色谱法分离手性化合物

手性化合物的色谱法分离周丽华中师范大学化学学院2011级摘要:本文综述了手性化合物的四种拆分方法一薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电色谱法(CEC)，及每种方法的作用机理关键字：手性化合物色谱法分离ChromatographicSeparationofChiralCompoundsAbstract:Thispaperreviewedfourmethodsforseparationofchiralcompounds，suchasTLC、GC、HPLC、CEC，introducedmechanismofeachmethod.Keyword:ChiralCompoundsChromatographicSeparation1.引言手性是用来表达化合物分子结构不对称性的术语，被认为是三维物体的一个基本属性。有很多化合物分子，构成它们的元素完全相同，但原子排列方式不同，彼此如同镜子内外世界的对应，也就是具有手性，它们就互称为“对映体”。在自然界中，手性现象无处不在。化合物分子含有某些不对称因素时，该化合物被称为手性化合物。随着人类在生物工程和生命科学上的发展，科学家己经认识到，手性化合物例如手性药物异构体尽管其物理和化学性质几乎完全相同，只有旋光性不同，但他们在生物体内的生理活性和药理作用却存在很大的差别。最经典的例子是thahdomide［l］，也叫反应停。其不同的构型却存在不同的生理效应：R构型具有良好的镇静作用而S构型却导致胎儿畸形。在农药方面，手性问题也受到广泛的关注。这主要是因为在外消旋体的农药中，其中一半可能是没有活性的，如果用于洒播在农田，既造成资源浪费，又污染环境。但随着对环境安全、高效、安全的要求，含单一对映体的手性农药将会不断的发展。鉴于有机分子的构型与其生物活性的的特殊关系，有必要对手性化合物的各个异构体分别进行考察，了解他们各自的生理活性，以便达到高效、安全、无污染的用药目的。为此，在制药工业中，必须对有效成分的对映体进行拆分，而不能将其作为单一药物出售。为此，建立高专属性，高灵敏度，高分离度的对映体拆分和测定方法具有重要的理论和实际意义，并且已成为当今科学领域中的研究前沿［2］。手性物质的拆分方法手性化合物的拆分，就是将一个外消旋体的两个对映体分开，使之成为纯净的状态［3］。外消旋体的拆分方法有很多种，早期用的大多是直接结晶拆分法:像机械拆分法、手性溶剂结晶法、接种结晶拆分法;随后又出现了分级结晶法、化学拆分、生物化学拆分、色谱拆分、萃取拆分以及手性膜拆分，他们都有各自的优点和缺陷。直接结晶法是应用最早的手性拆分技术，有多种体系已完成了工业化，但是其操作烦琐、流程过长、热量消耗大等缺陷直接制约了它的发展。分级结晶法是手性化合物的经典拆分方法，即通过与一光学纯试剂反应，生成非对映异构体，利用他们物理性质的差异达到分离的目的。但这种方法有很多缺点:光学纯试剂较昂贵、操作费时、后处理麻烦、局限性较大。化学拆分法是目前应用最广的拆分方法，从简单的化工原料到结构复杂的手性药物都有化学拆分法的报道，但是由于化学拆分试剂的应用，不但使这种方法成本高，对环境也有相当大的破坏作用，而且大部分化学拆分法过程冗长，产率通常不高，对映体光学纯度不高，适用的化合物类型不多，所以化学拆分法的应用范围在不断缩小［4］。生物化学拆分技术的优点是反应条件温和、收率高，并且一般不会造成环污染。但不足之处是可利用的酶制剂品种有限、酶易被破坏、容易失活等，限制了生物化学拆分的推广［5］。随着现代科学技术特别是仪器分析技术的发展，科学家们已经把注意力集中在手性化合物的色谱分离方法的研究上。不对称合成的发展也促进了手性色谱法的建立以测定合成的起始物、中间体和最终产物。色谱技术已成为当前手性分离的主要工具，手性分离也成为色谱科学的重要的研究对象。目前，常用的有薄层色谱(TLC),高效液相色谱(HPLC),气相色谱(GC)以及最新发展的高效毛细管电泳(HPCE)。色谱法分离手性化合物3・1薄层色谱法(TLC分离手性化合物TLC是最简便的色谱技术之一，其分离方式有手性试剂衍生化(CDR),手动相添加剂法(CMPA)和手性固定相法(CSP)等，用的较多的是CSP法。薄层色谱有操作简便、设备简单、分析速度快、结果直观、能快速更换流动相系统等特点,己在化学、化工、生化、医药卫生等各个领域广泛使用。董先明等利用薄层定性分析萘普生合成中的十种中间体监测反应程度的进行,分析效果较好［6］。尽管手性固定相价格、紫外背景、显色剂等原因使的目前能用于TLC的手体和能被TLC分离的手性化合物很少，但是，用薄层色谱进行样品分离后，可根据斑点在薄层上的位置、颜色深浅及大小与随行对照品比较，可简便、快速地近似估算样品中待测成分的含量，此谓薄层色谱半定量;也可在测出待测物质对照品在薄层上的检出灵敏度后，对样品中的该成分进行限量检查;间接定量（洗脱测定法）和直接定量（原位薄层扫描法）是薄层定量的两种较好的办法，已广泛应用于化合物的分析检测中［7］。可以预见，薄层色谱拆分法必将成为手性拆分的重要手段之一，在光学异构体的分离、分析及光学纯度的测定中发挥重要的作用。但可以预见它将会成为手性拆分的重要手段之一，在光学异构体的分离、分析及光学纯度的测定中发挥重要的作用。手性固定相薄层板常用的有:⑴纤维素板及预涂纤维素的薄层板，可用于拆分氨基酸及其衍生物，二肽等对映体。（2）浸渍手性选择剂的手性薄层板，主要是浸渍有a—氨基酸烷基衍生物的铜（II）复合物的薄层板。（3）分子印迹法是制备具有高选择性的合成高分子的方法。戎非［8］等分别以右旋扁桃酸、右旋邻氯扁桃酸和右旋对氯扁桃酸为模板，丙烯酞胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯为功能单体和交联剂合成分子印迹聚合物，并以此作为薄层色谱手性固定相。研究了模板分子消旋体在手性固定相上的分离情况。（4）将手性选择剂化学键合到载体上，进行对映体分离的化学键合手性薄层板主要有0—环糊精键合相薄层板、Prickle层板和萘乙基脲型薄层板，朱全红将0—CD键合相用苯基异氰酸及3,5一二硝基苯甲酰氯进行衍生化，制备了衍生化的0—CD键合相薄层板，在反相色谱条件下分离了氨基酸对映体及一些临床常用的手性药物对映体［9,10］。徐莉等用三—（3，5一二苯甲酰基）纤维素薄层色谱分离了6种手性对映体，取得了很好的分离效果［11］。3.2气相色谱法分离手性化合物手性气相色谱拆分法［12］是手性色谱学的重要分支，是以GC为基础，引入新的不对称中心，使对映体的性质产生差异，进而被拆分，包括分为间接拆分法和手性固定相拆分法。间接拆分法主要采用纯的手性衍生化试剂进行柱前衍生化，将被拆分的外消旋体衍生化成非对映体混合物进行拆分;手性固定相拆分法是利用分子间可形成氢键（如氨基酸衍生物）、包合物（如0—CD以及其衍生物、冠醚等）、配位键（如菇烯衍生化的金属共价化合物）的手性选择体制备固定相进行拆分。前两种固定相的拆分依据是手性分子与手性固定相形成非对映异构体，由于非对映异构体保留作用力不同，实现手性分离;后者是基于通过对映体分子中的活性部位（双键、和杂原子等），与金属配位化合物中的金属离子在色谱柱内快速建立可逆的配位平衡，由于金属配位化合物手性固定相中的手性配基在空间的有序排列，使对映体靠近金属离子的难易有别，在通过多次的配位与交换以后，就可以达到对映体的分离）。气相色谱手性固定相的发展过程经历了由作用力简单、单一手性中心的氢键型手性固定相向具有多种作用力、多手性中心复杂型手性固定相的发展过程，以环糊精衍生物类固定相［13］研究的最多。在实践中，常将上述三类固定相与聚硅氧烷固定液或毛细管壁进行交联。3.3高效液相色谱法分离手性化合物高效液相色谱手性固定相分离测定对映体速度快、柱效高、适用范围广（可以用于对热稳定性差和极性农药的分析）且分离能力强,HPLC比GC法更具有优越性。于是也就成了手性药物分离的首选技术平台之一。高效液相色谱较气相色谱应用广泛的原因,一是由于所有药物,当然包括手性药物,进入生物体都是经由生物体的体液来运输而进一步产生作用而决定的,所以几乎所有手性药物都能在高效液相色谱方法中找到适合于其本身特点的分离环境,从这一点说高效液相色谱优于气相色谱;二是高效液相色谱更易实现生物样品的在线预处理,能实现高度的自动化,现在已经发展成对映体分离比较迅速的领域之一。高效液相色谱直接拆分法包括手性固定相法和手性流动相添加剂法.手性固定相法是基于样品与键合到或涂敷于载体表面的手性选择剂间形成暂时的非对映体络合物的能量差或稳定性不同而达到手性分离;手性固定相法具有很强的特征性,一个固定相往往只能拆分一类或几类对映体。在手性固定相表面所形成的非对映体对,可根据其稳定常数不同而获得分离,分离的效率和洗脱顺序取决于复合物的相对强度。手性固定相的主要类型有蛋白质键合相、手性聚合物键合相、环糊精键合相和Pirkle型手性固定相等。对于体内手性药物的分析,单独采用手性固定相法往往不能排除内源性杂质的干扰,采用非手性柱-手性柱联用技术能克服此不足［14］。此法将非手性柱与手性柱以柱切换系统或直接相连系统连接起来,经预处理的样品进样后,首先随流动相载入非手性柱上,被测手性药物与干扰成分分离,接着被测手性药物进入手性柱,不受干扰地各自拆分。此法不仅能提高手性固定相法的分离能力,而且能延长手性柱的使用寿命。手性流动相添加剂法是通过对映体与添加剂流动相中的手性物质形成一对非对映体络合物，由于非对映体络合物的稳定性在流动相中溶剂化作用或络合物与固定相的键合等性质的差异而得到分离。手性流动相添加剂法包括手性包含复合法、手性配合交换法、手性离子对色谱法。在手性包含复合法中经常采用的添加剂是环糊精(CD)和手性冠醚。环糊精对疏水性和亲水性药物对映体都具有很强的包合作用。这种方法已用于分离氨基酸及其衍生物、巴比妥类、氯胺酮、苯妥英代谢物、美芬妥英及其代谢物、哌嗪类镇痛药、伪麻黄碱、去甲羟基安定等。采用的固定相常为ODS、CN、苯基、硅胶等。检测方法多用UV和电导检测法(ECD)［15］手性配合交换法将手性金属配合剂加入HPLC流动相中，形成三元非对映体配合物,此配合物与固定相发生立体选择性吸引或排斥反应,由于其结构稳定性和能量的差异，使对映体得以分离。手性离子对色谱法其原理是在HPLC流动相中加入反离子，使之与流动相中对映体生成非对映的离子对复合物，由于这些离子对复合物具有不同的稳定性和分配性质，在与固定相发生静电、疏水或氢键作用后，产生差速迁移而得以分离。此法可用于拆分氨基酸类、0-受体阻断剂、羧酸及磺酸类等化合物。3.4毛细管电色谱法分离手性化合物毛细管电色谱法(CEC)是在毛细管中填充或在毛细管壁涂布、键合色谱固定相，用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相的一种液相色谱法，是高效液相色谱法和高效毛细管电泳的有机结合。它不仅克服了液相色谱中压力流本身流速不均匀引起的峰扩展的问题，而且峰扩展只与溶质扩散系数有关，从而获得了接近于毛细管电泳水平的高柱效，同时还具备了液相色谱的选择性。在90年代后期该领域的研究热点已成为毛细管电泳和色谱，且在电色谱柱技术方面发展迅速，在生物医药与环境分析等领域具有广泛的应用前景。在CEC中，按照固定相的装填方式不同可以分为：填充毛细管电色谱(PCCEC)，开管毛细管电色谱(OTCEC)，整体式毛细管电色谱(MCEC)。PCCEC是将固定相装填在毛细管中，OTCEC是将固定相涂渍或键合在毛细管内壁上，MCEC是通过在毛细管内原位聚合或固化的方法，制成的具有多孔结构的整体式固定相［16］。CEC采用高压直流电源代替高压泵，用电渗流来驱动流动相，流速在管中不是呈抛物线轮廓，而是呈扁平的塞子流型，因而在毛细管中没有流速梯度，谱带展宽效应十分小，这是CEC比HPLC柱效高的根本原因。CEC没有背压问题,可以使用粒度更小的填料与更长的毛细管柱，具有更高的分辨率［1刀。在高pH值下,毛细管内壁硅醇基的电离度大,电渗流也大,可以解决中性化合物的分离问题,有利于与质谱仪联用；在低pH值条件下，如果选择合适的填料还可以将带电组分很好地分离。此外,在加电压的同时,又可附加一定的压力驱动流动相,这样既可避免分离过程中气泡的产生，提高稳定性，又可用压力来控制流速，缩短分析时间，实现梯度洗脱［18］。CEC的操作模式［19］可分为2种：①电渗流驱动的电色谱(EDCEC);②电渗流和压力双重驱动的电色谱(PDCEC)。由于后者使用高压泵作为流动相的驱动力之一，改善了分离的可控制能力，并减少气泡，从而增加了稳定性，同时还可以利用HPLC的进样和检测装置，所以其在线性和定量性上均优于CE,类似于HPLC［20］。随着填充柱技术的进步成熟，CEC作为一种新的高效微分离技术，将越来越多地应用于复杂的环境，药物供试品以及对应体的分离与定量上。CEC将以它高效、高选择性和微量快速的特点，成为农药残留分析研究的一个新方向。四种方法比较以上四种分离测定手性药物的方法由于其本身条件的限制，各有优缺点。TLC分离手性化合物操作简便、设备简单、分析速度快、结果直观、能快速更换流动相系统。但分离用量比较大，在分离的过程中损失量大。GC法分离效率高，较适于低沸点、易气化的手性药物拆分。但具备这种条件的药物很少，而且高温分析易使药物异构化。GC法用于对映体制备也比较困难。HPLC法是目前在药物对映体分离分析中使用最多、最广泛的方法。HPLC法不需高温，因此可减少药物对映体在分析过程中的分解和柱上异构化，而且被拆分的对映异构体易回收，并可进行制备和半制备，但由于其色谱柱短，柱效只能达到几千，因此某些药物对映体不能拆分。CEC法是近年来发展起来的一种高效、快速的新型分离手段，具有分离效率高的特点，同时也不需要手性分离柱，手性添加剂的用量也很少，适用范围也比较广。但其毛细管柱的柱容量小，对药物对映体的制备分离同样存在局限性。手性化合物的分离推动者药物行业、生物科学等方面的发展，从而，研究更加简便、高效率的拆分方法显得尤为重要。薄层色谱法、GC、HPLC、CEC用于拆分不同的手性化合物格局特点，拆分具体的手性化合物应根据具体的情况选择合适的拆分方法，达到高纯度的化合物。致谢感谢徐辉老师不辞辛苦给我们讲解有关现代分离技术方面的内容，使我们了解了先进的分离化合物方法，学到了分离化合物基本理论。参考文献[l]OekenfelsH.，KohierF.，MeiseW.DrugRes.1977，27:126肖畴吁，宋光泉.有机化学[M].中山大学出版社，1996:196.闫焕英，几种手性化合物的色谱分离方法研究.陕西师范大学硕士学位论文，2007.邓金根，迟永祥，朱懂，蒋耀忠.化学拆分的新方法研究明.合成化学，1999,7(4):340-345.SehrnidA.,DordiekJ.,KrenerA.，WubboltsM.，WitholtB.，Industrialbioeatalysistodayandtomormw[J].Nature，2001,409(6817):258-268.⑹董先明，胡艾希，范国枝•萘普生中间体的薄层色谱分析[J].湖南化工，29(6):1999于金刚，色谱法拆分手性药物的研究.中南大学硕士学位论文，2005。戎非，李萍，冯小刚，袁春伟，付德刚.分子印迹薄层色谱手性固定相的制备及其色谱性能[J].色谱，24(3):305—305.朱全红，熊波，邓芹英等.氨基酸对映体的手性薄层色谱[J].分析测试学报，2000，9(4):8-11.朱全红，马果东，邓芹英等•薄层色谱用苯基异氰酸酯衍生化的0—环糊精键合固定相的制备与应用[J].分析化学，2000,25(3):349-352.徐莉，刘岚，何建峰，马果东，邓芹英.用三一(3，5一二硝基苯甲酞基)纤维素薄层分离对映体[J].中山大学学报，2002，41(5):115-117.曾苏，章立，沈向忠等.光学异构体的气相色谱拆分法.色谱，1994,12(4):259-262CarloBieehi，AngelaD，Amoat，PatriziaRublolo.CyclodexrtinderivativesasEhiralseleetorsfordirectgaschromatographicseparationofenantiomersintheEssentia