第九讲基因操作的工具酶优质课件

第九讲基因操作的工具酶第九讲基因操作的工具酶1优选第九讲基因操作的工具酶优选第九讲基因操作的工具酶2一.基因工程工具酶的概念

在DNA分子水平的操作中，依赖于一些重要的酶，如限制性核酸内切酶、连接酶等，作为工具对DNA进行切割和拼接，这些酶统称为基因工程工具酶

3一.基因工程工具酶的概念 在DNA分子水平的操作中，依赖于基因工程必需的两个工具酶“分子剪刀”

⒈限制性核酸内切酶

——在DNA上核苷酸的特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI,HpaI“分子胶”⒉DNA连接酶——促使具有互补粘性末端或平头末端的载体和供体DNA片段连接，形成重组DNA分子一、工具酶概念4基因工程必需的两个工具酶“分子⒈限制性核酸内切酶——限制性内切酶与DNA连接酶细菌细胞内特异性降解外源核酸分子的核酸酶，其作用特点是特异性降解异源DNA分子(甲基化修饰差异)I类限制酶随机切割双链DNA分子，II类限制酶识别、切割特殊的回文(对称)序列来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接形成重组DNA分子通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶一、工具酶概念5限制性内切酶与DNA连接酶细菌细胞内特异性降解外源核酸分子的核酸核酸水解酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸内切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸转移酶磷酸酶一、工具酶概念6核酸核酸水解酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸内切酶DNA常用的工具酶工具酶类功能限制性核酸内切酶特异性识别和切割DNAT4DNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端脱氧核苷酰转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基TaqDNA聚合酶DNA合成、PCR一、工具酶概念7常用的工具酶工具酶类功能限制性核酸内切酶特异性识别和切割DN二.限制性核酸内切酶

定义发现限制—修饰系统分类命名特性影响内切酶酶切反应的条件8二.限制性核酸内切酶定义8主要用途转录mRNA成为cDNA制备基因片段CGTTACGAATCGGTA第二章基因操作的工具酶用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点第二、三字母小写，来源细菌种名的头2个字母DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍5`---AGATCT---3`具5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性T4DNA连接酶应用更广泛一些通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶5’3’聚合酶活性（+）限制性核酸内切酶EcoRI及为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？3`---CCTAGG---5`RNA酶A(牛胰)在cDNA合成中，第二链的合成功能催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5’端磷酸基团,从DNA片段上除去5’磷酸以防自身连接多样性:限制酶有200多种5’5’GCAATGCTTAGCCATCGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸内切酶核酸外切酶二.限制性内切酶9主要用途转录mRNA成为cDNA制备基因片段5’5’G5’5’GCAAGCTTTAGCCATCGTTCGAAATCGGTA限制性核酸内切酶二.限制性内切酶105’5’GCAAGCTTT 限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease）是指能识别双链DNA分子内部特异位点并在识别位点或附近水解磷酸二酯键的一类内切核酸酶，简称为限制酶（restrictionenzyme）1.定义一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断目前已发现的限制酶有200多种二.限制性内切酶11 限制性内切核酸酶（restrictionendonuc限制性核酸内切酶的作用 简单的说:能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）二.限制性内切酶12限制性核酸内切酶的作用 简单的说:能在特异位点（酶切位点）上2.发现 大肠杆菌中发现，如能切割降解噬菌体DNA而限制外源DNA 因切点在外源DNA内部，故叫内切酶二.限制性内切酶如果在细菌中没有发现ER，现代分子生物学和重组DNA就不可能发展起来132.发现 大肠杆菌中发现，如能切割降解噬菌体DNA而限制外 20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象” 1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，这类酶称为限制性核酸内切酶限制酶概念提出的背景二.限制性内切酶14 20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感①分布②作用特点③结果主要在微生物中专一性:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子多样性:限制酶有200多种产生黏性末端或平末端分子剪刀——限制性内切酶二.限制性内切酶R15①分布主要在微生物中专一性:一种限制酶只能识别一种特定的②盐离子浓度Na＋，Mg2＋来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接形成重组DNA分子结果： 黏性末端（包括平末端）连接起来能在DNA上相同的位置切割——用于基因分析及表达的众多技术的基础功能催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5’端磷酸基团,从DNA片段上除去5’磷酸以防自身连接多样性:限制酶有200多种酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘油浓度过高，影响酶切反应EcoRⅠGAATTC①小片段 5’ 3’DNA外切酶活性产生相同序列突出末端的三种方式专一性:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子3’5’外切酶活性（-）GCAAGCTTTAGCCAT5′---CTGCAG---3′5′---CTGCApOHG--3′但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，所以连接反应一般采用16℃过夜5’到3‘DNA聚合酶活性②5’ 3’DNA外切酶活性主要用途转录mRNA成为cDNA制备基因片段②大片段 5’ 3’DNA聚合酶活性最常用的限制性核酸内切酶二.限制性内切酶16②盐离子浓度Na＋，Mg2＋最常用的限制性核酸内切酶二.3.限制－修饰系统为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？

因为几乎所有的限制性内切核酸酶都要和能识别而且甲基化相同DNA位点的甲基化酶共同作用 这两个酶：限制性内切核酸酶和甲基化酶一起称为限制－修饰系统。宿主细胞中甲基化的DNA位点被保护起来，不会被限制性核酸内切酶消化二.限制性内切酶173.限制－修饰系统为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？限制性核酸内切酶EcoRI及修饰的甲基化酶MEcoRI的限制与修饰作用二.限制性内切酶18限制性核酸内切酶EcoRI及二.限制性内切酶18

4.分类

根据结构和功能的特异性，即其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，可将已发现的内切核酸酶分为三类：即I型、II型、III型酶 I型和III型酶在同一蛋白酶分子中兼有甲基化酶及限制性内切核酸酶活性，又因其识别位点与切割位点不固定，所以价值不大 II型酶切割DNA片断活性和甲基化作用是分开的，且核酸内切作用又具有序列特异性，在基因克隆中广泛使用 通常所用的限制性内切核酸酶是指II型的

二.限制性内切酶194.分类 根据结构和功能的特异性，即其识别和切割序列的特性二.限制性内切酶R二.限制性内切酶R205.命名

采用Smith和Athens提议的方案，根据限制性内切核酸酶来源和菌株进行命名用来源细菌的英文缩写斜体符号命名它的第一个字母大写，来源细菌属名的第1个字母第二、三字母小写，来源细菌种名的头2个字母第四个字母代表菌株最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号二.限制性内切酶R215.命名 采用Smith和Athens提议的方案，根据限制性 前3个字母来自产生菌－流感噬血菌的拉丁名“H”来自属名Haemopbilus的第一个字母“in”来自种名influenzae的前两个字母“d”来自菌株名Rd的d“III”说明是在该菌株中发现的第三种限制性核酸内切酶HindIII为例二.限制性内切酶HindⅢ代表从流感噬血杆菌（Haemophilusinfluenzac）d株中分离到的第3个限制酶22 前3个字母来自产生菌－流感噬血菌的拉丁名HindIII为

名属种株序来源称名名名号菌株EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacoliR

HindⅢHindⅢHaemophilusinfluenzaed

HindⅡHindⅡHaemophilusinfluenzaed

HpaⅠHpa/ⅠHaemophilusparainfluenzaea

二.限制性内切酶23名属种株序6.特性** 分子质量为60kd，单链多肽，最适pH为6～8 NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用 对热不稳定，通常贮存于–20℃环境。为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度二.限制性内切酶246.特性** 分子质量为60kd，单链多肽，最适pH为6～能在DNA上相同的位置切割——用于基因分析及表达的众多技术的基础通常是由4-6个碱基对组成的具有回文序列的DNA片段，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键二.限制性内切酶1)每一种酶都有各自特异识别位点25能在DNA上相同的位置切割——用于基因分析及表达的众多技术的

不同酶识别的碱基数目也不同，一般为4、5或6个碱基对识别序列碱基对越多，则这种酶在DNA上出现的频率越低不同生物其碱基含量不同，酶识别位点的分布及频率也不同二.限制性内切酶识别序列的频率=1/4N

Sau3A(4bp)：1/44=256bp

EcoRI、PstI(6bp)：1/46=4096

NotI(8bp)：1/48=65536（rarecutters）

仅是理论推测26不同酶识别的碱基数目也不同，一般为4、5或6个碱基对二.2)大多数限制酶是错位切割双链DNA，产生5’或3’粘性末端5`粘性末端二.限制性内切酶272)大多数限制酶是错位切割双链DNA，产生5’或3’粘性末 很多限制酶不能精确地在2个对称轴部位切割，而在识别序列2条链对应位上错位切割，切割产物有些形成5’-突出的粘性末端,另一些为3’-突出的粘性末端 这些粘性末端的任何一侧都能和另一末端互补配对，使任何含有该识别序列的DNA分子都能和另一个含相同识别序列的DNA分子容易地连接成新的重组分子二.限制性内切酶28 很多限制酶不能精确地在2个对称轴部位切割，而在识别序列2条5’到3’DNA外切酶活性结果： 黏性末端（包括平末端）连接起来简单的说:能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段5′---CTGCAG---3′5′---CTGCApOHG--3′2)大多数限制酶是错位切割双链DNA，产生5’或3’粘性末端商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油作为保护剂，一般在20℃保存。在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接远距离裂解酶：识别位点与切割位置不一致由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多，故在平末端连接反应中，T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要求较高为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？如EcoRI的识别序列为T4DNA连接酶应用更广泛一些EcoRⅠGAATTC3′---CTTAAG---5′EcoRI3′---CTTAAOHPG---5′决不能用水稀释,以免变性失活切除DNA片段上的单链末端，形成平末端标记DNA片段的末端等切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。逆转录酶又称RNA依赖的DNA聚合酶（RNAdependentDNApolymerase），存在于肿瘤病毒中由于具有相同的（如EcoRI）粘性末端，能退火形成双链结合体。第二章基因操作的工具酶29限制内切酶

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端二.限制性内切酶5’到3’DNA外切酶活性第二章基因操作的工具酶2929

3)部分限制酶沿识别序列内的对称轴上切割DNA双链，产生平末端5`---CCCGGG---3`3`---GGGCCC---5`5`---CCCGGG---3`3`---GGGCCC---5`平末端SmaⅠ二.限制性内切酶303)部分限制酶沿识别序列内的对称轴上切割DNA双链，产不同限制性内切酶切割的三种结果a.产生5′突出粘性末端（cohesiveend):以EcoRI为例：5′---GAATTC---3′5′---GP

OHAATTC---3′3′---CTTAAG---5′EcoRI3′---CTTAAOHPG---5′b.产生3′突出粘性末端:以PstI为例：5′---CTGCAG---3′5′---CTGCAp

OHG--3′3′---GACGTC---5′PstI3′---GOHpACGTC--5′

c.产生平末端（bluntend):以NruI为例：5′---TCGCGA---3′5′---TCGp

OHCGA---3′3′---AGCGCT---5′NruI3′---AGCOHpGCT---5′二.限制性内切酶31不同限制性内切酶切割的三种结果a.产生5′突出粘性末端（c

4）同尾酶有些限制酶来源不同、识别序列不同，但可产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶如BamHI和BglII二.限制性内切酶R324）同尾酶有些限制酶来源不同、识别序列不同，5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`BglIIBamHⅠ二.限制性内切酶335`---GGATCC---3`5`---G5)同位酶

同位酶识别相同的序列但切割位点不一样的限制性核酸内切酶。如SmaI和XmaI同位酶 限制性内切核酸酶HpaII和MspI是同位酶，切割同样的DNA序列CCGG，但对这个序列的甲基化状态有不同的限制性反应MspI切割所有状态下的CCGG序列，而HpaII仅切割非甲基化的CCGG序列。这样MspI被用来识别所有的CCGG序列，而HpaII能用来确定是否甲基化二.限制性内切酶R345)同位酶 同位酶识别相同的序列但切割位点不一样的6）同功异源酶同功异源酶或同裂酶（isoschizomer）:来源不同但能识别和切割同一位点的限制酶二.限制性内切酶其他：远距离裂解酶：识别位点与切割位置不一致可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的Subset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中R356）同功异源酶同功异源酶或同裂酶（isoschizomer）产生相同序列突出末端的三种方式用同一种限制酶切割用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割用识别相同靶序列的不同限制酶切割二.限制性内切酶36产生相同序列突出末端的三种方式用同一种限制酶切割二.限制性

限制性内切核酸酶识别序列具有180。旋转对称的回文结构如EcoRI的识别序列为5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

7)回文结构二.限制性内切酶37 限制性内切核酸酶识别序列具有180。旋转对称的回文结构如 ①温度一般37℃ ②盐离子浓度Na＋，Mg2＋ ③缓冲体系具有稳定pH环境的TrisHCl缓冲体系DTT用于保持酶稳定性和活性 ④反应体积和甘油浓度商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油作为保护剂，一般在20℃保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘油浓度过高，影响酶切反应7．影响内切酶酶切反应的条件*二.限制性内切酶38 ①温度一般37℃7．影响内切酶酶切反应的条件*二.限制⑤反应时间通常为1h；进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜⑥DNA纯度和结构 一个酶单位定义1h内完全酶解1μgλ噬菌体DNA所需的酶量 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、RNA等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度 酶切的底物一般为双链DNA，DNA的甲基化位置会影响酶切反应二.限制性内切酶39二.限制性内切酶39标记DNA片段的末端等用途：DNA缺口平移中标记DNA探针名属种株序来源5′---CTGCAG---3′5′---CTGCApOHG--3′被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端这样MspI被用来识别所有的CCGG序列，而HpaII能用来确定是否甲基化为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？NAD+可促进该催化反应；直接用T4DNA连接酶连接效率不高，较少采用在用γP32磷酸和多核苷酸激酶在5’端标记DNA或RNA之前，进行碱性磷酸酶处理；宿主细胞中甲基化的DNA位点被保护起来，不会被限制性核酸内切酶消化⑤反应时间通常为1h；细菌碱性磷酸酶（BAP）：E.有些限制酶来源不同、识别序列不同，但可产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶分子质量为60kd，单链多肽，最适pH为6～8根据结构和功能的特异性，即其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，可将已发现的内切核酸酶分为三类：即I型、II型、III型酶简单的说:能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段酶的活性单位 1个活性单位在适当的反应条件下(包括温度、pH和离子强度等),1h内在50μl容积中完全酶解1μg特定DNA底物(通常用λDNA)所需要的酶量二.限制性内切酶40标记DNA片段的末端等酶的活性单位 1个活性单位在适当的反“星”活性 “星”活性酶特异性改变或特异性降低而呈现的活性 酶在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列，在名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoRⅠ*AATT；EcoRⅠGAATTC 只有在相当特殊的条件下,酶活才与发表的结果相符，必须采用规范的实验步骤,坚持应用推荐的反应条件 二.限制性内切酶41“星”活性 “星”活性酶特异性改变或特异性降低而呈现的活性底物位点优势效应

酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同二.限制性内切酶42底物位点优势效应 酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切用途 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析二.限制性内切酶43用途 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用价格昂贵决不能用水稀释,以免变性失活预先加入除酶以外的所有其他试剂取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融使用无菌的新吸头少加水,使体积最小,但保证酶液体积不超过总体积的10％,否则酶液中的甘油会抑制酶活性酶切反应注意事项二.限制性内切酶44价格昂贵酶切反应注意事项二.限制性内切酶44三.DNA连接酶

常用连接酶DNA连接酶的作用及机理DNA连接酶的反应条件DNA片段的连接重组DNA实验的一般程序45三.DNA连接酶常用连接酶45定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3＇羟基和5＇磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来功能：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用提取：许多原核和真核生物及病毒中DNA连接酶R三.DNA连接酶46定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3＇羟基和5＇三.DNA连接酶47三.DNA连接酶47 在基因工程中使用的连接酶主要有大肠杆菌连接酶和T4噬菌体DNA连接酶 前者需要NAD＋作为能源；后者以ATP作为辅助因子 二者都能连接平末端和黏性末端 T4DNA连接酶应用更广泛一些1.常用连接酶三.DNA连接酶E.coliDNA连接酶：Mr=74000,作用于5‘端带磷酸基团的DNA底物；NAD+可促进该催化反应；分子克隆使用不多，亦不能连接RNA用途:cDNA第二链合成T4DNA连接酶：一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子48 在基因工程中使用的连接酶主要有大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶的作用：在双链DNA中，DNA连接酶能催化具有邻近3’-羟基和5’-磷酸基的单链形成磷酸二酯键，促使具有互补粘性末端或平末端的载体和供体DNA片段连接，使之成为一个完整的重组DNA分子连接的部位： 磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）结果： 黏性末端（包括平末端）连接起来问题用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？三.DNA连接酶2.DNA连接酶的作用及机制49连接酶的作用：在双链DNA中，DNA连接酶能催化具有邻近3’DNA连接酶的作用过程分3步连接酶与辅助因子ATP或NAD＋形成酶AMP复合物AMP作用于DNA缺口的5’末端磷酸基团缺口3’OH对活跃的磷原子作亲核攻击，形成新的磷酸二酯键，封闭切口R三.DNA连接酶50DNA连接酶的作用过程分3步R三.DNA连接酶50三.DNA连接酶51三.DNA连接酶51连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下，然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是37℃ 但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，所以连接反应一般采用16℃过夜3.DNA连接酶的反应条件三.DNA连接酶52连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数内切酶产生的粘DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍 由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多，故在平末端连接反应中，T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要求较高防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体时间：过夜最好三.DNA连接酶53DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍三.4.DNA片段的连接粘性末端DNA片段的连接平末端DNA片段的连接三.DNA连接酶544.DNA片段的连接粘性末端DNA片段的连接三.DNA连接粘性末端DNA片段的连接三.DNA连接酶55粘性末端DNA片段的连接三.DNA连接酶55直接用T4DNA连接酶连接效率不高，较少采用同聚物谱尾连接平末端DNA片段先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA连接酶进行连接用衔接物连接平末端DNA分子目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接平末端DNA片段的连接三.DNA连接酶R56直接用T4DNA连接酶连接效率不高，较少采用平末端DNA片第二章基因操作的工具酶57应用互补的同聚物加尾法连接DNA片段三.DNA连接酶第二章基因操作的工具酶57应用互补的同聚物加尾法连接D57用衔接物分子连接平末端的DNA片段衔接物：指用化学方法合成的一段由若干个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段三.DNA连接酶58用衔接物分子连接平末端的DNA片段衔接物：指用化学方法合成的5.重组DNA实验的一般程序选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶（如EcoRI）作位点特异的切割，形成全长的具粘性末端的线性DNA分子再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoRI）粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子三.DNA连接酶595.重组DNA实验的一般程序选用一种对载体DNA只具唯一限制由噬菌体编码催化单链DNA或RNA连接主要用途：是对RNA进行3＇末端标记T4RNA连接酶三.DNA连接酶60由噬菌体编码T4RNA连接酶三.DNA连接酶60四.DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶IK1enow片段T4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶逆转录酶依赖于RNA的DNA聚合酶RNA聚合酶依赖于DNA的DNA聚合酶61四.DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I依赖于DNA的DNA具有3种酶活性①5’ 3’

DNA聚合酶活性②5’ 3’

DNA外切酶活性③3’ 5’

DNA外切酶活性用途：DNA缺口平移中标记DNA探针1.大肠杆菌DNA聚合酶I四.DNA聚合酶 以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链DNA分子的3’-OH端而合成新的DNA62具有3种酶活性1.大肠杆菌DNA聚合酶I四.DNA聚合酶 用蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶I后①小片段 5’ 3’DNA外切酶活性②大片段 5’ 3’DNA聚合酶活性 3’ 5’DNA外切酶活性大片段称为Klenow大片段酶

2.Klenow片段四.DNA聚合酶632.Klenow片段四.DNA聚合酶63E.coliDNA聚合酶I和Klenow片段5’到3‘DNA聚合酶活性3’到5’DNA外切酶活性5’到3’

DNA外切酶活性5’到3’

DNA外切酶活性蛋白酶处理DNA聚合酶I全酶Klenow片段酶四.DNA聚合酶64E.coliDNA聚合酶I和Klenow片段5’到3‘DNA用途Klenow片段广泛用于各种克隆实验补齐双链DNA的3’末端；如补平经限制酶消化的DNA所形成的3’凹端双链DNA3’末端的标记；标记DNA片段的末端等在cDNA合成中，第二链的合成DNA序列分析3’端的末端标记随机引物标记核酸探针四.DNA聚合酶R65用途Klenow片段广泛用于各种克隆实验四.DNA聚合酶3.T4DNA聚合酶来源从T4噬菌体感染的E.coli中分离得到具5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性四.DNA聚合酶663.T4DNA聚合酶来源从T4噬菌体感染的E.coli中分TaqDNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermusaquaticus)中分离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶，最适温度75℃-80℃需要Mg2+(10mmol／L)，在低浓度Mn2+(2mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至0.1moI／L对活性无影响，而最适浓度NaCl为40mmol/L，KCl为60mmol/L最适pH7.8(Tris-HCl)，与大肠杆菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高温和无核酸酶活性自1976年从Thermusaquaticus菌中分离纯化后，直至1985年PCR概念形成，才将此酶应用于PCR技术的建立和完善。对基因克隆、测序、突变研究和检测诊断等方面发挥巨大作用4.TaqDNA聚合酶四.DNA聚合酶67TaqDNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermusaqua5.逆转录酶一种有效的转录RNA成为DNA的酶，即以RNA链为模板，以带3’OH末端的DNA片段为引物，沿5’ 3’方向合成DNA链产物DNA又称cDNA，即互补DNA逆转录酶又称RNA依赖的DNA聚合酶（RNAdependentDNApolymerase），存在于肿瘤病毒中主要用途转录mRNA成为cDNA制备基因片段四.DNA聚合酶685.逆转录酶一种有效的转录RNA成为DNA的酶，即以RNA链种类：AMV-逆转录酶Mo-MLV-逆转录酶5’3’聚合酶活性（+）3’5’外切酶活性（-）四.DNA聚合酶69种类：5’3’聚合酶活性（+）四.DNA聚合酶69催化RNA体外合成反应依赖DNA的RNA聚合酶不依赖DNA的RNA聚合酶

6.RNA聚合酶四.DNA聚合酶70催化RNA体外合成反应6.RNA聚合酶四.DNA聚合酶7五.DNA和RNA的修饰酶核酸酶碱性磷酸酶磷酸激酶末端脱氧核苷酸转移酶甲基化酶71五.DNA和RNA的修饰酶核酸酶71以核酸为底物的水解酶按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶按作用位点分：内切或外切酶（许多兼有内外切活性）

5’-核酸酶或3’-核酸酶常用：BAL31核酸酶、核酸酶S1、绿豆核酸酶、RNaseA、

RNaseT1、DNaseⅠ、外切核酸酶Ⅲ、λ噬菌体外切核酸酶等1.核酸酶五.修饰酶72以核酸为底物的水解酶1.核酸酶五.修饰酶72核酸酶的分类五.修饰酶核酸酶非专一专一性内切酶外切酶RNADNA内切酶外切酶外切酶内切酶3＇-核酸酶5＇-核酸酶非限制性限制性3＇-核酸酶5＇-核酸酶73核酸酶的分类五.修饰酶核酸酶非专一专一性内切酶外切酶RNAD1）核酸酶SI功能 降解ssDNA或ssRNA形成5’磷酸末端的单或寡核苷酸片段应用分析DNARNA杂交体结构。通过降解成熟mRNA与放射性标记基因组、DNA的杂交体确定内含子部位切除DNA片段上的单链末端，形成平末端切开cDNA合成过程中形成的发夹环在限制酶位点上产生小缺失五.修饰酶741）核酸酶SI功能五.修饰酶74核酸外切酶III核酸外切酶VIIDNA酶IRNA酶A(牛胰)RNA酶TI

RNA酶H其他常见核酸酶五.修饰酶75核酸外切酶III其他常见核酸酶五.修饰酶752.碱性磷酸酶

功能催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5’端磷酸基团,从DNA片段上除去5’磷酸以防自身连接用途在用γP32磷酸和多核苷酸激酶在5’端标记DNA或RNA之前，进行碱性磷酸酶处理；在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接五.修饰酶R762.碱性磷酸酶功能催化去除DNA、RNA、rNTP和dNT细菌碱性磷酸酶（BAP）：E.coli中分离牛肠道碱性磷酸酶（CIP）牛肠道分离 BAP活性更高,对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后很难完全抑制BAP活性除去CIP可用蛋白酶K降解分类 五.修饰酶77细菌碱性磷酸酶（BAP）：E.coli中分离分类 五.修第九讲基因操作的工具酶第九讲基因操作的工具酶78优选第九讲基因操作的工具酶优选第九讲基因操作的工具酶79一.基因工程工具酶的概念

在DNA分子水平的操作中，依赖于一些重要的酶，如限制性核酸内切酶、连接酶等，作为工具对DNA进行切割和拼接，这些酶统称为基因工程工具酶

80一.基因工程工具酶的概念 在DNA分子水平的操作中，依赖于基因工程必需的两个工具酶“分子剪刀”

⒈限制性核酸内切酶

——在DNA上核苷酸的特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI,HpaI“分子胶”⒉DNA连接酶——促使具有互补粘性末端或平头末端的载体和供体DNA片段连接，形成重组DNA分子一、工具酶概念81基因工程必需的两个工具酶“分子⒈限制性核酸内切酶——限制性内切酶与DNA连接酶细菌细胞内特异性降解外源核酸分子的核酸酶，其作用特点是特异性降解异源DNA分子(甲基化修饰差异)I类限制酶随机切割双链DNA分子，II类限制酶识别、切割特殊的回文(对称)序列来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接形成重组DNA分子通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶一、工具酶概念82限制性内切酶与DNA连接酶细菌细胞内特异性降解外源核酸分子的核酸核酸水解酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸内切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸转移酶磷酸酶一、工具酶概念83核酸核酸水解酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸内切酶DNA常用的工具酶工具酶类功能限制性核酸内切酶特异性识别和切割DNAT4DNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端脱氧核苷酰转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基TaqDNA聚合酶DNA合成、PCR一、工具酶概念84常用的工具酶工具酶类功能限制性核酸内切酶特异性识别和切割DN二.限制性核酸内切酶

定义发现限制—修饰系统分类命名特性影响内切酶酶切反应的条件85二.限制性核酸内切酶定义8主要用途转录mRNA成为cDNA制备基因片段CGTTACGAATCGGTA第二章基因操作的工具酶用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点第二、三字母小写，来源细菌种名的头2个字母DNA浓度：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍5`---AGATCT---3`具5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性T4DNA连接酶应用更广泛一些通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶5’3’聚合酶活性（+）限制性核酸内切酶EcoRI及为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？3`---CCTAGG---5`RNA酶A(牛胰)在cDNA合成中，第二链的合成功能催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5’端磷酸基团,从DNA片段上除去5’磷酸以防自身连接多样性:限制酶有200多种5’5’GCAATGCTTAGCCATCGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸内切酶核酸外切酶二.限制性内切酶86主要用途转录mRNA成为cDNA制备基因片段5’5’G5’5’GCAAGCTTTAGCCATCGTTCGAAATCGGTA限制性核酸内切酶二.限制性内切酶875’5’GCAAGCTTT 限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease）是指能识别双链DNA分子内部特异位点并在识别位点或附近水解磷酸二酯键的一类内切核酸酶，简称为限制酶（restrictionenzyme）1.定义一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子切断目前已发现的限制酶有200多种二.限制性内切酶88 限制性内切核酸酶（restrictionendonuc限制性核酸内切酶的作用 简单的说:能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段 切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）二.限制性内切酶89限制性核酸内切酶的作用 简单的说:能在特异位点（酶切位点）上2.发现 大肠杆菌中发现，如能切割降解噬菌体DNA而限制外源DNA 因切点在外源DNA内部，故叫内切酶二.限制性内切酶如果在细菌中没有发现ER，现代分子生物学和重组DNA就不可能发展起来902.发现 大肠杆菌中发现，如能切割降解噬菌体DNA而限制外 20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象” 1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一种是核酸内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，这类酶称为限制性核酸内切酶限制酶概念提出的背景二.限制性内切酶91 20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感①分布②作用特点③结果主要在微生物中专一性:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子多样性:限制酶有200多种产生黏性末端或平末端分子剪刀——限制性内切酶二.限制性内切酶R92①分布主要在微生物中专一性:一种限制酶只能识别一种特定的②盐离子浓度Na＋，Mg2＋来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接形成重组DNA分子结果： 黏性末端（包括平末端）连接起来能在DNA上相同的位置切割——用于基因分析及表达的众多技术的基础功能催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5’端磷酸基团,从DNA片段上除去5’磷酸以防自身连接多样性:限制酶有200多种酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘油浓度过高，影响酶切反应EcoRⅠGAATTC①小片段 5’ 3’DNA外切酶活性产生相同序列突出末端的三种方式专一性:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子3’5’外切酶活性（-）GCAAGCTTTAGCCAT5′---CTGCAG---3′5′---CTGCApOHG--3′但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，所以连接反应一般采用16℃过夜5’到3‘DNA聚合酶活性②5’ 3’DNA外切酶活性主要用途转录mRNA成为cDNA制备基因片段②大片段 5’ 3’DNA聚合酶活性最常用的限制性核酸内切酶二.限制性内切酶93②盐离子浓度Na＋，Mg2＋最常用的限制性核酸内切酶二.3.限制－修饰系统为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？

因为几乎所有的限制性内切核酸酶都要和能识别而且甲基化相同DNA位点的甲基化酶共同作用 这两个酶：限制性内切核酸酶和甲基化酶一起称为限制－修饰系统。宿主细胞中甲基化的DNA位点被保护起来，不会被限制性核酸内切酶消化二.限制性内切酶943.限制－修饰系统为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？限制性核酸内切酶EcoRI及修饰的甲基化酶MEcoRI的限制与修饰作用二.限制性内切酶95限制性核酸内切酶EcoRI及二.限制性内切酶18

4.分类

根据结构和功能的特异性，即其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，可将已发现的内切核酸酶分为三类：即I型、II型、III型酶 I型和III型酶在同一蛋白酶分子中兼有甲基化酶及限制性内切核酸酶活性，又因其识别位点与切割位点不固定，所以价值不大 II型酶切割DNA片断活性和甲基化作用是分开的，且核酸内切作用又具有序列特异性，在基因克隆中广泛使用 通常所用的限制性内切核酸酶是指II型的

二.限制性内切酶964.分类 根据结构和功能的特异性，即其识别和切割序列的特性二.限制性内切酶R二.限制性内切酶R975.命名

采用Smith和Athens提议的方案，根据限制性内切核酸酶来源和菌株进行命名用来源细菌的英文缩写斜体符号命名它的第一个字母大写，来源细菌属名的第1个字母第二、三字母小写，来源细菌种名的头2个字母第四个字母代表菌株最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号二.限制性内切酶R985.命名 采用Smith和Athens提议的方案，根据限制性 前3个字母来自产生菌－流感噬血菌的拉丁名“H”来自属名Haemopbilus的第一个字母“in”来自种名influenzae的前两个字母“d”来自菌株名Rd的d“III”说明是在该菌株中发现的第三种限制性核酸内切酶HindIII为例二.限制性内切酶HindⅢ代表从流感噬血杆菌（Haemophilusinfluenzac）d株中分离到的第3个限制酶99 前3个字母来自产生菌－流感噬血菌的拉丁名HindIII为

名属种株序来源称名名名号菌株EcoRⅠEcoRⅠEscherichiacoliR

HindⅢHindⅢHaemophilusinfluenzaed

HindⅡHindⅡHaemophilusinfluenzaed

HpaⅠHpa/ⅠHaemophilusparainfluenzaea

二.限制性内切酶100名属种株序6.特性** 分子质量为60kd，单链多肽，最适pH为6～8 NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用 对热不稳定，通常贮存于–20℃环境。为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度二.限制性内切酶1016.特性** 分子质量为60kd，单链多肽，最适pH为6～能在DNA上相同的位置切割——用于基因分析及表达的众多技术的基础通常是由4-6个碱基对组成的具有回文序列的DNA片段，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键二.限制性内切酶1)每一种酶都有各自特异识别位点102能在DNA上相同的位置切割——用于基因分析及表达的众多技术的

不同酶识别的碱基数目也不同，一般为4、5或6个碱基对识别序列碱基对越多，则这种酶在DNA上出现的频率越低不同生物其碱基含量不同，酶识别位点的分布及频率也不同二.限制性内切酶识别序列的频率=1/4N

Sau3A(4bp)：1/44=256bp

EcoRI、PstI(6bp)：1/46=4096

NotI(8bp)：1/48=65536（rarecutters）

仅是理论推测103不同酶识别的碱基数目也不同，一般为4、5或6个碱基对二.2)大多数限制酶是错位切割双链DNA，产生5’或3’粘性末端5`粘性末端二.限制性内切酶1042)大多数限制酶是错位切割双链DNA，产生5’或3’粘性末 很多限制酶不能精确地在2个对称轴部位切割，而在识别序列2条链对应位上错位切割，切割产物有些形成5’-突出的粘性末端,另一些为3’-突出的粘性末端 这些粘性末端的任何一侧都能和另一末端互补配对，使任何含有该识别序列的DNA分子都能和另一个含相同识别序列的DNA分子容易地连接成新的重组分子二.限制性内切酶105 很多限制酶不能精确地在2个对称轴部位切割，而在识别序列2条5’到3’DNA外切酶活性结果： 黏性末端（包括平末端）连接起来简单的说:能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段5′---CTGCAG---3′5′---CTGCApOHG--3′2)大多数限制酶是错位切割双链DNA，产生5’或3’粘性末端商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油作为保护剂，一般在20℃保存。在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接远距离裂解酶：识别位点与切割位置不一致由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多，故在平末端连接反应中，T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要求较高为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？如EcoRI的识别序列为T4DNA连接酶应用更广泛一些EcoRⅠGAATTC3′---CTTAAG---5′EcoRI3′---CTTAAOHPG---5′决不能用水稀释,以免变性失活切除DNA片段上的单链末端，形成平末端标记DNA片段的末端等切割不同来源的DNA分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀”）20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。逆转录酶又称RNA依赖的DNA聚合酶（RNAdependentDNApolymerase），存在于肿瘤病毒中由于具有相同的（如EcoRI）粘性末端，能退火形成双链结合体。第二章基因操作的工具酶106限制内切酶

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端二.限制性内切酶5’到3’DNA外切酶活性第二章基因操作的工具酶29106

3)部分限制酶沿识别序列内的对称轴上切割DNA双链，产生平末端5`---CCCGGG---3`3`---GGGCCC---5`5`---CCCGGG---3`3`---GGGCCC---5`平末端SmaⅠ二.限制性内切酶1073)部分限制酶沿识别序列内的对称轴上切割DNA双链，产不同限制性内切酶切割的三种结果a.产生5′突出粘性末端（cohesiveend):以EcoRI为例：5′---GAATTC---3′5′---GP

OHAATTC---3′3′---CTTAAG---5′EcoRI3′---CTTAAOHPG---5′b.产生3′突出粘性末端:以PstI为例：5′---CTGCAG---3′5′---CTGCAp

OHG--3′3′---GACGTC---5′PstI3′---GOHpACGTC--5′

c.产生平末端（bluntend):以NruI为例：5′---TCGCGA---3′5′---TCGp

OHCGA---3′3′---AGCGCT---5′NruI3′---AGCOHpGCT---5′二.限制性内切酶108不同限制性内切酶切割的三种结果a.产生5′突出粘性末端（c

4）同尾酶有些限制酶来源不同、识别序列不同，但可产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶如BamHI和BglII二.限制性内切酶R1094）同尾酶有些限制酶来源不同、识别序列不同，5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---GGATCC---3`3`---CCTAGG---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`5`---AGATCT---3`3`---TCTAGA---5`BglIIBamHⅠ二.限制性内切酶1105`---GGATCC---3`5`---G5)同位酶

同位酶识别相同的序列但切割位点不一样的限制性核酸内切酶。如SmaI和XmaI同位酶 限制性内切核酸酶HpaII和MspI是同位酶，切割同样的DNA序列CCGG，但对这个序列的甲基化状态有不同的限制性反应MspI切割所有状态下的CCGG序列，而HpaII仅切割非甲基化的CCGG序列。这样MspI被用来识别所有的CCGG序列，而HpaII能用来确定是否甲基化二.限制性内切酶R1115)同位酶 同位酶识别相同的序列但切割位点不一样的6）同功异源酶同功异源酶或同裂酶（isoschizomer）:来源不同但能识别和切割同一位点的限制酶二.限制性内切酶其他：远距离裂解酶：识别位点与切割位置不一致可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的Subset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中R1126）同功异源酶同功异源酶或同裂酶（isoschizomer）产生相同序列突出末端的三种方式用同一种限制酶切割用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割用识别相同靶序列的不同限制酶切割二.限制性内切酶113产生相同序列突出末端的三种方式用同一种限制酶切割二.限制性

限制性内切核酸酶识别序列具有180。旋转对称的回文结构如EcoRI的识别序列为5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

7)回文结构二.限制性内切酶114 限制性内切核酸酶识别序列具有180。旋转对称的回文结构如 ①温度一般37℃ ②盐离子浓度Na＋，Mg2＋ ③缓冲体系具有稳定pH环境的TrisHCl缓冲体系DTT用于保持酶稳定性和活性 ④反应体积和甘油浓度商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油作为保护剂，一般在20℃保存。酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘油浓度过高，影响酶切反应7．影响内切酶酶切反应的条件*二.限制性内切酶115 ①温度一般37℃7．影响内切酶酶切反应的条件*二.限制⑤反应时间通常为1h；进行大量DNA酶切反应时一般让酶解过夜⑥DNA纯度和结构 一个酶单位定义1h内完全酶解1μgλ噬菌体DNA所需的酶量 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、RNA等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度 酶切的底物一般为双链DNA，DNA的甲基化位置会影响酶切反应二.限制性内切酶116二.限制性内切酶39标记DNA片段的末端等用途：DNA缺口平移中标记DNA探针名属种株序来源5′---CTGCAG---3′5′---CTGCApOHG--3′被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端这样MspI被用来识别所有的CCGG序列，而HpaII能用来确定是否甲基化为什么此酶不切割宿主细胞自身DNA呢？NAD+可促进该催化反应；直接用T4DNA连接酶连接效率不高，较少采用在用γP32磷酸和多核苷酸激酶在5’端标记DNA或RNA之前，进行碱性磷酸酶处理；宿主细胞中甲基化的DNA位点被保护起来，不会被限制性核酸内切酶消化⑤反应时间通常为1h；细菌碱性磷酸酶（BAP）：E.有些限制酶来源不同、识别序列不同，但可产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶分子质量为60kd，单链多肽，最适pH为6～8根据结构和功能的特异性，即其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，可将已发现的内切核酸酶分为三类：即I型、II型、III型酶简单的说:能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性DNA片段酶的活性单位 1个活性单位在适当的反应条件下(包括温度、pH和离子强度等),1h内在50μl容积中完全酶解1μg特定DNA底物(通常用λDNA)所需要的酶量二.限制性内切酶117标记DNA片段的末端等酶的活性单位 1个活性单位在适当的反“星”活性 “星”活性酶特异性改变或特异性降低而呈现的活性 酶在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列，在名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoRⅠ*AATT；EcoRⅠGAATTC 只有在相当特殊的条件下,酶活才与发表的结果相符，必须采用规范的实验步骤,坚持应用推荐的反应条件 二.限制性内切酶118“星”活性 “星”活性酶特异性改变或特异性降低而呈现的活性底物位点优势效应

酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同二.限制性内切酶119底物位点优势效应 酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切用途 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析二.限制性内切酶120用途 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用价格昂贵决不能用水稀释,以免变性失活预先加入除酶以外的所有其他试剂取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融使用无菌的新吸头少加水,使体积最小,但保证酶液体积不超过总体积的10％,否则酶液中的甘油会抑制酶活性酶切反应注意事项二.限制性内切酶121价格昂贵酶切反应注意事项二.限制性内切酶44三.DNA连接酶

常用连接酶DNA连接酶的作用及机理DNA连接酶的反应条件DNA片段的连接重组DNA实验的一般程序122三.DNA连接酶常用连接酶45定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3＇羟基和5＇磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来功能：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用提取：许多原核和真核生物及病毒中DNA连接酶R三.DNA连接酶123定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3＇羟基和5＇三.DNA连接酶124三.DNA连接酶47 在基因工程中使用的连接酶主要有大肠杆菌连接酶和T4噬菌体DNA连接酶 前者需要NAD＋作为能源；后者以ATP作为辅助因子 二者都能连接平末端和黏性末端 T4DNA连接酶应用更广泛一些1.常用连接酶三.DNA连接酶E.coliDNA连接酶：Mr=74000,作用于5‘端带磷酸基团的DNA底物；NAD+可促进该催化反应；分子克隆使用不多，亦不能连接RNA用途:cDNA第二链合成T4DNA连接酶：一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子125 在基因工程中使用的连接酶主要有大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶的作用：在双链DNA中，DNA连接酶能催化具有邻近3’-羟基和5’-磷酸基的单链形成磷酸二酯键，促使具有互补粘性末端或平末端的载体和供体DNA片段连接，使之成为一个完整的重组DNA分子连接的部位： 磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）结果： 黏性末端（包括平末端）连接起来问题用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二