发酵工程-灭菌与除菌

第五章灭菌与除沈阳 生物技术与生物制药教研中所有微生物及其孢子的过程灭菌方法化学物质灭菌 、高锰酸钾等干热灭菌（160℃，1h～湿热灭菌（121℃，20min～30min辐射灭菌（UV、Co60等臭氧灭菌（单个氧原子O的氧化作用过滤除菌（棉花、石棉、醋酸纤维等静电除菌（高压直流电场 主要内培养基和发酵设备的灭空气除无菌检染菌原因分染菌的要污染杂菌的处污染噬菌体的处（一（一）培养基的分批灭菌（实罐灭菌、实消连续灭菌（连消11实消优

不需要专门的灭菌设备，投资操作简便，灭菌效果可靠对蒸汽的要求较低Pa。适用中小型罐 罐利用率低不能采用高温快速灭菌工艺实消工艺培养基送至罐内，开搅夹层预（排尽冷空气、冷凝水各路进汽，开排 30min快速冷却（关闭各排汽进汽阀门，通入无菌空气通冷凝水实罐灭菌示意22连消优 •高温快速灭菌方法，营养成分破坏少热能利用合理，适合实行自动化控制于5×105Pa。连消缺

需增加一套连续灭菌设备，投资较大增多了操作环节，增加了染菌的几率132

保预连连消—喷淋冷却连连消连消塔结一般控制培养基输入连塔的速度＜0.1m/min，酵温度喷射加热—真空冷保温20~30s预热

加热至板式换热器连3、影响培养基灭菌的因温度灭菌温度和受热时间培养基的成分微生物的耐热性培养基的pH值：pH为6.0～8.0培养基的物理状态养基的灭菌时间长 培养基中的微生物数量求所需的灭菌时间也越长。（二）发酵设备的灭菌方实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌连续灭菌时，发酵罐需在培养基灭菌之前，直接用蒸汽进行空罐灭菌。罐压1.5×105~2.0×105罐温时间30~45总空气过滤器、分空气过滤器、补料系统、消沫系统及各管路分别灭菌。（（一）空气过滤棉花活性炭过滤平板式超细纤维过滤金属烧结管过滤未脱

棉花活性炭过滤器填充层厚，体积大，吸收油水能力强，一般作为空气总过滤器用。但更换介质时劳动强度大；如填装不匀，容易造成空气走短路，甚至介质被吹翻，使过滤器失效；此外压降也较大。棉花活性炭过滤

（二）空气过滤除5μm以上液冷却冷却加热至冷却冷却加热至滤去灰尘、土等固体颗除除50μm以上液无无菌检查的方无无菌检查的样染染菌的判（一）无菌检查的方普通显微镜或电镜观察平板划线培养检查肉汤培养检查斜面培养检查上上述方法组合使用如1、2、3或1、3、4美兰染制 或革兰染

镜下观察有无杂划 培养过

观察有无杂菌落的生接酚红肉汤样

培养过

观察肉汤颜色的变（变黄为染菌划培养过划观察有无杂菌落的生发酵样品的无菌检查方杂无菌检查方 显微镜观无菌检查方 肉汤培养、斜面培无菌检查方 平板划线培养无菌检查方 平板划线培养（二）无菌检查的样菌种岗岗

摇瓶菌丝悬液、孢子悬浮液后、间8h样品、移种。发酵岗空气系

间隔8h样品、直至放罐总空过滤器、分过滤器（三）染菌的判连续3个时间样品污染杂菌，可判断染菌染菌率计算公式发发酵罐染菌罐批（次染菌率（%）总投罐批（次四、染菌原因的分引起发酵染菌的原因很复杂，染菌后准确地分析染菌的原因很防和征服发酵染菌，非常有必要对染菌原因进行查找和分析，保证发酵生产的正常顺利进行。 抗生素发酵染菌的原因分染菌原 所占百分比带菌或怀 带 接种时罐压降至大气压培养基灭菌不总空气系统带升至罐夹套穿蛇管穿接种管穿阀门泄搅拌轴封泄罐盖泄其他设备泄操作问原因不某制药厂链霉素发酵染菌的原因分染菌原

所占百分比带 接种带入杂 培养基灭菌不 取样、补样带入杂 停电时罐压降至大气压 空气系统带 设备穿 蒸汽压力不 操 规 管理问 原因不 （一）造成染菌的原空气系统带油、水未除尽，过滤介质失效等导致孢子或摇瓶菌丝悬液染菌导致罐中 液染菌导致培养基灭菌不彻原材料中大的团块蒸汽压力不足灭菌工艺操作规程补料系统带糖、油、糖、油、氨水等补料培养基染菌逃培养液向培养液向罐外溢出水质污设备的死活蒸汽到活蒸汽到达不了或达不到灭菌温度设备泄罐盖、搅拌轴罐盖、搅拌轴封、阀门（进罐第一阀）等泄漏隔膜阀示意冷却管、接种管、夹冷却管、接种管、夹套等穿孔脏、乱、差，滴漏跑脏、乱、差，滴漏跑冒现象等操作问不明原（二）染菌原因的分染菌的时发酵前期、中期及后期染菌的种染菌的规个别罐体的连续染个别罐批的散在性染罐和发酵罐小规模罐和发酵罐大规模染五 染菌的要（一）不断净化空气系措提高空气进口空气的洁除尽压缩空气中夹带的油采用高效的过滤介定期更换过滤过滤器定期灭 气进行无菌检采用无润滑油空气压缩饱和蒸汽（2饱和蒸汽（2～5含水量总管道压力﹥3×105～3.5×105使用压力﹥2×105（三）保证设备严密无渗漏、无死措 不断、检查、更换零件定期大修：一年一（四）保证培养基灭菌质措 •原材料要具有一定的细保证蒸汽压力和蒸汽质按灭菌工艺要求操（五）严格按工艺要求操灭灭菌操补料操接种操取样操无菌操配料操看罐操作取样操取样前后灭取样前后灭菌管道31312取样操作示意取样前：关闭阀门1，开阀32。取样时：关闭阀3，开阀1。取样后：关闭阀1，开阀3。菌种岗位的无菌万级洁净GMP要求墙壁耐的壁板各种阴阳角均为圆弧状操 需经更衣室，并淋浴后进入定期对无菌 ，以保持无菌状态（六）加 培训和管强化无菌意识，定期技术培，制定各项管理制度等（七）清理