基因工程 第五章 基因转化

第五章目的基因导入受体细胞1第一节受体细胞受体细胞：可摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞，具有应用价值或理论价值。又称宿主细胞或寄主细胞，2成为受体细胞的条件：便于重组DNA导入。能使重组DNA分子稳定存在。便于重组体的筛选。遗传稳定性高，易于扩大培养。安全，无致病性，环保。蛋白酶缺失\含量低，利用表达蛋白积累。遗传密码的使用无明显偏倚性。有转译后加工机制（真核基因）。在理论和实践上有较高的价值。3一、原核生物细胞1、优势：大部分没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于DNA进入。没有核膜，染色体DNA没有固定结合蛋白质，这为外源DNA与染色体DNA重组减少了麻烦。基因组简单，无线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。原核生物多数为单细胞，容易获得一致性的实验材料，培养简单，繁殖迅速，周期短，重复快。42、缺点：无折叠系统，真核基因表达后，蛋白可能结构不正确无修饰系统，真核基因表达后，蛋白不同被修饰。E.coli.有蛋白酶，外源蛋白不稳定。53、E.coli.

优点：繁殖快，培养简单，代谢易于控制。缺点：有内毒素64、枯草杆菌具有大肠杆菌的所有优点。基因表达产物可分泌到培养基中，简化蛋白的提取和加工。真核生物的重组蛋白被分泌后便具有天然构象和生物活性。无内毒素，安全。7二、真菌细胞常用酵母菌可进行无性繁殖的单细胞生物。8优势：结构简单，基因表达调控机理清楚，遗传操作相对简单。有蛋白翻译后修饰加工系统。不产生毒素，安全。培养简单，利用大规模生产，成本低廉。能将表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工。9三、植物细胞具有细胞全能性，单细胞可培养成植株。

将细胞去壁后成为原生质体，可直接转入基因，也可利用基因枪或农杆菌介导转入外源基因。10四、动物细胞多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞常用受体细胞有小鼠L细胞、Hela细胞、中国仓鼠卵巢细胞等。11第二节重组DNA分子转入原核细胞重组DNA分子转化大肠杆菌转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。12一、Ca2+诱导大肠杆菌转化法1、感受态细胞的制备感受态细胞：是指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。CaCl2冷处理是制备E.coli.感受态细胞的最常用方法。132、过程：培养生命活动旺盛的菌体：进行菌种的活化，扩大培养，最适条件下培养至细胞密度达5×106~2×107

个/mL（A600为0.4），处于对数生长期沉淀菌体：取3-4mL菌液在冰水浴中预冷10min，然后在4℃下以适当速度离心沉淀菌体，5000g离心5min。14化合物处理：将沉淀的菌体悬浮在相当于原体积的含CaCl2无菌预冷缓冲溶液中（50-100mmol/LCaCl2

、10mmol/LTris-HCl,pH8.0）。置冰水浴15min后，4℃下放置12-14h，不要剧烈振荡。如此制备的感受态细胞在1-2d内能有效吸收DNA分子。152、DNA分子转化：0.2ml感受态细胞中加入0.1mlDNA，冰浴1h以上，期间轻摇几次。转移至42℃水浴2min。马上转到37℃水浴中温育5min，加入1ml不含选择药物的LB液体培养基。37℃振荡培养30-60min，然后铺板培养筛选。16二、转化率的计算及其影响因素1、转化率：DNA分子转化受体菌获得转化子的效率。转化子数与用于转化的DNA质量的比。转化子数与用于转化的细胞数的比。172、影响转化的因素：DNA越小越容易，亲和性越强越容易。不同受体菌细胞不同。不同转化方法不同，电穿孔法最高、Ca2+

转化法居中、三亲杂交法最低。18第三节重组子的筛选一、遗传表型直接筛选载体有标记基因，转化细胞出现特殊的表型特性。1、抗药性筛选载体有抗药性标记。转化受体在含有药物的培养基上正常生长，未转化的菌不能生长。192、显色互补筛选法载体上有LacZ基因，含有外源DNA的菌落为白色，没有的菌落为蓝色.20二、依据重组子结构特征筛选1、酶切鉴定从受体细胞中提取质粒DNA，酶切质粒DNA电泳检测酶切产物的大小。21质粒目的基因图酶切鉴定Marker空质粒酶切产物目的基因222、利用PCR方法筛选从受体细胞中提取质粒DNA利用载体或插入片段两端的已知序列合成引物进行PCR电泳检测PCR结果，判断否转化成功。23第四节核酸探针与分子杂交24探针(probe):用于检测样品中是否含有待测核酸的已知核酸片段。选择的原则：高度特异、来源方便。探针的来源：人工合成一、探针标记25探针的种类：A、基因组DNA探针：B、cDNA探针：无高重复序列、无内含子，不易获得。C、人工合成寡核苷酸探针（适于点突变）26探针标记：探针必须加以标记，用于检测。标记物:探针上可灵敏和特异检测到的标记,不影响其主要物化特性的物质。标记物的种类A、放射性核素B、非放射性标记物。27放射性同位素可示踪、不影响反应灵敏：可检测10-14～10-18g（光谱法只能到10-9g）。放射性的探测盖革计数器闪烁计数器28缺点一、核幅射对人体损伤；二、污染环境；三、探针使用时间短，常用的32P半衰期14.3天；四、依赖进口和价格昂贵。29标记方法缺口平移法。DNA聚合酶IdCTP32dGTP32dATP32dTTP32dCTP32dGTP32dATP32dTTP325`3`5`3`30非放射性标记物优点：无污染、可保存2年以上。缺点：灵敏度低。基本思想将可催化显色反应的酶与核酸的碱基连接，以示踪。31直接标记方法：化学法将酶结合在核酸上。缺点：酶是大分子，可能会因结构大而影响分子杂交。标记后酶活性可能会受到影响。

32间接酶标法常用方法：先将较小的分子标记在核酸上，再通过一个既能该小分子结合又与酶结合的蛋白质把酶间接地与核酸连接。小分子：生物素和半抗原(如地高辛)常用的酶：辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶和碱性磷酸酶.常用的小分子及酶的结合物：抗生物素抗体、抗半抗原抗体等。33DIG是植物毛地黄特有的固醇化合物。人工合成的核苷酸为dig-11-dUTP可通过缺口转移法、随机引物法、PCR法使dig-11-dUTP掺入DNA分子而合成探针。1.

DIG(地高辛)标记34特点：专一性强敏度高（0.1pg同源序列）杂交时探针浓度低（只要10-20ng/mL）过程：BCIP/NBT紫蓝色沉淀抗地高辛抗体碱性磷酸酶待测DNA变性为单链并转移到膜上变性后探针352.生物素标记生物素－亲合素系统（BAS)生物素与核酸相连，亲合素（结合有酶或荧光物质）可与生物素特异性的结合通过显色或检测荧光检测杂交信号。亲合素-酶OCOOH咪唑酮环噻吩环结合核酸36二.核酸分子杂交定义：利用已知的核酸序列(探针)探测样本中是否含有与其同源的核酸序列。

基本原理:

探针DNA与目标DNA分子的变性和复性37核酸分子杂交优点A、灵敏度高(可检测10g样品)B、特异性强(可鉴别20个碱基对左右的同源序列)操作步骤标记核酸，制备探针。待测核酸转移到合适的薄膜上。适当条件下使探针和待测核酸杂交。检测杂交信号。-12381.膜上印迹杂交

印迹：经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，通过毛细管作用或电导作用，被转移到滤膜上。

膜：硝酸纤维滤膜、尼龙膜等。39Southernblot：步骤：首先进行DNA电泳对电泳后DNA进行碱变性和中和处理。平铺在用电泳缓冲溶液饱和的两张滤纸上，在凝胶上覆盖一张硝酸纤维素滤膜，滤膜上压一叠干燥滤纸，滤纸上压一重物。由于干燥滤纸吸水，凝胶下缓冲溶液向上移动，凝胶中DNA便随之转移到纤维素膜上。取下膜，80度烘烤1-2h或紫外交联使DNA稳定结合在膜上，将膜放在已变性的探针溶液中进行核酸杂交。洗去没有杂交的探针显色40取下膜，80度烘烤1-2h或紫外交联使DNA稳定结合在膜上，将膜放在已变性的探针溶液中进行核酸杂交。洗去没有杂交的探针显色，41玻璃板干燥滤纸硝酸纤维素膜酶切电泳电泳后变性电泳缓冲液杂交显色缓冲液浸湿的滤纸42Southern印迹时间取决于NDA片段的大小1kb以下1小时15kb要18小时如大于15kb，可进行水解成小片段来提高转移效率但不能太小，否则会影响片段与膜的结合，并且产生较大的扩散作用。43电转移：转移电泳槽电场的作用使凝胶中的DNA转移到尼龙膜上。不能用硝酸纤维素膜44电转移的一般过程：首先进行DNA电泳对电泳后DNA进行碱变和中和处理。尼龙膜、滤纸及海绵也在缓冲溶液中充分浸泡。将凝胶与尼龙膜贴紧，外侧各贴一张滤纸。再其外是起保护作用的海绵。该体系夹在多孔的支持夹中固定在电泳槽内，浸泡在电泳缓冲溶液中。通电进行转移。取下膜，80度烘烤1-2h或紫外交联使DNA稳定结合在膜上，将膜放在已变性的探针溶液中进行核酸杂交。洗去没有杂交的探针显色，45凝胶支持夹海绵滤纸凝胶尼龙膜凝胶支持夹海绵滤纸46-+湿式电转移装置结构示意图47凝胶支持夹48硝酸纤维素滤膜（NC膜）的不足之处：NC膜依赖疏水性相互作用结合DNA，不牢固。质地较脆，易碎。NC膜对小分子DNA片段结合力不强。NC膜的结合依赖高盐浓度，不适宜于电转移。49

NorthernblotAlwine等1979年应用于RNA研究上。测定细胞的总RNA或mRNA。过程：将各种RNA进行琼脂糖凝胶电泳，然后将RNA从凝胶上转移到NC膜上，并与探针杂交。印迹过程类似于Southernblot。但有区别。50区别1：防止RNA形成高级结构，采用变性电泳。不能采用碱变性，常用的变性剂：甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺等。尿素和甲酰胺可引起琼脂糖固化只能用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。羟甲基汞毒性较大。乙二醛操作不如甲醛变性凝胶电泳简单。51区别2：电泳时要求低电压，3-4V/cm。电泳时缓冲溶液要不断循环，或30min换一次。区别3为防止RNA被降解要抑制Rnase的作用。52

Westernblot

1979年，Towbin等将blot技术扩展到蛋白质研究中。实际上是一种蛋白质转移电泳技术，可用于蛋白质一配基间缔合作用分析、酶的鉴定、单价抗体的亲和纯化、显示细胞与蛋白质之间的相互作用等。532、斑点或狭缝杂交经过变性的DNA或RNA点样于NC膜上，成为斑点或狭缝，然后进行核酸分子杂交。在同一张膜上可同时检测多个样品，但不能鉴定所测基因的分子量。优点：快速、节时、经济缺点：目的序列与非目的序列未分离，不能了解目的序列的长度。用途：基因分析、基因诊断、基因表达543、菌落杂交主要用于基因组（cDNA）文库的筛选基本程序：菌落或噬菌斑转印到NC膜上，溶菌、变性的DNA与滤膜原位结合；烤干合DNA固定在滤膜上与探针杂交；漂洗除去杂质探针，检测杂交信号根据杂交位置，对照原来的平板，从