临床微生物学和微生物学检验课件

第三章细菌感染病原性诊断疾病的种类不断发生变迁，传染病如鼠疫等已明显减少，相反，由条件致病菌引起的内源性感染却明显增多。同时，新的病原菌不断出现，原有的病原菌因变异、耐药等又重新流行。第三章细菌感染病原性诊断疾病的种类不断发生变迁，传染1目前，临床遇到主要是条件致病菌引起的感染。正常菌群与病原菌的致病性是相对的，因此，既不要轻易认为分离出的非致病菌是污染菌，也不要轻易认为所发现的细菌就是该感染的病原菌，必须结合临床进行进一步的诊断。目前，临床遇到主要是条件致病菌引起的感染。正常菌群与病2第一节临床感染性疾病

实验诊断要求

一、诊断的目的1.以疾病的病原学诊断为目的,只需鉴定到细菌的种。2.为提供治疗方案为目的，要进行临床标本的直接药物敏感试验。第一节临床感染性疾病

实验诊断要33.以流行病学研究为目的,要鉴定到型。4.以了解细菌与感染的关系为目的,应该做细致的鉴定。3.以流行病学研究为目的,要鉴定到型。4二、诊断试验的选择1.选择有鉴定价值的试验。2.选择简易、快速、方便的试验，达到目的即可。二、诊断试验的选择1.选择有鉴定价值的试验。53.综合考虑试验的敏感性和特异性。敏感性=阳性结果数/感染病人数，越高假阴性就越少。特异性=阴性结果数/未感染病人数，越高假阳性就越少。3.综合考虑试验的敏感性和特异性。6评价某诊断试验的资料整理表诊断试验病例非病例合计阳性a(真阳性)b(假阳性)a+b阴性c(假阴性)d(真阴性)c+d合计a+cb+dN评价某诊断试验的资料整理表诊断试验病例7灵敏度与特异度灵敏度是指在患者中用该试验检查得到阳性结果的百分比，它可衡量诊断试验正确地识别患某病的能力，亦称真阳性率.a灵敏度(真阳性率）=x100%a+c灵敏度与特异度灵敏度是指在患者中用该试验检查得到阳性结果的百8特异度特异度是指在无病者中用该试验检获得阴性结果的百分比。d特异度(真阴性率）=x100%b+d特异度特异度是指在无病者中用该试验检获得阴性结果的百分比。9灵敏度与特异度是评价一项诊断试验真实性的两个基本指标。从理论上讲，一项理想的诊断试验其灵敏度、特异度最好均为100%，即假阳性率与假阴性率均为零，无一漏诊与误诊，但事实上难以达到，通常患病者与非患病者的测定值有重叠现象，灵敏度升高，则特异度降低，反之成立。灵敏度与特异度是评价一项诊断试验真实性的两个基本指标。从理论10三、常用诊断流程1.双歧索引用于相互区别比较有特征的细菌，如革兰阴性杆菌初步分群；对于相互区别较难的细菌，鉴定项目较多,用起来不太方便。三、常用诊断流程1.双歧索引112.表解法：将各种细菌及其多种特性列成矩阵表格，使相互的区别点十分明显，便于分析比较。此法对于相互区别比较复杂的细菌，如肠杆菌科的初步分属。书上17页表2-12.表解法：123.数字编码鉴定法

将所得生化反应模式转化成数学模式，可把细菌生化反应结果转化成数字，经检索手册又可将转化成细菌名称。与电脑分析软件配套，形成了半自动或全自动细菌分析系统。数字编码鉴定已有商品成套供应，由于操作简单、鉴定方法易于掌握，被临床实验室广泛使用。3.数字编码鉴定法将所得生化反应模式转化成数学模式，13组别试验项目代码结果结果代码总值

1硫化氢苯丙氨酸葡萄酸盐421--+0011

2靛基质甲基红枸橼酸盐421-++0213

3尿素动力产气421+++421

74赖氨酸鸟氨酸棉子糖421++-420

6

5山梨醇侧金花醇木胶糖421++-420

6组别试验项目代码结果结果代码总值硫化氢4-14第二节临床标本的采集

与处理

一、标本采集的一般原则

1.病程早期、急性期或症状典型时，使用抗生素前。否则在培养时应加入拮抗剂。2.无菌采集：标本采集时应注意无菌操作，尽量避免杂菌污染。第二节临床标本的采集

与处理

一、标本153.根据目的菌的特性用不同的方法采集适量标本，采集量不应过少。4.注意在不同病程采集不同部位标本。5.采集标本时要防止传播和自身感染。3.根据目的菌的特性用不同的方法采集16二、标本的处理1.标本保存在4℃环境中，在2h之内送检。脑脊液则要在25℃保存，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h。对环境敏感的细菌应保温并立即送检。二、标本的处理1.标本保存在4℃环境中，在2h之内送检。172.标本中可能含有致病菌，必须注意安全防护。切勿污染环境。对于烈性传染病标本运送时更要由专人运送，严格按规定包装。2.标本中可能含有致病菌，必须注意安全183.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送。4、标本做好标记，详细填写化验单，保证各环节的准确无误

3.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽19人体受致病菌感染后，其免疫系统被刺激后发生免疫应答而产生特异性抗体。抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价（滴度）的升高。因此，用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中有无相应特异抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。一般采取病人的血清进行试验，故称为血清学诊断(serologicaldiagnosis)。第二节血清学诊断人体受致病菌感染后，其免疫系统被刺激后发生免疫应答而产生特异20血清学诊断试验最好取患者急性期和恢复期双份血清标本，当后者的抗体效价比前者升高大于等于4倍时方有意义。常用方法：直接凝集试验、乳胶凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、中和试验、ELISA。血清学诊断试验最好取患者急性期和恢复期双份血清标本，当后者的21第三节细菌形态学检查

一、显微镜

1.普通光学显微镜用油镜放大1000倍，一般细菌均能清楚看到。2.暗视野显微镜用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。3.相差显微镜主要用于检查不染色活细菌的形态及某些内部结构。第三节细菌形态学检查

一、显微镜224.荧光显微镜可看到发射荧光的细菌。还应用于免疫荧光技术中。5.电子显微镜有透射电子显微镜和扫描电子显微镜。前者适于观察细菌内部超微结构，后者适于对细菌表面结构及附件观察。4.荧光显微镜可看到发射荧光的细菌。还应用23二、不染色细菌标本检查

1.主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。常用压滴法和悬滴法。可对某些病原菌作出初步鉴定，如霍乱菌。2.螺旋体由于不易着色并有形态特征，故多用不染色标本作暗视野显微镜检查。二、不染色细菌标本检查1.主要用于检查生活状态下细菌的动力24三、细菌染色标本的检查细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类。三、细菌染色标本的检查细菌标本经染色后，除能清楚看25(一)常用染料

分为碱性和酸性两大类。此外，还有复合染料。1．碱性染料电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。由于细菌均带负电荷，易与染料结合而着色。常用的有碱性复红、结晶紫、美蓝等。(一)常用染料

分为碱性和酸性两大类。此外，还有复合262．酸性染料电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。细菌都带有负电荷故不易着色。通常用来染细胞浆，而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料有伊红、刚果红等。2．酸性染料电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被273．复合染料(中性染料)及荧光染料复合染料是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料(伊红美蓝)、姬姆萨染料(伊红天青)等；荧光染料如荧光标记的抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。这些染色常用于某些特殊的染色技术中。3．复合染料(中性染料)及荧光染料28（二）常用的染色方法分为两种：单染色法和复染色法。在细菌感染标本的检查中，临床上常用的复染色方法有革兰染色、抗酸染色和荧光染色。（二）常用的染色方法分为两种：单染色法和复染色法。291．革兰染色最经典、最常用的染色方法。在分离培养前都要进行革兰染色、镜检。通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类，可初步识别细菌，有助于进一步鉴定。1．革兰染色最经典、最常用的染色方法。在分离30结合细菌特殊结构及排列方式，对病原菌可进行鉴定，其结果为临床早期诊断及治疗提供了依据。革兰染色可为临床选择用药提供参考，帮助临床制订有针对性的治疗方案。因为G+菌和G-菌对抗生素敏感性不同，且致病物质及其作用机理也不同。结合细菌特殊结构及排列方式，对病31革兰染色（1）染色液：1）结晶紫溶液：结晶紫溶于95%乙醇中，然后与草酸铵溶液混合过滤制成；2）碘液（卢戈碘液）：碘化钾和碘熔于蒸馏水制成；3）95%乙醇；4）稀释石炭酸复红：取碱性复红酒精饱和溶液10ml与5%石炭酸溶液90ml混合制成石炭酸复红液，再将其用蒸馏水做10倍稀释即成。革兰染色（1）染色液：1）结晶紫溶液：结晶紫溶于95%乙醇中32革兰染色（2）方法：1）涂片固定；2）结晶紫初染1min，小水冲洗；3）碘液媒染1min，小水冲洗；3）95%乙醇脱色30秒，小水冲洗；4）稀释复红复染1min；吸干后镜检。（3）结果：革兰阳性菌：紫色；革兰阴性菌：红色；革兰染色（2）方法：1）涂片固定；2）结晶紫初染1min，小33革兰染色（4）原理：有以下几种学说：1）等电点学说：G+的等电点（PH2~3）比G-的等电点（PH4~5）低，在同一PH条件下，G+比G-所带电荷多，与带正电荷的碱性染料结合力牢固，不易脱色；2）化学学说：G+含有大量核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%乙醇脱色；而G-含此种物质少，故易被乙醇脱色；革兰染色（4）原理：有以下几种学说：1）等电点学说：G+的等34革兰染色（4）原理：3）细胞壁结构学说：G+细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚并具有三维空间结构，脂类含量低，乙醇不易透入，而且95%乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小、通透性降低，阻碍结晶紫与碘的复合物渗出；而G-细胞壁结构较疏松，肽聚糖层薄且无三维空间结构，含脂质量多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合物被溶出而脱色。目前认为，细胞壁结构与化学组成上的差异是染色反应不同的主要原因。革兰染色（4）原理：3）细胞壁结构学说：G+细胞壁结构较352．抗酸染色将细菌分为抗酸性和非抗酸性细菌两大类。因为大多数病原菌为非抗酸性，所以抗酸染色不作为常规检查项目。只用于结核病等检查。抗酸染色的鉴定结果。对疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。2．抗酸染色将细菌分为抗酸性和非抗酸性细菌两36抗酸染色的方法是细菌着色后不被盐酸乙醇脱色的染色方法。抗酸性染色反应细菌为抗酸细菌，分枝杆菌属的细菌为抗酸性细菌。这些细菌一般染色方法不易着色，常采用抗酸染色。先用较高浓度的石炭酸复红（5%）染色，加温促使菌体着色，再加3%盐酸乙醇脱色，最后用美蓝复染，未脱色者呈红色为抗酸性细菌，脱色经复染呈蓝色的细菌为非抗酸性细菌。抗酸染色的方法是细菌着色后不被盐酸乙醇脱色的染色方法。抗酸性373．荧光染色

敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。此外还有：鞭毛染色可观察有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中很重要。异染颗粒染色镜检异染颗粒，为临床早期诊断提供依据（白喉杆菌中的异染颗粒）。芽孢染色：可观察细菌芽孢的大小、位置，从而鉴定细菌荚膜染色3．荧光染色384、负染色法是指将标本的背景着色而细菌不着色的染色方法。4、负染色法是指将标本的背景着色而细菌不着色的染色方法。39第四节细菌分离培养与接种技术

绝大多数细菌在适宜的条件下可以生长，细菌感染性患者标本只有经过细菌的分离培养、鉴定和药物敏感试验，才可对感染性疾病进行病原学诊断并指导临床用药。因此，细菌培养对疾病的诊断、预防和治疗具有重要的作用。第四节细菌分离培养与接种技术

绝大多数细菌在适宜的条件40（一）细菌室的符合条件1．细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。且室内禁用风扇，避免细菌的播散。2．细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min。对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。（一）细菌室的符合条件1．细菌室必须安装严密的门窗，以防室413．室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。4．室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗1次。3．室内应备有消毒剂，用于试验中发生425．对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开井放在指定位置。同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。6．细菌室应有根据当地的气温特点可安装空调机，还需有消防设备。5．对接收的标本、无菌器具、用过的物43(二)无菌实验室1．无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。2．用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。(二)无菌实验室1．无菌室应完全封闭，人员出入应443．在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。4．无菌室内应仅限操作人员进人，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。3．在无菌室中一般仅限于分装无菌的455．条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。超净工作台应选择垂直气流通风方式。6．无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。5．条件有限的实验室，可用超净工作台46(三)基本设备和器具

用于细菌培养的温箱、C02培养箱、厌氧培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；(三)基本设备和器具

用于细菌培养的温箱、C02培养箱47用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。用于储存培养基、诊断用血清、抗生素48二、培养基

由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。适宜的培养基不仅可用于细菌的分离纯化培养、传代、菌种保存，还可用于研究细菌的生理、生化特性，是对病原菌分离鉴定的重要环节和必不可少的手段。二、培养基

由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖49

(一)培养基的组成成分1.营养物质:(1)蛋白胨；(2)肉浸液；(3)牛肉膏；(4)糖类；(5)血液；(6)无机盐类；(7)鸡蛋和动物血清；(8)生长因子：提供细菌生长繁殖所需要的氮源和碳源，还有生长因子。2.凝固物质制备固体培养基时，加入琼脂，琼脂是半乳糖胶，98℃以上时可溶于水，在45℃以下则凝固成凝胶状态。明胶、卵白蛋白、血清。3.抑制剂和指示剂用于选择、鉴定及判断结果。(一)培养基的组成成分1.营养物质:(1)蛋白胨；(2)50(二)培养基种类（按用途分类）

1．基础培养基含有生长所需的基本营养成分，称肉汤，用于增菌、检验，是制备其他培养基的基础成分。2．营养培养基在基础培养基中可加入葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和须要特殊生长因子的细菌生长。最常用的是血平板等。(二)培养基种类（按用途分类）

1．基础培养基含有生长所513．鉴别培养基利用细菌分解能力及代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，观察细菌生长过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的反应不同来鉴别细菌。如糖发酵培养基。3．鉴别培养基利用细菌分解能力及代524．选择培养基在培养基中加入抑制剂而抑制杂菌生长，有助于对所选择的细菌生长。5．特殊培养基包括厌氧培养基和细菌L型培养基等。4．选择培养基在培养基中加入抑制剂而53(二)培养基种类（按物理性状分类）1、液体培养基：主要用于增菌2、半固体培养基：主要用于观察细菌动力、保存菌种等。3、固体培养基：主要用于细菌分离培养。又分为平板、斜面、高层及高层斜面(二)培养基种类（按物理性状分类）1、液体培养基：主要用于增54(二)培养基种类（按组成成分分类）1、合成培养基：用各种营养物质组成的培养基，这种培养基成分都是已知的。其特点是成分精确、重复性强，价格较贵。用于实验室内做有关细菌营养、代谢、分类、鉴定、生物学特性测定、选育菌种、遗传分析等研究工作。2、半合成培养基：成分部分已知，微生物实验室用的大部分为此类培养基。如蛋白胨、牛肉膏、SS琼脂等。3、非合成培养基：如牛乳培养基、鸡蛋培养基、马铃薯培养基等，均属非合成性的培养基。(二)培养基种类（按组成成分分类）1、合成培养基：用各种营养55(三)分离培养基的选择

依据卫生部临床检验中心推荐，应备有如下分离培养基：1．血平板适于各类细菌的生长。2．巧克力血平板其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。(三)分离培养基的选择

依据卫生部临床检验中心推荐，应备563．中国蓝平板或伊红美蓝平板有选择地促进G_菌生长，是较好的弱选择性培养基。4．麦康凯平板具中等强度选择性，是非发酵菌鉴定的依据。5．SS琼脂有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。3．中国蓝平板或伊红美蓝平板有选择地促进G_菌生长，是较好576．碱性琼脂用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。7．血液增菌培养基用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。8．营养肉汤用于标本及各类细菌的增菌。6．碱性琼脂用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。58三、细菌接种与分离技术(一)平板划线分离法

1．连续划线分离法此法主要用于杂菌不多的标本。2．分区划线分离法本法适用于杂菌量较多的标本。获得单个菌落。三、细菌接种与分离技术(一)平板划线分离法59(二)斜面接种法该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。(三)液体接种法在试管内壁与液面交接处研磨，多用于一些液体生化试验管的接种。(四)穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。

(二)斜面接种法60(五)倾注平板法测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。(六)涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。(五)倾注平板法61

四、细菌培养方法

(一)需氧培养法最常用的培养方法，适于需氧和兼性厌氧菌的培养。

四、细菌培养方法

(一)需氧培养法62(二)二氧化碳培养法常以下列方法供给C02。1．二氧化碳培养箱是一台特制的培养箱，既能调节C02的含量，又能调节所需的温度。此法适于大型实验室应用。(二)二氧化碳培养法常以下列方法供给C02。632．烛缸法将已接种好的培养基置干燥器内，并放人点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂亡凡士林，盖上盖子，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥器内C02含量约占5％-10％，然后将干燥器放入35℃温箱内培养。

2．烛缸法643．化学法按每升容积加入碳酸氢钠0．4g和浓盐酸0．35ml的比例，分别置于容器内。将容器连同接种好的培养基都放人干燥器内，盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使浓盐酸与碳酸氢钠接触生成CO2。(三)厌氧培养法：厌氧罐、厌氧手套箱3．化学法65第五节细菌产物的检测及鉴定

一、细菌毒素的检测

(一)内毒素的测定主要用于诊断病人是否发生革兰阴性细菌感染。另外，还可用于检测注射用液和生物制品有无内毒素污染。第五节细菌产物的检测及鉴定一、细菌毒素的检测661．细菌内毒素的致热作用常以家兔作为实验动物，家兔正常体温38．5℃～40℃。抽取被检物注入家兔耳静脉，记录体温变化情况，分析实验结果。1．细菌内毒素的致热作用常以家兔作为实验动物，家兔正常体672．鲎（hou)试验鲎血液的有核变形细胞内含凝固酶原及凝固蛋白原，当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物(鲎试剂)接触时，可激活凝固酶原，使可溶性的凝固蛋白原变成凝胶状态的凝固蛋白，利用此种反应来检测内毒素。本试验对内毒素具有高度特异性，灵敏度高，可检查出0．005～0．0005μg／ml内毒素。且操作简便，速度快，在2h内即可得出结论。2．鲎（hou)试验鲎血液的有核变形细胞内含凝固酶原及凝68(二)外毒素的测定1．体内毒力试验细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物不产生中毒症状。(二)外毒素的测定1．体内毒力试验细菌外毒素对机体的毒性692．体外毒力试验外毒素抗原性强，可刺激机体产生相应的抗体。在体外以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌外毒素(抗原)进行抗原抗体反应，来检测外毒素，从而鉴定细菌是否产生该种毒素。如白喉棒状杆菌的Elek平板毒力测定。３．ELISA法如葡萄球菌肠毒素、肠产毒型大肠埃希菌LT及ST等的测定。2．体外毒力试验外毒素抗原性强，可刺激机体产生相应的抗体70二、细菌生化反应鉴定

不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。二、细菌生化反应鉴定不同细菌具有各自独特的酶系统，因而71(一)碳水化合物的代谢试验1．糖(醇、苷)类发酵试验(1)原理：由于细菌含有发酵不同糖类的酶，故分解糖的能力不同，终末产物亦不一致。有的能分解，有的仅能分解1-2种，还有的不能分解。有的产酸产气，有的仅产酸，故可利用鉴别细菌。(一)碳水化合物的代谢试验1．糖(醇、苷)类发72(2)培养基：在培养基中加入0.5％-1％的糖类(单糖、双糖或多糖)、醇类(甘露醇、肌醇等)、苷类(水杨苷、菊糖等)。可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。(3)方法：将细菌接种到糖发酵培养基中，培养数h小时至2w后，观察结果。(2)培养基：在培养基中加入0.5％-1％的糖类(单糖、双糖73(4)结果：能分解糖产酸时，呈酸性反应，若产气可出现气泡或培养基内有裂隙等现象;若不分解，除有细菌生长外，无任何变化。(5)应用：是鉴定细菌最主要的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。(4)结果：能分解糖产酸时，呈酸性反应，若产气可出现气泡或培742．氧化一发酵试验(O／F试验)(1)原理：细菌分解葡萄糖必须有分子氧参加的称为氧化型；进行无氧降解的称为发酵型；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。(2)培养基HL：Hugh-Leifson二氏培养基。2．氧化一发酵试验(O／F试验)(1)原理：细菌分解葡萄糖必75(3)方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，一支滴加无菌液体石蜡，高度不少于1cm。将培养基于35℃培养48h或更长。(4)结果：两支培养基均无变化为产碱型或小分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若不加石蜡的培养基产酸为氧化型。(5)应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别型或产碱型。也呵用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。(3)方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，一支滴加无菌763．β-半乳糖苷酶试验(1)原理：有的细菌可产生β·半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚·β-D-半乳糖苷(ONPG)，而生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下也可检出。3．β-半乳糖苷酶试验(1)原理：有的细菌可产生β·半乳糖77(2)试剂：O．75MONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸馏水中，在加入缓冲液(6．9gNaH2PO4溶于45ml蒸馏水中，用30％NaOH调控pH为7.0，再加水至50ml)5ml，置4℃冰箱中保存。(2)试剂：O．75MONPG溶液：取80mg溶于15ml78（3）方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5min，加入0.25mlONPG试剂，水浴20min~3小时观察结果。（3）方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理79(4)结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min内显色。(5)应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。(4)结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min804．七叶苷水解试验(1)原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。(2)培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。4．七叶苷水解试验(1)原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖81(3)方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。(4)结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。(5)应用：主要用于D群链球菌与其它链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。也可用于革兰阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。(3)方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。825．甲基红试验(1)原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，进一步分解，产生甲酸等，使pH降至4．5以下，加入甲基红试剂则呈红色为阳性。若分解葡萄糖产酸量少，则pH6．2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。5．甲基红试验(1)原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，进一83(2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。(3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养2-4d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。(4)结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。(2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。84(5)应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。此外肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属则为阴性。(5)应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，856．V-P试验

(1)原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，脱羧产生乙酰甲基甲醇，在碱性环境中被氧氧化为二乙酰，进而与胍基起作用生成红色化合物，则为V-P试验阳性。(2)培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。6．V-P试验

(1)原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，脱86(3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35℃培养48h后加入甲液(6％n·萘酚酒精溶液)和乙液(40％KOH溶液)，振摇。(4)结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于35℃4h后仍如故者即为阴性。(5)应用：常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。

(3)方法：将待检菌接种于上述培养基中，于35℃培养48h87细菌L型的检测一、细菌L型培养基：应该是高渗、高营养和低琼脂的培养基。二、细菌L型的检验程序及检查方法：（一）样本的采集：1、血液、骨髓液、胸腹水、尿液及其他穿刺液标本，用无菌手续采取，即刻送检2、粪便、阴道分泌物等易污染标本，可用生理盐水稀释2-4倍，调匀，然后用0.45微升的滤膜过滤，取其滤液接种培养基。3、若标本不能及时接种，应加入等量200g/L蔗糖无菌溶液或高渗液体培养基保存。细菌L型的检测一、细菌L型培养基：应该是高渗、高营养和低琼脂88(二)分离培养：1、血液、骨髓、穿刺液标本：应先接种高渗肉汤增菌培养，出现轻微浑浊或沉淀后，再取0.1ml分别接种于L平板和血平板上。置350C培养箱，培养1-7天，逐日观察菌落生长情况。2、胸腹水、脑脊液、尿液标本：除用上述方法外，也可直接取标本0.1ml，分别接种于L平板及血平板上，置350C培养箱，培养1-7天，逐日观察菌落生长情况。3、痰、脓等标本：直接取标本分别接种于L平板及血平板上，置350C培养箱，培养1-7天，逐日观察菌落生长情况。(二)分离培养：89（三）细菌L型的检验程序1、采样2、增菌3、革兰氏染色和分离4、鉴定（三）细菌L型的检验程序1、采样90(四）检查方法1、革兰氏染色：多为革兰氏阴性，形态不一的膨大杆状菌、长丝状、圆球状及巨球状等，具有明显多型性。2、细胞壁染色：细胞壁缺陷的细菌，燃料可渗入菌体内，使整个菌体浓染呈龙胆紫的颜色。有细胞壁的细菌，仅菌体周边染成紫色，内部无色。3、细菌L型的菌落特点油煎蛋样菌落（典型的L型菌落）：菌落较小，中心致密并深陷培养基中，透光度差；四周较薄，由透明颗粒组成。颗粒型菌落（G型菌落）：整个菌落全由透明颗粒组成，无致密的核心。丝状菌落（F型菌落）：菌落中心同L型菌落，但周边为透明丝状。革兰氏阳性菌一般多见L型或G型，而革兰氏阴性菌多为F型。(四）检查方法1、革兰氏染色：多为革兰氏阴性，形态不一的膨大914、鉴定要点1）形态染色特点2）生长情况3）返祖试验：只有完全符合上述三点，才能确定是细菌L型，否则会导致假阳性结果。对被检标本不做细菌L型分离培养，仅做直接涂片、染色镜检观察细菌L型的多变形态是不可靠的，不能作为诊断的依据。对分离培养的L型菌落应与支原体菌落相鉴别。4、鉴定要点1）形态染色特点92（五）临床意义细菌L型在机体内形成后，可在各种组织或细胞内潜伏存在，从血液、腹水、胸腔积液、胆汁、呼吸道等标本中均可分离出细菌的L型。（五）临床意义细菌L型在机体内形成后，可在各种组织或细胞内潜93动物实验一、用途1、分离和鉴定病原微生物2、测定细菌的毒力3、制备免疫血清4、建立致病动物模型5、动物的血液是配置细菌培养基必须的实验材料6、用于生物制品或一些药物的安全、毒性、疗效检验。动物实验一、用途94二、实验动物的分类（一）遗传学控制分类1、近交系动物（纯系动物）：兄妹或亲子繁殖20代以上，有固定的遗传学特征，实验重复性好2、突变系动物：正常染色体中某个基因发生了变异的具有某种遗传缺陷的动物3、杂交动物：随意交配而繁殖的动物，生命力强，繁殖生长快，但无固定的遗传学特征，实验重复性差二、实验动物的分类（一）遗传学控制分类95（二）微生物控制分类

1、无菌动物：剖腹取出后转入无菌、恒温、恒湿条件下，用无菌饲料饲养的动物。对实验结果不产生干扰2、悉生动物：是给无菌动物引入已知5-17种正常肠道菌群培育的动物。3、无特殊病原体动物（屏障系统动物）：饲养在严格的机械设备中和严密的操作下，经过科学测试，确无任何传染病的病原体存在，并能达到标准要求4、清洁动物或最低限度疾病动物：该种动物是饲养在设有清洁和不清洁走廊的设施中，其种群均来自剖腹产。此种动物在任何时候都不应该有明显的可见疾病和异常死亡。普通动物带有各种微生物，仅供教学实验和一般性实验用，不适用于研究性实验。（二）微生物控制分类

1、无菌动物：剖腹取出后转入无菌、恒温96实验动物的选择1、对测试菌敏感的动物2、根据实验目的、实验性质和要求不同选择不同品系的动物。3、动物的数量必须符合统计学上的要求4、应考虑动物的年龄、性别、体重、生理状态及健康情况等5、在满足实验条件的前提下，一般选用小动物。实验动物的选择1、对测试菌敏感的动物97动物的接种途径和方法1、皮下注射2、皮内注射3、肌肉注射4、腹腔注射5、静脉注射6、脑内注射动物的接种途径和方法1、皮下注射98接种后动物的观察与解剖1、实验动物常规观察2、实验动物解剖观察：皮肤、腹腔、胸腔、颅腔的观察。接种后动物的观察与解剖1、实验动物常规观察99动物采血法1、家兔采血：静脉、心脏2、绵羊静脉采血3、鸡心脏采血动物采血法1、家兔采血：静脉、心脏100第三章细菌感染病原性诊断疾病的种类不断发生变迁，传染病如鼠疫等已明显减少，相反，由条件致病菌引起的内源性感染却明显增多。同时，新的病原菌不断出现，原有的病原菌因变异、耐药等又重新流行。第三章细菌感染病原性诊断疾病的种类不断发生变迁，传染101目前，临床遇到主要是条件致病菌引起的感染。正常菌群与病原菌的致病性是相对的，因此，既不要轻易认为分离出的非致病菌是污染菌，也不要轻易认为所发现的细菌就是该感染的病原菌，必须结合临床进行进一步的诊断。目前，临床遇到主要是条件致病菌引起的感染。正常菌群与病102第一节临床感染性疾病

实验诊断要求

一、诊断的目的1.以疾病的病原学诊断为目的,只需鉴定到细菌的种。2.为提供治疗方案为目的，要进行临床标本的直接药物敏感试验。第一节临床感染性疾病

实验诊断要1033.以流行病学研究为目的,要鉴定到型。4.以了解细菌与感染的关系为目的,应该做细致的鉴定。3.以流行病学研究为目的,要鉴定到型。104二、诊断试验的选择1.选择有鉴定价值的试验。2.选择简易、快速、方便的试验，达到目的即可。二、诊断试验的选择1.选择有鉴定价值的试验。1053.综合考虑试验的敏感性和特异性。敏感性=阳性结果数/感染病人数，越高假阴性就越少。特异性=阴性结果数/未感染病人数，越高假阳性就越少。3.综合考虑试验的敏感性和特异性。106评价某诊断试验的资料整理表诊断试验病例非病例合计阳性a(真阳性)b(假阳性)a+b阴性c(假阴性)d(真阴性)c+d合计a+cb+dN评价某诊断试验的资料整理表诊断试验病例107灵敏度与特异度灵敏度是指在患者中用该试验检查得到阳性结果的百分比，它可衡量诊断试验正确地识别患某病的能力，亦称真阳性率.a灵敏度(真阳性率）=x100%a+c灵敏度与特异度灵敏度是指在患者中用该试验检查得到阳性结果的百108特异度特异度是指在无病者中用该试验检获得阴性结果的百分比。d特异度(真阴性率）=x100%b+d特异度特异度是指在无病者中用该试验检获得阴性结果的百分比。109灵敏度与特异度是评价一项诊断试验真实性的两个基本指标。从理论上讲，一项理想的诊断试验其灵敏度、特异度最好均为100%，即假阳性率与假阴性率均为零，无一漏诊与误诊，但事实上难以达到，通常患病者与非患病者的测定值有重叠现象，灵敏度升高，则特异度降低，反之成立。灵敏度与特异度是评价一项诊断试验真实性的两个基本指标。从理论110三、常用诊断流程1.双歧索引用于相互区别比较有特征的细菌，如革兰阴性杆菌初步分群；对于相互区别较难的细菌，鉴定项目较多,用起来不太方便。三、常用诊断流程1.双歧索引1112.表解法：将各种细菌及其多种特性列成矩阵表格，使相互的区别点十分明显，便于分析比较。此法对于相互区别比较复杂的细菌，如肠杆菌科的初步分属。书上17页表2-12.表解法：1123.数字编码鉴定法

将所得生化反应模式转化成数学模式，可把细菌生化反应结果转化成数字，经检索手册又可将转化成细菌名称。与电脑分析软件配套，形成了半自动或全自动细菌分析系统。数字编码鉴定已有商品成套供应，由于操作简单、鉴定方法易于掌握，被临床实验室广泛使用。3.数字编码鉴定法将所得生化反应模式转化成数学模式，113组别试验项目代码结果结果代码总值

1硫化氢苯丙氨酸葡萄酸盐421--+0011

2靛基质甲基红枸橼酸盐421-++0213

3尿素动力产气421+++421

74赖氨酸鸟氨酸棉子糖421++-420

6

5山梨醇侧金花醇木胶糖421++-420

6组别试验项目代码结果结果代码总值硫化氢4-114第二节临床标本的采集

与处理

一、标本采集的一般原则

1.病程早期、急性期或症状典型时，使用抗生素前。否则在培养时应加入拮抗剂。2.无菌采集：标本采集时应注意无菌操作，尽量避免杂菌污染。第二节临床标本的采集

与处理

一、标本1153.根据目的菌的特性用不同的方法采集适量标本，采集量不应过少。4.注意在不同病程采集不同部位标本。5.采集标本时要防止传播和自身感染。3.根据目的菌的特性用不同的方法采集116二、标本的处理1.标本保存在4℃环境中，在2h之内送检。脑脊液则要在25℃保存，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h。对环境敏感的细菌应保温并立即送检。二、标本的处理1.标本保存在4℃环境中，在2h之内送检。1172.标本中可能含有致病菌，必须注意安全防护。切勿污染环境。对于烈性传染病标本运送时更要由专人运送，严格按规定包装。2.标本中可能含有致病菌，必须注意安全1183.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送。4、标本做好标记，详细填写化验单，保证各环节的准确无误

3.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽119人体受致病菌感染后，其免疫系统被刺激后发生免疫应答而产生特异性抗体。抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价（滴度）的升高。因此，用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中有无相应特异抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。一般采取病人的血清进行试验，故称为血清学诊断(serologicaldiagnosis)。第二节血清学诊断人体受致病菌感染后，其免疫系统被刺激后发生免疫应答而产生特异120血清学诊断试验最好取患者急性期和恢复期双份血清标本，当后者的抗体效价比前者升高大于等于4倍时方有意义。常用方法：直接凝集试验、乳胶凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、中和试验、ELISA。血清学诊断试验最好取患者急性期和恢复期双份血清标本，当后者的121第三节细菌形态学检查

一、显微镜

1.普通光学显微镜用油镜放大1000倍，一般细菌均能清楚看到。2.暗视野显微镜用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。3.相差显微镜主要用于检查不染色活细菌的形态及某些内部结构。第三节细菌形态学检查

一、显微镜1224.荧光显微镜可看到发射荧光的细菌。还应用于免疫荧光技术中。5.电子显微镜有透射电子显微镜和扫描电子显微镜。前者适于观察细菌内部超微结构，后者适于对细菌表面结构及附件观察。4.荧光显微镜可看到发射荧光的细菌。还应用123二、不染色细菌标本检查

1.主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。常用压滴法和悬滴法。可对某些病原菌作出初步鉴定，如霍乱菌。2.螺旋体由于不易着色并有形态特征，故多用不染色标本作暗视野显微镜检查。二、不染色细菌标本检查1.主要用于检查生活状态下细菌的动力124三、细菌染色标本的检查细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类。三、细菌染色标本的检查细菌标本经染色后，除能清楚看125(一)常用染料

分为碱性和酸性两大类。此外，还有复合染料。1．碱性染料电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。由于细菌均带负电荷，易与染料结合而着色。常用的有碱性复红、结晶紫、美蓝等。(一)常用染料

分为碱性和酸性两大类。此外，还有复合1262．酸性染料电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。细菌都带有负电荷故不易着色。通常用来染细胞浆，而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料有伊红、刚果红等。2．酸性染料电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被1273．复合染料(中性染料)及荧光染料复合染料是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料(伊红美蓝)、姬姆萨染料(伊红天青)等；荧光染料如荧光标记的抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。这些染色常用于某些特殊的染色技术中。3．复合染料(中性染料)及荧光染料128（二）常用的染色方法分为两种：单染色法和复染色法。在细菌感染标本的检查中，临床上常用的复染色方法有革兰染色、抗酸染色和荧光染色。（二）常用的染色方法分为两种：单染色法和复染色法。1291．革兰染色最经典、最常用的染色方法。在分离培养前都要进行革兰染色、镜检。通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类，可初步识别细菌，有助于进一步鉴定。1．革兰染色最经典、最常用的染色方法。在分离130结合细菌特殊结构及排列方式，对病原菌可进行鉴定，其结果为临床早期诊断及治疗提供了依据。革兰染色可为临床选择用药提供参考，帮助临床制订有针对性的治疗方案。因为G+菌和G-菌对抗生素敏感性不同，且致病物质及其作用机理也不同。结合细菌特殊结构及排列方式，对病131革兰染色（1）染色液：1）结晶紫溶液：结晶紫溶于95%乙醇中，然后与草酸铵溶液混合过滤制成；2）碘液（卢戈碘液）：碘化钾和碘熔于蒸馏水制成；3）95%乙醇；4）稀释石炭酸复红：取碱性复红酒精饱和溶液10ml与5%石炭酸溶液90ml混合制成石炭酸复红液，再将其用蒸馏水做10倍稀释即成。革兰染色（1）染色液：1）结晶紫溶液：结晶紫溶于95%乙醇中132革兰染色（2）方法：1）涂片固定；2）结晶紫初染1min，小水冲洗；3）碘液媒染1min，小水冲洗；3）95%乙醇脱色30秒，小水冲洗；4）稀释复红复染1min；吸干后镜检。（3）结果：革兰阳性菌：紫色；革兰阴性菌：红色；革兰染色（2）方法：1）涂片固定；2）结晶紫初染1min，小133革兰染色（4）原理：有以下几种学说：1）等电点学说：G+的等电点（PH2~3）比G-的等电点（PH4~5）低，在同一PH条件下，G+比G-所带电荷多，与带正电荷的碱性染料结合力牢固，不易脱色；2）化学学说：G+含有大量核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%乙醇脱色；而G-含此种物质少，故易被乙醇脱色；革兰染色（4）原理：有以下几种学说：1）等电点学说：G+的等134革兰染色（4）原理：3）细胞壁结构学说：G+细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚并具有三维空间结构，脂类含量低，乙醇不易透入，而且95%乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小、通透性降低，阻碍结晶紫与碘的复合物渗出；而G-细胞壁结构较疏松，肽聚糖层薄且无三维空间结构，含脂质量多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合物被溶出而脱色。目前认为，细胞壁结构与化学组成上的差异是染色反应不同的主要原因。革兰染色（4）原理：3）细胞壁结构学说：G+细胞壁结构较1352．抗酸染色将细菌分为抗酸性和非抗酸性细菌两大类。因为大多数病原菌为非抗酸性，所以抗酸染色不作为常规检查项目。只用于结核病等检查。抗酸染色的鉴定结果。对疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。2．抗酸染色将细菌分为抗酸性和非抗酸性细菌两136抗酸染色的方法是细菌着色后不被盐酸乙醇脱色的染色方法。抗酸性染色反应细菌为抗酸细菌，分枝杆菌属的细菌为抗酸性细菌。这些细菌一般染色方法不易着色，常采用抗酸染色。先用较高浓度的石炭酸复红（5%）染色，加温促使菌体着色，再加3%盐酸乙醇脱色，最后用美蓝复染，未脱色者呈红色为抗酸性细菌，脱色经复染呈蓝色的细菌为非抗酸性细菌。抗酸染色的方法是细菌着色后不被盐酸乙醇脱色的染色方法。抗酸性1373．荧光染色

敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。此外还有：鞭毛染色可观察有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中很重要。异染颗粒染色镜检异染颗粒，为临床早期诊断提供依据（白喉杆菌中的异染颗粒）。芽孢染色：可观察细菌芽孢的大小、位置，从而鉴定细菌荚膜染色3．荧光染色1384、负染色法是指将标本的背景着色而细菌不着色的染色方法。4、负染色法是指将标本的背景着色而细菌不着色的染色方法。139第四节细菌分离培养与接种技术

绝大多数细菌在适宜的条件下可以生长，细菌感染性患者标本只有经过细菌的分离培养、鉴定和药物敏感试验，才可对感染性疾病进行病原学诊断并指导临床用药。因此，细菌培养对疾病的诊断、预防和治疗具有重要的作用。第四节细菌分离培养与接种技术

绝大多数细菌在适宜的条件140（一）细菌室的符合条件1．细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。且室内禁用风扇，避免细菌的播散。2．细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min。对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。（一）细菌室的符合条件1．细菌室必须安装严密的门窗，以防室1413．室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。4．室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗1次。3．室内应备有消毒剂，用于试验中发生1425．对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开井放在指定位置。同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。6．细菌室应有根据当地的气温特点可安装空调机，还需有消防设备。5．对接收的标本、无菌器具、用过的物143(二)无菌实验室1．无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。2．用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。(二)无菌实验室1．无菌室应完全封闭，人员出入应1443．在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。4．无菌室内应仅限操作人员进人，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。3．在无菌室中一般仅限于分装无菌的1455．条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。超净工作台应选择垂直气流通风方式。6．无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。5．条件有限的实验室，可用超净工作台146(三)基本设备和器具

用于细菌培养的温箱、C02培养箱、厌氧培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；(三)基本设备和器具

用于细菌培养的温箱、C02培养箱147用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。用于储存培养基、诊断用血清、抗生素148二、培养基

由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。适宜的培养基不仅可用于细菌的分离纯化培养、传代、菌种保存，还可用于研究细菌的生理、生化特性，是对病原菌分离鉴定的重要环节和必不可少的手段。二、培养基

由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖149

(一)培养基的组成成分1.营养物质:(1)蛋白胨；(2)肉浸液；(3)牛肉膏；(4)糖类；(5)血液；(6)无机盐类；(7)鸡蛋和动物血清；(8)生长因子：提供细菌生长繁殖所需要的氮源和碳源，还有生长因子。2.凝固物质制备固体培养基时，加入琼脂，琼脂是半乳糖胶，98℃以上时可溶于水，在45℃以下则凝固成凝胶状态。明胶、卵白蛋白、血清。3.抑制剂和指示剂用于选择、鉴定及判断结果。(一)培养基的组成成分1.营养物质:(1)蛋白胨；(2)150(二)培养基种类（按用途分类）

1．基础培养基含有生长所需的基本营养成分，称肉汤，用于增菌、检验，是制备其他培养基的基础成分。2．营养培养基在基础培养基中可加入葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和须要特殊生长因子的细菌生长。最常用的是血平板等。(二)培养基种类（按用途分类）

1．基础培养基含有生长所1513．鉴别培养基利用细菌分解能力及代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，观察细菌生长过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的反应不同来鉴别细菌。如糖发酵培养基。3．鉴别培养基利用细菌分解能力及代1524．选择培养基在培养基中加入抑制剂而抑制杂菌生长，有助于对所选择的细菌生长。5．特殊培养基包括厌氧培养基和细菌L型培养基等。4．选择培养基在培养基中加入抑制剂而153(二)培养基种类（按物理性状分类）1、液体培养基：主要用于增菌2、半固体培养基：主要用于观察细菌动力、保存菌种等。3、固体培养基：主要用于细菌分离培养。又分为平板、斜面、高层及高层斜面(二)培养基种类（按物理性状分类）1、液体培养基：主要用于增154(二)培养基种类（按组成成分分类）1、合成培养基：用各种营养物质组成的培养基，这种培养基成分都是已知的。其特点是成分精确、重复性强，价格较贵。用于实验室内做有关细菌营养、代谢、分类、鉴定、生物学特性测定、选育菌种、遗传分析等研究工作。2、半合成培养基：成分部分已知，微生物实验室用的大部分为此类培养基。如蛋白胨、牛肉膏、SS琼脂等。3、非合成培养基：如牛乳培养基、鸡蛋培养基、马铃薯培养基等，均属非合成性的培养基。(二)培养基种类（按组成成分分类）1、合成培养基：用各种营养155(三)分离培养基的选择

依据卫生部临床检验中心推荐，应备有如下分离培养基：1．血平板适于各类细菌的生长。2．巧克力血平板其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。(三)分离培养基的选择

依据卫生部临床检验中心推荐，应备1563．中国蓝平板或伊红美蓝平板有选择地促进G_菌生长，是较好的弱选择性培养基。4．麦康凯平板具中等强度选择性，是非发酵菌鉴定的依据。5．SS琼脂有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。3．中国蓝平板或伊红美蓝平板有选择地促进G_菌生长，是较好1576．碱性琼脂用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。7．血液增菌培养基用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。8．营养肉汤用于标本及各类细菌的增菌。6．碱性琼脂用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。158三、细菌接种与分离技术(一)平板划线分离法

1．连续划线分离法此法主要用于杂菌不多的标本。2．分区划线分离法本法适用于杂菌量较多的标本。获得单个菌落。三、细菌接种与分离技术(一)平板划线分离法159(二)斜面接种法该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。(三)液体接种法在试管内壁与液面交接处研磨，多用于一些液体生化试验管的接种。(四)穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。

(二)斜面接种法160(五)倾注平板法测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。(六)涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。(五)倾注平板法161

四、细菌培养方法

(一)需氧培养法最常用的培养方法，适于需氧和兼性厌氧菌的培养。

四、细菌培养方法

(一)需氧培养法162(二)二氧化碳培养法常以下列方法供给C02。1．二氧化碳培养箱是一台特制的培养箱，既能调节C02的含量，又能调节所需的温度。此法适于大型实验室应用。(二)二氧化碳培养法常以下列方法供给C02。1632．烛缸法将已接种好的培养基置干燥器内，并放人点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂亡凡士林，盖上盖子，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥器内C02含量约占5％-10％，然后将干燥器放入35℃温箱内培养。

2．烛缸法1643．化学法按每升容积加入碳酸氢钠0．4g和浓盐酸0．35ml的比例，分别置于容器内。将容器连同接种好的培养基都放人干燥器内，盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使浓盐酸与碳酸氢钠接触生成CO2。(三)厌氧培养法：厌氧罐、厌氧手套箱3．化学法165第五节细菌产物的检测及鉴定

一、细菌毒素的检测

(一)内毒素的测定主要用于诊断病人是否发生革兰阴性细菌感染。另外，还可用于检测注射用液和生物制品有无内毒素污染。第五节细菌产物的检测及鉴定一、细菌毒素的检测1661．细菌内毒素的致热作用常以家兔作为实验动物，家兔正常体温38．5℃～40℃。抽取被检物注入家兔耳静脉，记录体温变化情况，分析实验结果。1．细菌内毒素的致热作用常以家兔作为实验动物，家兔正常体1672．鲎（hou)试验鲎血液的有核变形细胞内含凝固酶原及凝固蛋白原，当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物(鲎试剂)接触时，可激活凝固酶原，使可溶性的凝固蛋白原变成凝胶状态的凝固蛋白，利用此种反应来检测内毒素。本试验对内毒素具有高度特异性，灵敏度高，可检查出0．005～0．0005μg／ml内毒素。且操作简便，速度快，在2h内即可得出结论。2．鲎（hou)试验鲎血液的有核变形细胞内含凝固酶原及凝168(二)外毒素的测定1．体内毒力试验细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物不产生中毒症状。(二)外毒素的测定1．体内毒力试验细菌外毒素对机体的毒性1692．体外毒力试验外毒素抗原性强，可刺激机体产生相应的抗体。在体外以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌外毒素(抗原)进行抗原抗体反应，来检测外毒素，从而鉴定细菌是否产生该种毒素。如白喉棒状杆菌的Elek平板毒力测定。３．ELISA法如葡萄球菌肠毒素、肠产毒型大肠埃希菌LT及ST等的测定。2．体外毒力试验外毒素抗原性强，可刺激机体产生相应的抗体170二、细菌生化反应鉴定

不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。二、细菌生化反应鉴定不同细菌具有各自独特的酶系统，因而171(一)碳水化合物的代谢试验1．糖(醇、苷)类发酵试验(1)原理：由于细菌含有发酵不同糖类的酶，故分解糖的能力不同，终末产物亦不一致。有的能分解，有的仅能分解1-2种，还有的不能分解。有的产酸产气，有的仅产酸，故可利用鉴别细菌。(一)碳水化合物的代谢试验1．糖(醇、苷)类发172(2)培养基：在培养基中加入0.5％-1％的糖类(单糖、双糖或多糖)、醇类(甘露醇、肌醇等)、苷类(水杨苷、菊糖等)。可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。(3)方法：将细菌接种到糖发酵培养基中，培养数h小时至2w后，观察结果。(2)培养基：在培养基中加入0.5％-1％的糖类(单糖、双糖173(4)结果：能分解糖产酸时，呈酸性反应，若产气可出现气泡或培养基内有裂隙等现象;若不分解，除有细菌生长外，无任何变化。(5)应用：是鉴定细菌最主要的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。(4)结果：能分解糖产酸时，呈酸性反应，若产气可出现气泡或培1742．氧化一发酵试验(O／F试验)(1)原理：细菌分解葡萄糖必须有分子氧参加的称为氧化型；进行无氧降解的称为发酵型；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。利用此试验可区分细菌的代谢类型。(2)培养基HL：Hugh-Leifson二氏培养基。2．氧化一发酵试验(O／F试验)(1)原理：细菌分解葡萄糖必175(3)方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，一支滴加无菌液体石蜡，高度不少于1cm。将培养基于35℃培养48h或更长。(4)结果：两支培养基均无变化为产碱型或小分解糖型；两支培养基均产酸为发酵型；若不加石蜡的培养基产酸为氧化型。(5)应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别型或产碱型。也呵用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。(3)方法：将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基，一支滴加无菌1763．β-半乳糖苷酶试验(1)原理：有的细菌可产生β·半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚·β-D-半乳糖苷(ONPG)，而生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下也可检出。3．β-半乳糖苷酶试验(1)原理：有的细菌可产生β·半乳糖177(2)试剂：O．75MONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸馏水中，在加入缓冲液(6．9gNaH2PO4溶于45ml蒸馏水中，用30％NaOH调控pH为7.0，再加水至50ml)5ml，置4℃冰箱中保存。(2)试剂：O．75MONPG溶液：取80mg溶于15ml178（3）方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5min，加入0.25mlONPG试剂，水浴20min~3小时观察结果。（3）方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，于0.25ml无菌生理179(4)结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min内显色。(5)应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。(4)结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30min1804．七叶苷水解试验(1)原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。(2)培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。4．