食品生物技术下游加工技术

第六章

食品生物工程下游技术第一节下游工程概述第二节原料与预处理第三节固液分离和细胞破碎第四节初步纯化第五节精细纯化第六节成品加工

第一节下游工程概述生物工程下游技术的重要性生物工程下游技术的特点下游工程的目的产物下游工程的基本路线下游工程的质量控制一、生物工程下游技术的重要性

生物技术产业工业化的必不可少的重要组成；改进分离工程是生物技术产业降低生产成本和提高经济效益的关键。生物制品成本构成的主要部分，分离纯化部分的成本约占总成本50%以上。三、生物工程下游技术的特点在原料液中目标成分的含量较低，＜10%；原料液是复杂的多相体系；目标成分的稳定性差，在不适宜的分离条件下会分解和失活；要求产品的纯度要高。

四、下游工程的目的产物1、目的产物的特点不稳定性;相对分子量较大；含量低,纯度高;易被微生物污染、分解；成分较为复杂;许多是生物功能因子.2、食品生物技术目的产物分类

蛋白质、多肽、氨基酸类酶、辅酶、酶抑制剂类多糖类免疫调节类其他，包括脂类、多不饱和脂肪酸、去氧胆酸、维生素、芳香物质、色素等。3、食品生物技术目的产物的商业用途功能食品食品添加剂生物药物化妆品

五、下游工程的基本路线

预处理→固液分离→初步纯化→精细纯化→成品加工下游加工过程可分为4个阶段：①培养液(发酵液)的预处理②固液分离；③初步纯化(提取)；④高度纯化(精制)：最后纯化。

下游工程的基本框架

六、下游工程的质量控制下游工程的质量控制包括产品的鉴定、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性等。

第二节原料与预处理原料

下游工程的原料包括发酵工程、酶工程、细胞工程的发酵液和培养液（主要原料），以及基因工程获得的动、植物、微生物的有机体和器官。

发酵液特点：（1）内容：发酵液的成分极为复杂，包括：微生物菌体、残存培养基、活性酶类、微生物的代谢产物。（2）性质：

悬浮液状态、悬浮物颗粒小、浓度低、液体黏度大，性质不稳定。

发酵液作为原料时，要注意发酵液菌体的生长阶段：生长对数期——目标成分是初级代谢产物（核酸、酶等）；菌体衰亡期、产物积累高峰期——目标成分是次级代谢产物。

转基因动植物作为原料时，要注意季节、生长期、组织器官部位、老嫩程度、新鲜度对目标成分含量和活性程度的影响。发酵液的预处理

1.悬浮液的预处理

悬浮液的基本特性：①细胞的相对密度与培养液相似②可压缩性，粘稠，属非牛顿流体，流变学复杂③悬浮状态稳定

预处理目的：a改变发酵液物理性B.除去发酵液中部分杂质2.预处理方法

加热提高发酵液温度可显著降低悬浮液黏度，提高过滤效率；（前提：目标产物耐热）调节pH值适当调节pH值可使蛋白质等两性物质处于等电点，不稳定而沉淀出来；也可改变大分子的电荷性质.凝聚和絮凝指在化学试剂的作用下，改变发酵液中的大分子物质和细胞碎片的分散性质，使聚结沉淀。常用的凝聚剂与絮凝剂凝聚剂：铝盐，铁盐，钙盐，锌盐

絮凝剂：（1)阳离子型：阳离子聚丙烯酰胺，聚丙烯酸二烷基胺乙酯，聚二烯丙基四胺盐。(2)阴离子型：聚丙烯酸钠，聚苯乙烯磺酸，木质素磺酸(3)非离子型：聚氧乙烯(4)天然类：甲壳素

第三节固液分离和细胞破碎固液分离

目标产物为胞外产物——固液分离重点为液相部分；目标产物为胞内产物——固液分离重点为固相部分。固相部分必须经细胞破碎，将目的产物转移至液相部分，再对液相部分进行分离纯化。

固液分离方法：细菌和酵母的发酵液——离心分离离心分离实质：在离心产生的重力场作用下使悬浮颗粒沉降的操作；离心分离方式：分批的、半连续的、连续的；霉菌和放线菌的发酵液——过滤分离过滤分离实质：在操作中迫使悬浮液通过固相支撑物或过滤介质、截留固相，达到固液分离的目的；离心分离方式：压力过滤、真空过滤、错流过滤（切向流过滤）；原理设备特点缺点离心在离心产生的重力作用下颗粒沉降速度加快而沉淀高速冷冻离心机适于粒度小，热不稳定的物质回收，适于实验室应用容量小，连续操作困难，大规模工业应用性差碟片式离心机适于大规模工业应用，可连续，也可批式操作，操作稳定性较好，易放大，推广半连续或批式操作时，出渣清洗烦杂；连续操作固形物含水高，总的分离效率低管式离心机批式操作，转速高，固形分离效果较好，含水低，容量有限，处理量小，折装频繁，噪声大倾析式离心机连续操作，易放大，易工业应用，操作稳定对很小颗粒固形物回收困难，设备投资高过滤依据过滤介质的孔隙大小进行分离板框式过滤机平板过滤机真空旋转过滤机管式过滤机深层过滤机涂层过滤机设备简单、操作容易，适合大规模工业应用分离速度低，分离效果受物料性质变化的影响，劳动强度大影响过滤的因素:a.菌种：真菌，放线菌，细菌;b.培养基：黄豆，花生，淀粉;C.发酵时间：菌体自溶前放罐.细胞破碎

细胞破碎的方法有机械、生物和化学等方法。大规模生产中常用高压匀浆器和球磨机。（1）珠磨法：利用珠磨机快速研磨破碎方法。操作简单、稳定，可连续生产，破碎率高，但温度升高多，对热敏感成分易失活，细胞碎片小，给后续操作增加难度。（2）高压匀浆法：利用高压驱使下高速运动并发生剧烈冲击，使细胞破碎的方法。操作简单，可连续生产；但破碎率比珠磨法差，不适合丝状真菌和含有包涵体的基因工程菌的破碎。

第四节纯化方法萃取法吸附法沉淀法离心法膜分离法萃取

1.有机溶剂萃取

原理：依靠在水和有机溶剂中的分配系数差异进行分离.

例:抗生素在水及与水互不相溶的溶剂中有不同的溶解度。当其进行相转移时，杂质不能或较少地随着转移，因而能达到浓缩和提纯的目的。

有机溶剂萃取特点（1） 萃取过程有选择性；（2） 通过相转移减少产品水解；（3） 适用于不同规模；（4） 传质快；（5） 毒性与安全环境问题。由于蛋白质遇有机溶剂会引起变性，故溶剂萃法一般仅用于抗生素等小分子生物物质的提取。常用的萃取方式

多级逆流萃取2.两水相萃取法

概述两水相萃取法仅适用子蛋白质的提取，近年来也开始研究用于小分子物质。由于聚合物分子的不相容性，两种聚合物的水溶液(含盐或不含盐)可以分成两相。蛋白质分子可在两相间进行分配。3.超临界萃取

原理:利用某些流体在高于其临界压力和临界温度时具有很高的扩散系数和很低的黏度,但具有与流体相似的密度的性质,对一些液体或固体物质进行萃取的方式.特点:

萃取能力大、速度快，对物质具有选择性；设备要求高，规模小。吸附法1、概述吸附法系利用吸附剂与目的物质、杂质、色素物质、有毒物质之间的分子引力而使其吸附在吸附剂上。2、应用发酵产品的除杂、脱色、有毒物质的分离提纯和抗生素的提取。3.特点（1）不用或少用有机溶剂；（2）操作简便，安全；（3）生产过程pH变化小；（4）从稀溶液分离溶质；（5）

吸附剂对溶质的作用小；（6）

吸附平衡为非线性；（7）选择性差。3、吸附剂的类型普通吸附剂吸附：（1）疏水或非极性吸附剂，典型的活性炭。活性炭有很多缺点：吸附性能不稳定、选择性不高、可逆性差、不能连续操作，劳动强度较大、炭粉还会影响环境卫生。（2）亲水或极性吸附剂，如硅胶，氧化铝。（3）特点不用或少用有机溶剂；操作简便，安全；生产过程pH变化小；从稀溶液分离溶质；吸附剂对溶质的作用小；吸附平衡为非线性；选择性差。大网格聚合物吸附剂（非离子树脂）：

优点：选择性好、解吸容易、机械强度好、流体阻力小、反复使用、可适用于各种产品。

离子交换法概述：利用离子交换树脂分离生物物质的方法。原理：利用离于交换树脂和生物物质之间的化学亲和力．有选择件地将生物物质吸附上去．然后以较少量的洗脱剂将它洗下来。

离子交换剂的分类

（1）强酸性阳离子交换树脂（2）弱酸性阳离子交换树脂（3）强碱性阴离子交换树脂（4）弱碱性阴离子交换阴树脂树脂性能比较影响离子交换速度因素（1）树脂颗粒的大小；（2）树脂的交联性；（3）温度；（4）离子的大小；（5）离子价；（6）树脂的强弱；（7）树脂层装填的松紧度。影响吸附因素（1）吸附剂性质：吸附容量（a比表面，b空隙度）;吸附速度（a粒度，b孔径分布）;机械强度（使用寿命）（2）吸附物性质:表面张力；溶质在易溶解的溶剂中吸附量小；极性吸附剂易吸附极性物质；同系物极性越小，越易被非极性吸附剂吸附。（3）溶液pH的影响（解离度）（4）温度的影响（吸附热，溶解度）（5）其它组分的影响（促进，干扰，互不影响）沉淀法概述

最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛比用在工业上和实验室中。沉淀法广泛用于蛋白质的提取中。由于其浓缩作用常大于纯化作用，因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法，用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质，然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。

沉淀特点：(1)料液体积大大降低；(2)作为纯化前处理或最后产物收集方法；(3)操作简便,成本低。

沉淀又可分为下列5种类型：(a)盐析

(b)加入有机溶剂

(c)调pH至等电点

(d)加入非离子型聚合物

(e)加入聚电解质盐析

加入高浓度的盐使蛋白质沉淀．其机理为蛋白质分子的水化层被除去，而相互吸引。最常用的盐是硫酸铵，加入的量通常应达到20％~60％的饱和度。

等电点沉淀法

在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零．降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。但对一些亲水性强的蛋白质(如明胶)，则在低离子强度的溶液中，调pH在等电点并不产生沉淀。等电点沉淀法优点：（1）适用于疏水性强的蛋白。（2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，溶解度增大；（3）价廉价，无毒。等电点沉淀法缺点：是酸化时，易使蛋白质失活，这是由于蛋白质对低pH比较敏感。

有机溶剂沉淀法

有机溶剂沉淀法是利用与水可以互溶的有机溶剂使产物沉淀的方法．这个方法在酶制剂、氨基酸、抗生素等发酵产物提取中被广泛采用。机理：为加入有机溶剂会使溶液的介电常数降低，从而使水分子溶解能力降低，在蛋白质分子周围，不易形成水化层。

有机溶剂沉淀法优点：溶剂容易蒸发除去，不会残留在成品中，因此适用子制备食品蛋白质。而且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。有机溶剂沉淀法缺点：容易使蛋白质变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。聚电解质沉淀加入聚电解质的作用和絮凝剂类似物，同时还兼有一些盐析和降低水化等作用。聚丙烯酸（pH2.890%蛋白沉淀）聚甲基丙烯酸聚乙烯亚胺聚苯乙烯季胺盐（pH10.4,95%蛋白沉淀）金属离子沉淀分为三类:

第一类为Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和Cd2+能和羧酸，含氮化合物如胺以及杂环化合物相结合；第二类为Ca2+，Ba2+，Mg2+和Pb2+能和羧酸结合，但不和含氮化合物相结合；第三类为Ag+，Hg2+和Pb2+能和琉基相结合。

金属离子沉淀法的优点：

它们在稀溶液中对蛋白质有较强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。在这些离子中，应用较广的是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+和Mn2+．而Cu2+，Fe2+，Pb2+，Hg2+等较少应用，因为它们会使产品损失和引起污染。膜过滤法

概述利用具有一定选择性透过的过滤介质进行物质分离的技术。机理系指以压力为推动力，依靠膜的选择性，将液体中的组分进行分离。

膜分离的特点①操作在常温下进行；②是物理过程，不需加入化学试剂；③不发生相变化(因而能耗较低)；④在很多情况下选择性较高；⑤浓缩和纯化可在一个步骤内完成；⑥设备易放大，可以分批或连续操作。

膜过滤法分类2.4膜材料微滤膜材料：聚偏氟乙烯，聚丙烯，硝酸纤维，醋酸纤维超滤膜：聚砜，硝酸纤维，醋酸纤维反渗透膜：醋酸纤维素衍生物，聚醚，聚酰胺天然材料：各种纤维素衍生物人造材料：各种合成高聚物特殊材料：复合膜，无机膜醋酸纤维特点：（1）透过速度大；（2）截留盐的能力强；（3）易于制备；（4）来源丰富；（5）不耐温（30℃）；

(6)pH范围窄，清洗困难；(7)与氯作用，寿命降低；（8）微生物侵袭；（9）适合作微滤膜、反渗透膜。聚砜膜的特点：（1）温度范围广；（2）pH范围广；（3）耐氯能力强；（4）孔径范围宽；（5)操作压力低；（6）适合作超滤膜。聚酰胺膜的特点：（1）耐热；（2）pH范围广；（3）寿命较长；（4）不耐氯。2.5膜污染

产生原因：膜的劣化：化学，物理，生物污垢：吸附，堵塞防止方法：预处理开发抗污染膜加大流速化学清洗物理清洗膜过滤法在发酵工程中的应用

超滤主要应用：（1）去除葡萄酒中热变性蛋白质、制造澄清、美味的葡萄酒；（2）从悬浮状的发酵液中去除悬浮的细胞或细胞碎片和其他的粒状或胶体状的杂质；（3）用于对微生物酶的浓缩，去除粗酶液中无机盐和相对分子质量低的糖或氨基酸；（4）去除酿造葡萄酒的原料葡萄汁中的果胶和水溶性半纤维素等物质以及啤酒超滤除菌等。微滤主要应用：发酵液中除去菌体，反渗透主要用于小分子的浓缩．纳滤主要应用：可用于小分子的浓缩，而且所能达到的浓缩程度高于反渗透。

膜过滤的主要缺点：浓差极化和膜的污染，膜的寿命较短和通量低，很难用于处理量大的工业中。但这些缺点正在克服，有很好的发展前景。

第五节精细纯化

又叫高度纯化(精制)。经初步纯化后，体积已大大缩小。但纯度提高不多，需要进一步近行精制。大分子(蛋白质)和小分子物质的精制方法有类似之处。但侧重点有所不同，大分于物质的精制依赖于色层分离，而小分子物质的精制常常利用结晶操作。1、色层分离1.1概述

色层分离是一种高效的分离技术，过去仅用于实验室中，后来规模逐渐扩大而应用于工业上。操作是在柱中进行，包含两个相—固定相和移动相，物质在两相间分配情况不同，在柱中的运动速度也不同而获得分离.色层分离是一组相关技术的总称。层析分离法一般用在蛋白质精制后工序，蛋白质在进行色层法纯化之前，需经过适当预处理。

1.2色层分离特点（1）

纯化倍数高；（2）操作规模小，放大困难；（3）

用于终产品纯化；（4）适用于价格昂贵的产品。1.3层析分离分类（1）按溶质分子与固定相相互作用机理：吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）分配层析（溶质在两液相间分配系数不同）凝胶过滤（分子大小与形状）

（2）根据固定相形状分类：柱层析纸层析薄层层析（3）根据流动相分类：气相层析液相层析超临界流体层析1.4常用层析介质氧化铝：应用于有机溶剂中分离天然成分；硅胶:应用于吸附层析剂与分配层析剂优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物，用于天然产物分离，可用在水溶液中或有机溶剂中。琼脂糖；葡聚糖:应用于水溶液中分离蛋白质等；聚丙烯酰胺:应用（1）凝胶过滤（2）电泳介质PharmaciaÄKTA层析系统

第六节成品加工结晶浓缩干燥1.浓缩浓缩是用于提高液相中浓度的浓度，为结晶和干燥作准备。（1）对于热稳定性的目的产物：水浴常压蒸发、减压蒸发等；中小规模的生产可用旋转蒸发器浓缩；对较大规模生产可掺用降膜式薄膜蒸发器。（2）对于热不稳定性的目的产物：

冷冻浓缩、葡聚糖凝胶浓缩、聚乙二醇浓缩、超滤浓缩。常压蒸发设备图为麦芽汁煮沸锅，它包括锅体，加热夹套结构搅拌装置，排气管等四个结构。

热敏性物料的蒸发

（1）溶液在真空状态，较低温度下即沸腾，溶剂汽化。这称为真空蒸发或真空浓缩；（2）蒸发温度的高低，决定真空度的大小。通常真空蒸发的真空度一般为600~700毫米水银柱，物料的蒸发温度为50~75℃。（3）为了缩短受热时间，让溶液在蒸发设备的加热器内以很薄的液层通过，使溶液受热升温汽化而被浓缩，浓缩的溶液迅速离开加热表面，这称为薄膜蒸发。其蒸发浓缩时间很短，一般为几秒到几十秒。由于溶液受热时间短，能保持产品原有的质量、风味和颜色。这种薄膜式的蒸发设备已广泛应用于发酵工业中。薄膜蒸发管式薄膜蒸发器：（1）升膜式蒸发器：形成的液膜与蒸发的汽流的方向相同，由下而上的并流上升。（2）降膜式蒸发器：形成的液膜与蒸发的汽流的方向相同，由上而下并流下降。（3）升降膜式蒸发器：将同一蒸发器的加热管分成两程，溶液先以升膜式进行蒸发，再以降膜形式蒸发刮板式薄膜蒸发器：液膜是靠转动的刮板作用在蒸发器内壁形成。2.结晶2.1概述结晶可以认为是沉淀的一种特殊情况，结晶的先决条件是溶液要达到过饱和。2.2特点(1)选择性高；(2)纯度高；(3)设备简单，操作方便；(4)影响因素多。2.3结晶过程：

(1)过饱和溶液的形成；

(2)晶核生成；

(3)晶体的生长。2.4结晶的特点和应用优点：生产出指定纯度，粒度分布及晶形的产品。缺点：成本高，操作和产品质量稳定性差。结晶主要用于低分子量物质的纯化．例如抗生素；青霉素用醋酸丁酯从发酵液中萃取出来，然后加入醋酸钾的酒精溶液以产生沉淀。柠檬酸在工业上用冷却的方法进行结晶。3.干燥

生物制品的含水量一般控制在5%~12%。生物制品的空气干燥按工作原理分为：气流干燥、沸腾干燥和喷雾干燥。气流干燥工作原理：利用热空气与粉状或颗粒状湿物料在流动过程中充分接触，气体与固体物料之间进行传热与传质，从而使湿物料达到干燥的目的。对于潮湿状态时仍能在气