenerationoftransgenicmice52AnimalexperimentsAnimalexperiments53免疫学常用实验方法课件54免疫学常用实验方法课件55IsolatelymphocytesfromspleenorlymphnodesIsolatetumorcellsfromtumortissue.Isolatelymphocytesfromsplee56Adoptivetransfer:T,B,sera…

BoneMarrowChimeraAdvancedanimalexperimentSkingraftAdoptivetransfer:T,B,sera…57ThankYou!ThankYou!58TopicsImmune-mediatedangiostasisintumordevelopment.MDSC(myeloid-derivedsuppressorcells)intumordevelopment.Th17cellsintumordevelopment.Tregcellsintumordevelopment.Fibroblastintumordevelopment.TheroleofTNFanditsreceptorsintumorimmunity.TheroleofInterferon-γanditsreceptorintumorimmunity.TheroleofInterleukin4anditsreceptorintumorimmunity.Cytokinesandinflammationresolution.Theroleofliverfibrosisindevelopmentofhepatocellularcarcinoma.TopicsImmune-mediatedangiosta59要求：每组从topic列表中任选一篇相关文章（JournalofImmunology,Nature,NatureImmunology,TheJournalofClinicalInvestigation,CancerResearch,Science,TheJournalofExperimentalMedicine,NatureMedicine;Blood,PNAS,Immunity,CancerCell.)

Introduction部分要着重阐述，Results部分要说清实验设计思路及过程结果，Discussion部分要指出创新点。要求：60选6名speakers,

2名chairmen20分讲，10分讨论选6名speakers,2名chairmen61谢谢！谢谢！62免疫学常用实验方法课件63Ag-Abreation:

ELISA,Immunohistochemistry,FACS,Westernblot,Hybridoma&monoclonalantibodyCellfunction:

proliferation3H－TdRMTTCFSECytotoxicity51CrAnimalexperimentAg-Abreation:proliferation3H64非共价键结合I.Antigen-AntibodyReaction抗体的互补决定区(CDRs)抗原决定簇(antigenicdeterminant)又称表位(epitope)非共价键结合非共价键结合I.Antigen-AntibodyReac65CDR1CDR2CDR3CDR1CDR2CDR3CDR:ComplementarityDeterminingRegionFR:FrameworkRegionFR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4HLComplementarity-determiningregions(CDRs):

CDR1CDR2CDR3CDR1CDR2CDR3CDR:C66AntigenicDeterminantAntigenicDeterminant67Specificity特异性

FeaturesofAg-AbReactionSpecificity特异性FeaturesofAg68Reversibility可逆性

Ag+Ab→Ag·Ab

解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。在一定条件下(如低pH、高浓度盐等)可以解离。Reversibility可逆性解离后的抗原或抗体均能69Ratio最适比例Ratio最适比例70Sensitivity敏感性化学比色法：mg/ml酶反应测定法：5-10μg/ml(免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿)标记的免疫测定法：ng/ml水平(例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml)

Sensitivity敏感性化学比色法：mg/ml71ELISA------酶联免疫吸附试验Immunohistochemistry--------免疫组织化学FACS------流式细胞术WesternBlotting-------免疫印迹技术OftenusedmethodsELISA------酶联免疫吸附试验Immunohisto721.ELISA(酶联免疫吸附试验EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)RIA(radioimmunoassay,Berson&Yalow，1960)IRMA(immunoradiovelricassay,Miles&Hiles,1968)E(L)I(S)A(Engvall&Perlmann,vanWeemenandSchuurs,1971)1.ELISA(酶联免疫吸附试验EnzymeLink73Copyright©2019AmericanAssociationforClinicalChemistryLequin,R.M.ClinChem2019;51:2415-2418Estimatesofthenumberofarticlespublishedper5-yearperiodfrom1960to2019Figure.Estimatesofthenumberofarticlespublishedper5-yearperiodfrom1960to2019.ThesearchwasdoneinFebruary2019inPubMed/NationalLibraryofMedicine,NIH,withthesearchterms:enzyme-immunoassay,enzyme-linkedimmunosorbentassay(EIA/ELISAcombined),andRIA.(Ordinate),numberofarticlesinwhichthekeywordsarequoted.(Abscissa),5-yearperiodsfrom1960to2019.

,combinedEIA/ELISA;

,RIA.[Note:Idonotpretendthatthenumbersinthisfigureareprecise;thetrends,however,areevident.]

Copyright©2019AmericanAssoc74基础:抗原或抗体的固相化抗原或抗体的酶标记用途：目标蛋白的定性或定量分析

三个必要试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）;（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。

ELISA基础:抗原或抗体的固相化用途：目标蛋白的定性或定量分析三个75a.包被b.抗原抗体反应c.酶促反应,显色d.终止显色，读取数据。ELISA基本的实验过程对照和标准曲线阳性对照阴性对照定量测定：标准品制作标准曲线待测样品的合理稀释a.包被ELISA基本的实验过程对照和标准曲线阳性对照76不同类型的检测方法不同类型的检测方法77免疫学常用实验方法课件782.Immunohistochemistry(免疫组化)原理：抗原抗体反应，抗体标记技术（荧光、酶）用途：组织或细胞内抗原的定性和定位流程：2.Immunohistochemistry(免疫组化)79Copyright©2019AmericanAssociationforCancerResearchZhao,X.etal.CancerRes2019;67:4443-4450Figure3.mTNFinducesinfiltrationofinnateimmunecellsandangiostasisintumorsfromTNFR1–/–butnotTNFR1–/–/R2–/–mice.AtoF,TNFR1–/–miceorTNFR1–/–/R2–/–micewereinjecteds.c.with5x106ofJ-mTNF10cells.Tendaysaftertumorcellchallenge,tissuesectionsoftheinjectionsitewerestainedforMac-1+(AandB),Gr-1+(CandD),andCD31+(EandF)cellsasindicated.GandH,forconfocalmicroscopyanalysis,tissuesectionswerestainedwithCy3-labeledanti-CD31forbloodvesselendothelialcells(green)andtheVasoTACSinsitukittodetectapoptosis(red).Arrows,apoptoticendothelialcellsinthetumor.Copyright©2019AmericanAssoc80成败的关键因素：组织的固定、包埋抗体（特异性、浓度、孵育温度和时间）非特异性抗原的封闭内源性酶或自发荧光的消减显色思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片？成败的关键因素：思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于813.FlowCytometricanalysis(流式细胞术)FACS:(Fluorescence-ActivatedCellSorter)BDFACSVantageBD-Calibur3.FlowCytometricanalysis(流82测量对象

大小悬浮在溶液中的相互离散颗粒大小范围：0.2μm-300μm

高等真核细胞类型酵母细胞类型细菌 多细胞的聚集体，如胰岛等。细胞核非生命颗粒染色体其它细胞器以及乳化微球等。

测量对象大小悬浮在溶液中的相互离散颗粒83细胞表型分析胞内细胞因子的检测细胞周期和DNA倍体分析细胞分选主要用途细胞表型分析主要用途84（1）多参数定量分析每一个细胞；

（2）细胞分选；高纯度：99%以上；可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、单细胞克隆等。

(3）高通量（分析分选）．分析150，000个/秒分选100，000个/秒

特点（1）多参数定量分析每一个细胞；特点85

基本结构基本结构86工作原理工作原理87二色镜

123带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光a.光信号收集分离，导向，各探测通道接收并转化为电信号。二色镜带通滤波片激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光88FSCSSCFL1FL2FL3对数

线性线性

线性

对数脉冲处理，模数转换光信号电信号记录数据，显示结果b.数据处理FSCSSCFL1FL89c.细胞分选488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetectorc.细胞分选488nmlaser+-ChargedP90外周全血细胞散射光双参数点图

（红细胞溶解后）颗粒度细胞大小流式细胞仪数据分析非荧光信号外周全血细胞散射光双参数点图

（红细胞溶解后）颗粒度细胞大小91直方图分析荧光信号直方图分析荧光信号92点状图分析点状图分析93设门分析

可以通过设“门”(Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。设门分析可以通过设“门”(Gate)，分析、分选94

实验对照的设计

阴性对照：常用同型抗体对照阳性对照：单阳性对照（多色分析时用于仪器校正）

抗体的选择

首选直标抗体荧光分子

实验标本的处理

单细胞悬液的制备抗体浓度非特异结合的去除：洗涤和封闭

实验对照的设计阴性对照：常用同型抗体对照抗体的选择954.WesternBlott4.WesternBlott965.HybridomaTechnique&MonoclonalAntibodyPreparationJerme，KöhlerandMilstein1984NobelPrizeBcellMyelomaSecreteAbClonalAclonalcelllinesecretingspecificAb?5.HybridomaTechnique&Monoc97BcellMyelomaFusionBcellBcell+BcellBcell+MyelomaMyelomaMyeloma+MyelomaaliveBcellMyelomaFusionBcellBcel98Bcell+MyelomaMyelomaMyeloma+MyelomaDNAA(氨基喋呤)HGPRT+，TK+

H,次黄嘌呤

T,胸腺嘧啶HGPRT-，TK-DieHGPRT-，TK-

H,次黄嘌呤

T,胸腺嘧啶AclonalcelllinesecretingspecificAb---HybridomaHGPRT次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)TK胸腺嘧啶激酶(Thymidinekinase)Bcell+MyelomaMyelomaMyeloma+M99免疫学常用实验方法课件100PreparingmAbsfrommurineascitesPristane(i.p.)Hybridoma(i.p.)ascitesMonoclonalantibodyELISAPreparingmAbsfrommurineasc101II.AssayforcellfunctionProliferation:Tcell,tumorcell,…Cytotoxicassay:Tcell,NKcell,…II.AssayforcellfunctionPro102CellProliferationStimulatorsNonspecific:Mitogen:LPS,ConA,PHASuperantigen(超抗原):SEBCytokine:IL2,IL4,TNFAntibody:CD3,TCR,CD28Specific:specificantigen:破伤风类毒素，PPD(纯结核蛋白衍生物)MHC:同种异体细胞(MLR,混合淋巴细胞培养)CellProliferationStimulators103AssayforTcellproliferation3H-TdRwashStimulateAssaya.3H-TdRAssayforTcellproliferatio104b.MTTAssayMechanism:

操作简单，重复性差b.MTTAssayMechanism:

105c.CFSEFigure15.67FollowingcellproliferationinhumanperipheralbloodlymphocytesusingtheCellTraceCFSECellProliferationKitC34554).HumanperipheralbloodlymphocyteswereharvestedandstainedwithCellTraceCFSE(carboxyfluoresceindiacetate,succinimidylester;5(6)-CFDA,SE)onDay0.AportionofthepopulationwasarrestedattheparentgenerationusingmitomycinC(redpeak).Theremainderofthesamplewasstimulatedwithphytohemagglutininandallowedtoproliferatefor5days.Sbes.invitrogen/handbook/figures/2018.html

CELLproliferationc.CFSEFigure15.67Following106AssayforTcellcytotoxicityTargetcell51CrlabeledTargetcellCTLTargetcellCr51releaseAssayCTL51CrreleaseAssayforTcellcytotoxicity107Isolationofstemcells密度梯度离心法单抗贴壁铺展法免疫磁珠分选流式细胞分选法III.TechnologyinvolvedinstemcellresearchIsolationofstemcells密度梯度离心法108IndentificationofstemcellsFACS：造血干细胞可鉴定如下marker—CD34，CD33，Sca-1，c-Kit显微镜技术：生长形态，核型人类骨髓干细胞体内分化：胚胎干细胞在裸鼠体内生长分化，形成包含三个胚层来源的良性畸胎瘤基因芯片：分析基因表达差异IndentificationofstemcellsF109Cultureofisolatedstemcells以鼠胚胎干细胞培养为例：1，饲养细胞的培养2，饲养层的制备—MEF