动物细胞融合与单克隆抗体

专题2 细胞工程2.2..2 动物细胞融合与单克隆抗体教材预览导言我们知道，运用植物体细胞杂家技术，可以跨越植物种属间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型.那么，能不能采用类似的方法，让不同动物的体细胞进行杂交呢？1DQxtBWmHhb5E2RGbCAP1、动物细胞融合<1）概念：指 ______________或______________动物细胞结合形成一个细胞的过程，也称为细胞杂交.1DQxtBWmHhp1EanqFDPw<2）结果：形成 ____________________细胞.<3）过程：不同_______________的两个细胞_________________________ 细胞.1DQxtBWmHhDXDiTa9E3d<4）意义：克服了 ___________杂交的不亲和性，成为研究 ________、____________ 、1DQxtBWmHhRTCrpUDGiT肿瘤和生物_____________________培育的重要手段 .思考：1、动物细胞的融合最有价值的应用是什么 ?细胞融合完成的标志是什么？提示：远缘杂交；细胞核融合成一个核2、若a和b两种细胞融合，则融合的方式有三种 ___________、___________ 和_____________________. 满 足 要 求的 为 ______________ ，所 以 融合 后 要 筛选.1DQxtBWmHh5PCzVD7HxA提示：a-ab-ba-b2、单克隆抗体<1）抗体：由淋巴细胞 <浆细胞）产生，成分为球蛋白，具有 _________________.从血清中分离出来的抗体产量低、纯度低、特异性差 .1DQxtBWmHhjLBHrnAILg<2）单克隆抗体的制备a.过程_______________________________________________________________1DQxtBWmHhxHAQX74J0Xb.杂交瘤细胞的特点：既能大量__________________，又能产生_____________________.1DQxtBWmHhLDAYtRyKfEc.单克隆抗体的特点：_________________强、_______________高、产量大.1DQxtBWmHhZzz6ZB2Ltk思考：①单克隆抗体的确切定义是什么？提示：特异性强，灵敏度高的单一抗体②制备单克隆抗体时，为什么要选用 B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞？在融合的过程中你可以找出几种类型的细胞？ 1DQxtBWmHhdvzfvkwMI1提示：b-b 骨-骨b-骨1/9问题探讨制备单克隆抗体的过程有两次筛选，两次筛选的目的是什么？第一次筛选是 ___________________________________第二次筛选是 ____________________________________提示：第一次筛选出杂交瘤细胞；第二次筛选出能够产生单一抗体的杂交瘤细胞 .本节聚焦运用细胞的基础知识，深刻理解这两项技术的原理，并理解这些技术的新进展.结合免疫原理、融合原理以及动物细胞培养，全面理解单克隆抗体的制备过程，利用动物细胞培养技术对杂交瘤细胞进行体外培养和体内培养可生产出专一性强，灵敏性高的抗体.1DQxtBWmHhrqyn14ZNXI学习过程我们知道，运用植物体细胞杂家技术，可以跨越植物种属间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型.那么，能不能采用类似的方法，让不同动物的体细胞进行杂交呢？1DQxtBWmHhEmxvxOtOco一、动物细胞融合概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程.原理：细胞膜的流动性1、动物细胞融合动物细胞融合的方法：PEG、灭活病毒、电激过程：诱导动物细胞融合意义：突破了有性杂交方法的局限2、动物细胞融合与植物体细胞杂交的异同比较工程细胞融合的原理细胞融合的方法诱导手段用途植物体细胞杂交细胞膜的流动性用纤维素酶、果离心、电刺激、克服远源杂交不胶酶去除细胞壁振动、聚乙二醇亲和，获得杂种后诱导原生质体<PEG）诱导植株融合动物细胞融合细胞膜的流动性用胰蛋白酶使细除应用植物细胞制备单克隆抗体胞分散后诱导细杂交手段外，还胞融合有用灭活病毒诱导分析讨论1、诱导动物细胞融合的常用方法有哪些？提示：PEG、灭活病毒、电激2、动物细胞融合的意义：提示：这一技术使远缘杂交成为可能，已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段.例题： 动物细胞融合的目的中最重要的是 ( >A.克服远源杂交不亲和 B. 制备单克隆抗体C.培育新物种 D. 生产杂种细胞解读：考查动物细胞融合的目的 .动物细胞融合就是指不同动物细胞的原生质融合，形成杂2/9种细 胞的 过程. 动 物 细胞 融合技 术 最重要 的用 途是制 备 单克 隆 抗体.(>1DQxtBWmHhSixE2yXPq5答案：B例题： 能使动物细胞融合的特有的诱导因子是 ( >A.离心 B. 灭活的病毒 1DQxtBWmHh6ewMyirQFLC.电刺激不 D. 振动解读：在体外培养条件下，动物细胞会自发融合，但是频率很低 .因此，一般都需要添加具有诱导细胞融合效应的生物药剂或化学药剂，或者采用电融合技术，人为地促进细胞融合 .常用的动物细胞融合的诱导因子是聚乙二醇和灭活的病毒 .其中聚乙二醇既可用于促进植物原生质体融合，又可用于促进动物原生质体融合 .而灭活的病毒只能用于促进动物细胞的融合，如灭活的仙台病毒是最常用的诱导因子，其诱导原理是因为病毒具有侵染细胞的能力，优点是融合率高，对各种动物细胞都适用 .1DQxtBWmHhkavU42VRUs答案：B例题： 动物细胞融合和植物原生质融合决定于 < ）A.细胞膜的流动性 B．细胞膜的选择透过性C.细胞质的流动性 D．细胞质酶的活性 1DQxtBWmHhy6v3ALoS89解读：考察动物细胞融合和植物原生质融合的原理，二者都利用了细胞膜的流动性答案：A同步拓展对称融合与非对称融合细胞融合在植物上可以克服有性杂交的不亲和性，打破物种之间的生殖隔离，是扩大遗传重组范围的一种有效手段，也称之为体细胞杂交，由此再生出来的植株是体细胞杂种.1DQxtBWmHhM2ub6vSTnP进行细胞融合的方式有两种：一是将两个物种的细胞除去细胞壁后，将完整的原生质体融合在一起.在融合的细胞中含有两个细胞核和两种细胞质，这种融合方式叫做对称融合 <symmetricfusion）.对称融合往往由于细胞核分裂不同步而产生染色体排斥丢失，同时也由于两个物种的全套基因组合在一起，好坏基因共处于一个杂种中，往往需要多次回交才能除去杂种中的不利基因，耗时长，效率低 .为了较好的解决对称融合所带来的问题，产生了另外一种融合方式 ──非对称融合 <asymmetricfusion）.非对称融合是指融合双方的亲本一方为完整的原生质体 <包括细胞核和细胞质），而另一方只有部分染色体和细胞质，或者无染色体只有细胞质 .这种融合方式可以较好的减少不利基因的重组，所得杂种只需要数次回交就可以达到改良作物的目的，耗时短，效率较高 .除去染色体的方法可以用 γ射线、χ射线、紫外线等物理方法，也可以用纺锤毒素等化学方法 .1DQxtBWmHh0YujCfmUCw二、单克隆抗体获得抗体的传统方法：从血清中分离所需抗体获得抗体的传统方法的缺点：产量低、纯度低，而且制备的抗体特异性差单一抗体需解决的问题1、单克隆抗体获得 ① 抗原制备②免疫动物③免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备④细胞融合⑤杂交瘤细胞的选择培养⑥杂交瘤细胞的筛选1DQxtBWmHheUts8ZQVRd步骤 ⑦杂交瘤细胞的克隆化⑧单克隆抗体的检定⑨分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立⑩单克隆抗体的大量制备.3/91DQxtBWmHhsQsAEJkW5T杂种细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体优点：特异性强，灵敏度高，产量大2、单克隆抗体的应用 作为诊断试剂：“早早孕诊断试剂盒”应用用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症“生物导弹”思考与讨论1、单克隆抗体制备的大致过程有哪些？该过程要经过几次筛选才能得到能产生单一抗体的杂交瘤细胞？提示：第一次筛选出杂交瘤细胞；第二次筛选出能够产生单一抗体的杂交瘤细胞 .2、 单克隆抗体在生物学和医学等领域的应用主要有哪些方面？提示：作为诊断试剂；用于治疗疾病和运载药物同步拓展1 、 克 隆 的 概 念“克隆”从英文“clone音”译而来，其定义是无性繁殖系，在生物学领域有 3个不同层次的含义.现在引申出的概念：遗传背景完全相同的一个群体 .1DQxtBWmHhGMsIasNXkA1）DNA 水平，特定 DNA 片段通过重组 DNA 技术插入到一个载体 <如质粒和病毒等）中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该 DNA 片段的“群体”.1DQxtBWmHhTIrRGchYzg2）在细胞水平，克隆是指由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体 .比如：使一个单一细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆 .又如，在脊椎动物体内，当有外源物 <如细菌或病毒）侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体 .产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由同一个 B细胞分裂而成，这样一个浆细胞群体也是一个细胞克隆 .1DQxtBWmHh7EqZcWLZNX3）在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体 .比如：两个同卵双胞胎即为一个克隆 .因为他<她）们来自同一个受精卵细胞，所以遗传背景完全一样 .生物个体的克隆可分为植物个体的克隆、动物个体的克隆 .1DQxtBWmHhlzq7IGf02E2、下面简要介绍单克隆抗体的制备过程：1>、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏 B淋巴细胞的 过程.一般选用6-8周龄雌性 Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射 .抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应 B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏 B淋巴细胞.1DQxtBWmHhzvpgeqJ1hk2>、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液.将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇.在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞.1DQxtBWmHhNrpoJac3v13>、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用 HAT选择性培养基.在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤 -鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成 DNA 而死亡.未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤 -鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡 .只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在 HAT 培养基中存活和增殖.1DQxtBWmHh1nowfTG4KI4>、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分4/9泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化 .通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养 .采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增 .经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存 .1DQxtBWmHhfjnFLDa5Zo5>、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法.<1）体内诱生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射 0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理 .1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞 .杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体 .约1-2周，可见小鼠腹部膨大 .用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体 .1DQxtBWmHhtfnNhnE6e5<2）体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养 .在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体 .但这种方法产生的抗体量有限 .近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量.1DQxtBWmHhHbmVN777sL例题：科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是<）1DQxtBWmHhV7l4jRB8HsA.经过免疫的B淋巴细胞B.不经过免疫的T淋巴细胞C.经过免疫的T淋巴细胞D.不经过免疫的B淋巴细胞解读：此题考查对细胞工程的了解.单克隆抗体的产生是利用了细胞工程中的细胞融合技术.小鼠的骨髓瘤细胞与经过免疫的B淋巴细胞融合成杂交瘤细胞，在体外培养的条件下无限繁殖，产生特异性的单一抗体.1DQxtBWmHh83lcPA59W9答案：A例题：下列关于细胞工程的叙述，错误的是<）．电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合．去除植物细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理C．小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的 B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体．某种植物甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同解读：通过植物细胞工程中的植物体细胞杂交技术得到的甲乙两植物的体细胞杂种染色体数目是甲乙体细胞染色体之和；而通过有性杂交得到的甲乙两品种杂交后代的染色体数目是甲乙两品种体细胞染色体之和的一半 <或两品种的配子所含染色体之和） .1DQxtBWmHhmZkklkzaaP答案：D例题 用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中错误的是< ）A ． 将抗 原 注 入小 鼠 体内 ， 获得 能 产生 抗 体 的 B 淋 巴 细 胞B ． 用 纤 维 素 酶 处 理 B 淋 巴 细 胞 与 小 鼠 骨 髓 瘤 细 胞C．用聚乙 二醇作诱 导剂，促使 能产生 抗体的 B 淋巴细胞与 小鼠骨 髓瘤细胞融 合．筛选杂交瘤细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体1DQxtBWmHhAVktR43bpw解读：用纤维素酶处理植物细胞，去掉细胞壁，而 B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞的融合需要用物理方法融合、诱导剂或灭活的病毒.1DQxtBWmHhORjBnOwcEd答案：B例题：已知细胞合成 DNA有D和S两条途径，其中 D途径能被氨基嘌呤阻断，人淋巴细胞中有这两种 DNA 的合成途径，但一般不分裂增殖 .鼠骨髓瘤细胞尽管没有 S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂交瘤细胞，请回答：1DQxtBWmHh2MiJTy0dTT<1）试管中除融合的杂交瘤细胞外，还有 _____________种融合细胞.5/9<2）设计一方法<不考虑机械方法），从培养液中分离出杂交瘤细胞，并说明原理.方法：______________________________________________________________________.原理：______________________________________________________________________.<3）将分离出的杂种细胞在不同的条件下继续培养，获得A、B、C三细胞株，各细胞株内含有的人染色体如下表所示<“＋”有，“－”无）1DQxtBWmHhgIiSpiue7A细胞株人染色体编号12345678A株＋＋＋＋－－－－B株＋＋－－＋＋－－C株＋－＋－＋－＋－测定各细胞株内人体所具有的 5种酶的活性，结果是：① B株有a酶活性；② A、B、C株均有b酶活性；③ A、B株有c酶活性；④c株有d酶活性；⑤ A、B、C株均无e酶活性.若人基因的作用不受鼠基因影响，则支配 a、b、c、d和e酶合成的基因依次位于人的 ______、_______、_______、_______和_______号染色体上.1DQxtBWmHhuEh0U1Yfmh解 读 ：<1）试管中有人的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞，在促溶剂的作用下，可能出现以下 3种细胞的融合情况，人的淋巴细胞和淋巴细胞融合，小鼠的骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞融合，人的淋巴细胞和小鼠的骨髓瘤细胞融合，实验需要的是第3种细胞，即杂交瘤细胞；1DQxtBWmHhIAg9qLsgBX<2）要将杂交瘤细胞分离出来，可以在培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞；加入氨基嘌呤后，使 D合成途径阻断，仅有 D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞中可以利用淋巴细胞中的 S途径合成DNA而增殖.<3）B株有a酶活性，通过表格可以看出 B株有6号染色体而A、C株没有，说明控制 a酶活性的基因位于6号染色体上 .控制其它酶的基因所在的染色体位置以此类推 .1DQxtBWmHhWwghWvVhPE答 案 ：<1）2；<2）培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞；加入氨基嘌呤后，使 D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞中可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖.1DQxtBWmHhasfpsfpi4k<3）6；1；2；7；8.例题： 阿根廷科学家 CesarMiistein和德国科学家 GeorgesKohler将B淋巴细胞产生抗体的基因转移到肿瘤细胞内，成功获得世界上第二株能稳定分泌单一抗体的杂交瘤细胞，该细胞的增殖方式和产物分别是(>1DQxtBWmHhooeyYZTjj1A．天丝分裂和逆转录抗体 B．减数分裂和转基因抗体C．有丝分裂和单克隆抗体 D．减数分裂和单克隆抗体解读：杂交瘤细胞的增殖方式为有丝分裂；产物是单克隆抗体 .答案：C.例题：“神州四号”飞船成功地发射与回收，其携带的生命系统装置中有混合的小白鼠骨髓瘤细胞和淋巴细胞，在微重力的情况下，请预测该实验的作用 ( >1DQxtBWmHhBkeGuInkxI．提高骨髓瘤细胞和淋巴细胞的突变频率．提高骨髓瘤细胞和淋巴细胞的繁殖能力6/9C．提高骨髓瘤细胞和淋巴细胞的融合几率D．促进 B淋巴细胞产生抗体解读：在微重力的情况下，可以提高骨髓瘤细胞和淋巴细胞的融合几率 .答案：C.课堂练习1．单克隆抗体制备过程中使用的骨髓瘤细胞是一种缺陷型细胞，在含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶的培养基 <HAT）中无法生长；而小鼠脾细胞是正常细胞，在 HAT培养基上可正常存活.用聚乙二醇诱导细胞融合后，经过数代培养，最终可在 HAT培养基上存活并能产生单克隆抗体的细胞是 < ） 1DQxtBWmHhPgdO0sRlMoA．骨髓瘤细胞之间形成的融合细胞 B ．脾细胞之间形成的融合细胞C．骨髓瘤细胞与脾细胞之间形成的融合细胞 D ．脾细胞2．研究单克隆抗体治疗癌症的思路是 < ）A．利用单克隆抗体特异性地对抗癌细胞B．以单克隆抗体作抗癌药物杀死癌细胞C．抗癌物质在克隆细胞中大量合成D．单克隆抗体携带抗癌药物特异性地与癌细胞结合3．科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是<）1DQxtBWmHh3cdXwckm15A．经过免疫的B淋巴细胞B．不经过免疫的T淋巴细胞C．经过免疫的T淋巴细胞D．不经过免疫的B淋巴细胞4．用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中错误的是<）A．将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋巴细胞B．用纤维素酶处理 B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞C．用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的 B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合D．筛选杂交资金积累细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体5．只能使动物细胞融合的常用诱导方法是 < ）A．PEG B．灭活的病毒 C．电刺激 D．离心6．单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的 < ）A．B淋巴细胞 B．T淋巴细胞 C．骨髓瘤细胞 D．杂交瘤细胞7．用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞 < ）1DQxtBWmHhh8c52WOngMA.容易产生各种变异 B．具有更强的全能性C.取材十分方便 D．分裂增殖的能力强1DQxtBWmHhv4bdyGious8.动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是 < ）① 诱导融合的方法完全相同 ②所用的技术手段不相同② 所采用的原理完全相同 ④都能形成杂种细胞A.①② B.①③ C. ②④ D.③④9．动物细胞融合和植物原生质融合决定于< ）A.细胞膜的流动性 B．细胞膜的选择透过性C.细胞质的流动性 D ．细胞质酶的活性 1DQxtBWmHhJ0bm4qMpJ97/9从母羊甲的体细胞中取出细胞核，注入到母羊乙去掉核的卵细胞中，融合后的细胞经卵裂形成早期胚胎，再植入到另一只母羊丙的子宫内，出生小羊的大多数性状 < ）1DQxtBWmHhXVauA9grYPA.难以预测 B. 像甲 C. 像乙 D. 像丙11.“生物导弹”是指< ）A.单克隆抗体 B.杂交瘤细胞C.产生特定抗体的 B淋巴细胞 D.在单抗上连接抗癌药物动物细胞工程技术的基础是