高效液相色谱分析法

高效液相色谱分析法一、高效液相色谱仪HPLC二、高效液相色谱法的特点featureofHPLC三、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC高效液相色谱的特点与仪器highperformanceliquidchromatograph（HPLC）featureandinstrumentofHPLC2022/12/91引言高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm,长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10m）！

直到60年代末70年代初，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。2022/12/921.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g,荧光检测器——10-11g。2.HPLC与GC的比较分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。2022/12/933.应用

由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。右图是各种HPLC方法的应用范围及对象极性增加不溶于水溶于水非极性离子非离子极性吸附反向分配分配正向分配离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量2022/12/94一、液相色谱仪器

highperformanceliquidchromatograph2022/12/95液相色谱仪（2）2022/12/96液相色谱仪（3）2022/12/97液相色谱仪（4）2022/12/98高效液相色谱仪（5）AgilentTechnologies11002022/12/99二、高效液相色谱法的特点

featureofHPLC

液相色谱法：流动相为液体的色谱分离分析技术

特点：高压、高速、高效、高灵敏度、高度自动化高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2022/12/910三、流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程HPLC仪器结构示意图（方框图）2022/12/911检测器高压输液泵高压输液泵输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统2022/12/9122.主要部件p80-90(1)高压输液泵p80主要部件之一，压力：150～350×105

Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性（动画）2022/12/913(2)梯度淋洗

（洗提、洗脱）

装置p82内（高压）梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。外（低压）梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。分离过程中按一定程序连续改变载液中溶剂即流动相的配比和极性以提高分离效果（类似GC中的程序升温）2022/12/914(3)进样装置p83

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：2022/12/915(4)高效分离柱p84

柱体为直型不锈钢管，标准内径4.6或3.9mm，柱长15～30cm，填料颗粒粒度5－10μm,柱效7000-10000。发展趋势是减小填料粒度(3－5μm)和柱径以提高柱效。2022/12/916(5)液相色谱检测器p84-90

a.紫外检测器(ultravioletphotometricdetector)原理：朗伯比尔定律。优点：应用最广，对大部分有机化合物有响应，灵敏度高，线性范围宽。是高效液相色谱仪的标准配置。它的最重要特征是对流动相的流速（脉冲）和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱。其次，流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL)。固定波长－汞灯254、280nm,可变波长－氘灯200－450nm.光路长5－10mm。缺点：对无紫外吸收的组分不响应，而对紫外吸收较大的溶剂如苯不能作流动相使用。

双光路紫外检测器2022/12/917b.光电二极管阵列检测器(photo-diodearraydetector;PDAD)紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2022/12/9182022/12/919光电二极管阵列检测器2022/12/920c.示差折光检测器

p87（differentialrefractiveindexdetector）

原理：通过连续检测参比池和样品池中流动相之间的折射率之差值来测定样品浓度（折射率差值与浓度呈正比）。

特点：通用型检测器（每种物质具有不同的折射率）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。结构：偏转式、反射式和干涉型三种入射角不变时，光速折射偏转角是介质中成分变化的函数。2022/12/921示差折光检测器2022/12/922d.荧光检测器

p88（fluorescencedetector）特点：高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。原理：有机共轭芳环分子受紫外光激发后发出荧光。结构：直角型结构。2022/12/923e.电导检测器p89

（electricalconductivitydetector）原理：根据物质在某些介质中电离后产生电导变化来测定电离物质的含量。特点：广泛用于离子色谱仪中。应用于能电离成离子物质的检测。响应受温度影响较大。结构：由一对平行的铂电极（表面镀铂黑以增加表面积）和池体构成电导检测池，两电极构成电桥的一个测量臂。2022/12/924请选择内容第一节高效液相色谱的特点与仪器featureandinstrumentofHPLC第二节基本原理与主要分离类型basicprincipleandmainseparatingtype第三节固定相与流动相stationary