3 槟榔花中酚类物质对紫外损伤HSF细胞的保护作用

3槟榔花中酚类物质对紫外损伤HSF细胞的保护作用3.1材料与方法3.1.1材料与试剂表儿茶素、没食子酸、芦丁和香豆酸，美国sigma公司；人皮肤成纤维细胞HSF，中国科学院细胞库提供；MTT、二甲基亚枫(DMSO)，美国Sigma公司；DMEM培养基、胰酶(Trypsin)，美国Gibco公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司；烟酰胺腺嘌吟二核苷酸(NADH)，乙酰辅酶A(acetyl-CoA)，美国Gibco公司，其他均为AR级试剂。3.1.2主要仪器荧光测读仪(ThermoscientificvarioskanascentFL)；CO2培养箱(WJ-185I)；倒置显微镜(leica)；离心机(TDZ4-WS)；超净工作台(ZHJH-1109B)等。3.1.3实验方法(1)紫外损伤模型的建立HSF细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养条件为5%CO2,温度37°C，饱和湿度。当细胞处于对数生长期时，用0.25%胰酶消化后用吸管吹打成单细胞悬液，以2x105个/mL的密度接种于35mm细胞培养皿中，过夜培养。实验分为正常对照组、紫外照射组(照射时间分别为1h，2h，3h)。首先吸除各细胞培养皿中的培养液，PBS冲洗一次后加入700pLPBS覆盖底面避免干燥，紫外照射组放入20W短波紫外灯下照，照射距离为20cm，正常对照组不经过紫外照射。紫外照射结束后，采用MTT法测定各组细胞存活率。⑵酚类物质对HSF细胞紫外损伤的保护作用实验分为正常对照组、紫外照射组、酚类保护组。实验分组后，吸除各细胞培养皿中的培养液，PBS冲洗一次后加入700pLPBS覆盖底面避免干燥，紫外照射组和酚类保护组放入20W短波紫外灯下照射3.5h，照射距离为20cm，正常对照组不经过紫外照射。紫外照射结束后，采用MTT法测定各组细胞存活率。采用的酚类物质包括：表儿茶素，没食子酸，香豆酸、芦丁。根据预试验结果，表儿茶素的作用浓度确定为1、2.5pg/mL，没食子酸作用浓度1、5ug/ml,香豆酸的作用浓度为1、10pg/mL，芦丁的作用浓度1、10ug/ml。线粒体膜肿胀度检测收集分组处理后的细胞，8000rpm离心5min，放入冰箱中反复冻融三次。考马斯亮蓝染色法测定线粒体蛋白浓度，取50pg蛋白加入到总体积为200pL的反应缓冲液中(250mmol/L蔗糖、5mmol/LKH2P04>3mmol/L琥珀酸钠，pH7.2)，混匀后记录520nm处吸光度值，测定过程保持25。。恒温［21-22］。线粒体标志性酶LDH和CS活性测定［28-29］啻匕酸脱氢酶(LDH)的活性测定开启预热分光光度计，取435ul缓冲液(80mMTris、200MmNaCl,pH7.5),加入50ul0.20MmNADH,以及收集分组处理后的细胞10ul，再加入5ul丙酮酸，迅速混匀，并快速置入分光光度计中，在A340nm处每隔30s记录一个数值，连续记录10min。以对照组的酶活为100%计，紫外组和酚类保护组酶活与对照组相比较，计算其相对酶活。②宁檬酸合酶(CS)的活性测定开启预热分光光度计，将波长设置为412nm，在1ml比色杯中加入435ul缓冲液(100mMTris-HCl,PH8.0),加入20ul5mMDTNB、5uLTriton、20ul乙酰辅酶A，以及10ul收集分组处理后的细胞，混匀后置于分光光度计中。以此为本底，调零，然后再在比色杯中加入10ul草酰乙酸，抽吸混匀，每隔10s记录一个数据，共记录2分钟。以对照组的酶活为100%计，紫外组和酚类保护组酶活与对照组相比较，计算其相对酶活。⑸线粒体超氧自由基的测定用IsolationBufferB稀释线粒体蛋白至3.2ug/ml的浓度，混匀。加样步骤("-"为缓冲液补足)：对照1对照2处理后的细胞液缓冲液(150ul)+++线粒体蛋白(25ul)--+NBT(25ul)-++将其放在振摇床上15-60分钟，然后在A570nm处测吸光度，每隔15分测一次。3.2结果与分析3.2.1紫外线对细胞的紫外损伤作用紫外辐射是电磁波谱中介于电离辐射和可见光辐射之间的部分，其波长介于100-400nm之间。它对细胞有一定的杀伤作用，尤其会引起DNA损伤，还可引起细胞DNA断裂和DNA-蛋白质交联以及染色体畸变［3。。为了建立紫外线对HSF细胞的氧化损伤模型，采用不同照射时间（终时间为0h、1h、2h、3h）处理HSF细胞，细胞存活率的结果见图3。随着照射时间增长，细胞存活率逐渐减低，且呈时间依赖性。紫外照射细胞2h后，HSF细胞死亡率达到（65.02±0.56）%，故选择此照射时长建立模型。图3不同紫外照射时长对HSF细胞存活率的影响3.2.2酚类物质对紫外损伤的HSF细胞的保护作用在槟榔花中4种主要酚类物质（表儿茶素、没食子酸、香豆酸、芦丁）的保护下，HSF细胞在紫外损伤2h后，细胞存活率的结果见图4。如图4所示，表儿茶素浓度为1〜2.5四g/mL时，可将细胞存活率提高2.83〜34.56%，没食子酸浓度为1〜5四g/mL时，可将细胞存活率提高7.89〜52.31%，香豆酸浓度为1〜10四g/mL时，对HSF细胞没有明显的保护作用。芦丁浓度为1〜10四g/mL时，对HSF细胞没有明显的保护作用，而且高浓度的香豆酸会引起细胞死亡率的升高。综上所述，槟榔花中主要的酚类物质表儿茶素和没食子酸对紫外损伤HSF细胞图4槟榔花中四种酚类物质对紫外损伤HSF细胞存活率的影响3.2.3细胞形态观察细胞结束培养后，采用倒置显微镜观察细胞形态。HSF一空白对照组HSF一紫外损伤组HSF-保护组，表儿茶素1ug/mlHSF-保护组，表儿茶素2.5ug/mlHSF-保护组，没食子酸5ug/mlHSF-保护组，没食子酸1ug/ml相差倒置显微镜下观察到，正常的人皮肤成纤维细胞为梭状，细胞形态规则、饱满。紫外损伤后，细胞增殖速度变慢，细胞形态发生变化，逐渐皱缩，而经表儿茶素和没食子酸保护后，损伤的形态逐渐变得正常，表儿茶素2.5ug/ml和没食子酸5ug/ml保护组细胞形态时已接近正常细胞的形态。3.2.4酚类物质对细胞线粒体膜肿胀度的影响由图5可知，紫外照射2h后，可损伤HSF细胞的线粒体膜，表现为A520nmmu值(即线粒体肿胀)降低，表儿茶素和没食子酸可抑制线粒体膜的肿胀度的降低，表明线粒体膜受到了保护。图5表儿茶素和没食子酸对HSF细胞线粒体膜肿胀度的影响3.2.5酚类物质对细胞中乳酸脱氢酶(LDH)图5表儿茶素和没食子酸对HSF细胞线粒体膜肿胀度的影响为了明确表儿茶素和没食子酸对紫外照射引起的HSF细胞损伤的保护作用，检测细胞内乳酸脱氢酶和柠檬酸合酶的活性。通过对标志酶LDH/CS活性的测定，表明HSF细胞中线粒体的功能完好性。在340nm处测吸光值，其中根据吸光值的下降，便可测得反应速率，表征LDH的活性。由图6可知，紫外照射2h

后，可影响HSF细胞的乳酸脱氢酶的活性，表现为A340nm值（乳酸脱氢酶活性）降低，紫外模型组仅为对照组的12.81%，表儿茶素和没食子酸可抑制乳酸脱氢酶的活性的降低。表儿茶素作用后，较紫外模型组有明显升高，酶活性提高了38.74%-45.36%，没食子酸作用后，较紫外模型组升高，酶活性提高了30.05%-79.02%。在412nm处吸光值的增加可用以确定反应速率，以表示柠檬酸合酶的活性。由图7可知，紫外照射2h后，可影响HSF细胞中柠檬酸合酶的活性，表现为A412nm值（柠檬酸合酶活性）降低，紫外模型组仅为对照组的7.06%，表儿茶素和没食子酸可抑制柠檬酸合酶的活性的降低。表儿茶素作用后，较紫外模型组有明显升高，酶活性为26.64%-43.25%；没食子酸作用后，较紫外模型组也有明显升高，酶活性为10.95%-35.07%。根据图6、7，表明表儿茶素和没食子酸对HSF细胞内线粒体的功能完好性都有保护作用，也就是说对紫外损伤HSF细胞有保护作用。0.0050.00450.0040.00350.0030.00250.0020.00150.0010.0005图6表儿茶素和没食子酸对图6表儿茶素和没食子酸对HSF细胞中LDH活性的影响0.010.0090.0080.0070.0060.0050.0040.0030.0020.001luc/al表儿拳亲0.010.0090.0080.0070.0060.0050.0040.0030.0020.001luc/al表儿拳亲I.□ue/oI表JL拳玄InE/0.1

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没食亍敏3.2.6酚类物质对细胞中线粒体超氧自由基含量的影响细胞中的超氧自由基其可引发DNA损伤、脂质的过氧化以及蛋白质的氧化等。线粒体的电子传递链在呼吸底物存在条件下，生成的未成对电子与氧气结合生成超氧阴离子。其与四唑盐NBT反应，生成的甲臌类显色物在570nm处有特征吸收。通过测定显色物的吸光值，可以确定线粒体生成的超氧化物的含量［31。如图8,紫外照射2h后，紫外模型组的吸光值明显升高，而加入表儿茶素和没食子酸进行保护后，A570nm处吸光值较紫外模型组要降低，说明表儿茶素和没食子酸能降低紫外损伤引起的细胞内超氧自由基的升高。图8表儿茶素和没食子酸对HSF细胞中线粒体超氧自由基含量的影响3.3讨论图8表儿茶素和没食子酸对HSF细胞中线粒体超氧自由基含量的影响本实验通过构建紫外照射对HSF细胞的损伤模型，探讨槟榔花中主要的酚类物质对HSF细胞的紫外损伤的保护作用，结果表明表儿茶素和没食子酸对HSF细胞具有保护作用，而香豆、芦丁对HSF细胞没有保护作用。实验结果进一步明确了槟榔花多酚的抗紫外损伤作用，进而为槟榔花多酚类物质的利用提供新思路。细胞内线粒体的各项表征能够间接表明HSF细胞受损伤和被保护的程度，线粒体掌控着细胞的死亡过程。近十多年的研究指出，线粒体是调控细胞的程序性死亡。“凋亡"(apoptosis)过程的关键因素。在凋亡信号的刺激下，线粒体mPTP开放、发生线粒体肿胀，膜电位降低，外膜破裂后释放出内外膜间隙中的诸多凋亡效应因子，起到了凋亡过程的“主开关”作用［32］，破坏细胞整体结构与功能，最终引发细胞凋亡El。实验发现紫外照射可导致HSF细胞线粒体膜肿胀度下降，使线粒体功能受到损伤，而表儿茶素和没食子酸均能降低紫外照射引起的这种损伤。实验还发现紫外照射会使线粒体标示性酶一乳酸脱氢酶(LDH)和柠檬酸合酶(CS)的活性下降，导致细胞内线粒体的功能完整性受损，而表儿茶素和没食子酸均能降低这种损伤。线粒体是细胞内主要的活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)来源和细