细胞生物学研究方法课件

细胞生生物学研究方法第二章班级：09级1班学号：人生格言：既然选择了远方就要风雨兼程！本章概括显微成像技术细胞化学技术细胞分选技术细胞工程技术分离技术分子生物学方法2.1显微成像技术发展史：1590年，Z.janssen和他的侄子H.janssen共同研制出最早的光学显微镜。后来，胡克和列文虎克相继提高了光学显微镜的分辨率，观察到了细胞的结构。2.1.1.1分辨率

两个物点间最小距离的能力这种距离成为分辨距离。是透镜最重要的性质其中：n=聚光镜和物镜之间介质的折射率，空气为1，油为1.5α

=样品对物镜孔径角的半角，sin

α的最大值为1λ=照明光源的波长

0.61是一个恒定的参数，表示成像的点虽被重叠担仍能被区分的程度2.1.1.2分辨极限和放大率最终成像的大小与原物大小的比值称为放大率可见光的波长的限制光学显微镜的最高分辨率2.1.2常见的光学显微镜普通双筒显微荧光显微镜相差显微镜暗视野显微镜倒置显微镜偏光显微镜荧光显微镜(Fluorescencemicroscope)荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。

倒置显微镜（invertedmicroscope

）组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。相差显微镜(Phasecontrastmicroscope相差显微镜由P．Zernike于1935年发明，并因此获1953年诺贝尔物理学，这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。

差显微镜具有两个其他显微镜所不具有的功能:①将直射的光(视野中背景光)与经物体衍射的光分开;②将大约一半的波长从相位中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变化。

2.1.3光学显微镜的样品制备样品可粗略的分为两类：整体和切片步骤：1、样品的固定杀死细胞、稳定细胞的化学成分2、包埋和切片液体的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块组织，硬化成固体包埋块，然后切割3、染色给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscopy，SEM）1938第一部扫描电子显微镜由VonArdenne发展成功。

完全不同于透射电子显微镜的方式成像，即用电视的方式成像。扫描电子显微镜主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。二次电子能够产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大像。

2.1.5电子显微镜的样品制备样品要薄;要求很好的保持样品的精细结构样品要具有一定的反差特殊技术负染色喷灌技术冷冻断裂复原和冷冻蚀刻2.1.6间接成像技术它作为一种扫描探针显微术工具，扫描隧道显微镜可以让科学家观察和定位单个原子，它具有比它的同类原子力显微镜更加高的分辨率。此外，扫描隧道显微镜在低温下（4K）可以利用探针尖端精确操纵原子，因此它在纳米科技既是重要的测量工具又是加工工具。一种可用来研究包括绝缘体在内的固体材料表面结构的分析仪器。它通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。原子力学显微镜2.2细胞化学技术2.2.1酶细胞化学技术（enzymecytochemistry）酶细胞化学技术：将细胞内的酶与底物相互作用，再将酶反应的产物作为反应物质，在酶的作用部位进行捕捉，使其在显微镜下具有可见性。这种在酶作用下产生反应产物，经捕捉反应来间接证明酶定位的反应称为酶的细胞化学反应。

1、基本原理酶的细胞化学反应包括两个反应:第一反应是酶作用于底物的反应，称酶反应，形成的产物称为初级反应产物;第二反应是捕捉剂与初级反应产物的作用，称捕捉反应，产生最终反应产物：

┌────酶的细胞化学反应─────┐

│酶+条件捕捉剂

底物──→初级反应产物──→最终反应产物

（酶反应）（捕捉反应）2.2.2免疫细胞化学技术利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫细胞化学技术。

免疫荧光技术将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。免疫电镜技术免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、结合定位的一种方法学。2.3细胞分选技术概念；主要用流式细胞仪对细胞或染色体进行分选，并对单个细胞或其他生物微粒进行定量分析，包括测量细胞的大小、形状、细胞DNA、RNA含量和细胞总蛋白等。工作原理

将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

体外细胞培养原代培养原代培细胞系和细胞株动物细胞培养与植物组织培养的区别a.培养基不同：植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基）b.培养基的成分不同：动物细胞培养必须利用动物血清，植物组织培养则不需要。c.产物不同：植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是同一种的细胞。d.原理不同：植物组织培养的原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理为细胞的增殖。

2.4.2细胞融合与单克隆抗体细胞融合在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞的过程。细胞融合技术是一种新的获得杂交细胞以改变细胞性能的技术。细胞融合可以在分类学上亲缘关系较远的生物之间进行，因此它不但是菌种改良的一种重要手段，而且是动物或植物品种改良的一种有潜力的方法。2.4.3动物细胞核移植克隆技术多利羊的克隆过程：2.5分离技术2.5.1离心分离技术

借助于离心力，使比重不同的物质进行分离的方法。由于离心机等设备可产生相当高的角速度，使离心力远大于重力，于是溶液中的悬浮物便易于沉淀析出:又由于比重不同的物质所受到的离心力不同，从而沉降速度不同，能使比重不同的物质达到分离。

有差速离心、、密度梯度离心（速度沉降、等密度沉降）2.6分子生物学方法基因工程技术基因作图与人类基因组计划PCR技术选择性基因剔除和转基因鼠乳腺生物反应器技术2.6.1基因工程技术定义：基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。

2.6.2基因作图和人类基因组计划发展：人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。目标：用15年时间测出24条染色体DNA的全部核苷酸序列，拟阐明人类遗传信息的组成及约3到5万个基因的结构和定位。人能长生不老吗？2.6.3

PCR技术美国科学家PE（Perkin

Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr.

Mullis发明，由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年化学诺贝尔奖。是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction），简称PCR。本原理是DNA的半保留基复制。基本步骤：DNA模板的制备DNA模板的制备PCR反应PCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液产物的分离和提纯2.6.4选择性基因剔除和转基因鼠概念；基因剔除是用DNA重组技术剔除或破坏生物体基因组内某一特定基因，而后观察由此引起的表型改变。这样，可以了解该基因的生物学功能。