蛋白质组课件

蛋白质组刘慧彬2011.7.11蛋白质组基础知识介绍什么是蛋白质组？

蛋白质组（proteome）的概念最早由澳大利亚的MarcWilkins和KeithWilliams于1994年提出。它是指由一种生物体的一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。

荧光染色的细胞内蛋白质蛋白质组基础知识介绍20世纪90年代初开始的人类基因组计划已经取得了巨大的成就，人类基因组全序列已全部完成。但是，仅从基因水平研究生命现象是远远不够的，从DNA—mRNA—蛋白质，存在3个层次的调控，即转录水平调控、翻译水平调控、翻译后水平调控。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。而蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。因此，蛋白质本身的存在形式和活动规律仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。蛋白质组研究意义蛋白质组基础知识介绍蛋白质组研究背景第一次提出蛋白质组概念是在1994年，但相关研究可以追溯到上世纪90年代中期甚至更早。国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。蛋白质组基础知识介绍

2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（HumanProteomeOrganization，HUPO），随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划（HumanProteomeProject）。其中人类肝脏蛋白质组计划由中国发起和领衔。蛋白质组基础知识介绍蛋白质组研究内容蛋白质组研究可分为两个方面：对蛋白质表达模式(或蛋白质组组成)的研究。对蛋白质组功能模式(目前主要集中在蛋白质相互作用网络关系)的研究。

目前蛋白组学研究的主要内容包括:①蛋白质的发现与功能的明确;②蛋白质翻译后的修饰特征;③蛋白质结构分析;④蛋白质活性的调节;⑤蛋白质的相互作用及其构象研究;⑥蛋白质的转运分析以及亚细胞结构中的蛋白质分离;⑦蛋白质的表达分析;⑧生物信号转导与代谢途径分析。蛋白质组基础知识介绍蛋白质组学分析流程示意图蛋白质组研究平台蛋白质组基础知识介绍

蛋白组学研究的核心技术为:蛋白质组分分离技术,蛋白质组分的鉴定技术,利用蛋白质信息学进行蛋白质结构、功能分析及预测。目前,主要有三种常用的蛋白组学技术，即2-DE分离经胶上原位酶解后的质谱鉴定技术、特异性酶解后多维色谱—质谱联用蛋白质鉴定技术和抗体芯片表面增强激光解析电离法检测技术。虽然发展了几种途径的蛋白质表达分析技术,2D与MS结合仍是目前最经典也是应用最广泛的方法。蛋白质组研究技术蛋白质组基础知识介绍

到目前为止,人们最常用的分离蛋白质的方法主要有2种，二维凝胶电泳(2D-PAGE)和液相分离。20世纪70年代中叶建立的二维凝胶电泳(2D)技术能将蛋白质从复杂体系中有效地进行分离。2D包括两个步骤：①按等电点将蛋白质进行分离；②按分子质量将蛋白质进行分离。由于结合了蛋白质的两种特性，所以2D的分辨率得到很大的提高。1、蛋白质的分离

Principleof2D2D-GelElectrophoresisUVDetectorpHMonitorUVDetectorPA800MALDI/TOF1stDimensionChromatofocusingFractionCollector/Injector2ndDimensionReversePhaseESI/MSInjector工作原理：第一维色谱:离子交换色谱第二维色谱:反相色谱二维色谱分离技术（2D-HPLC）

3、凝胶图像采集与分析

图谱分析必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。

首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD(chargecoupleddevice)照相机；激光密度仪和Phospho或Fluoro-imagers，对图象进行数字化，并成为以象素为基础的空间和网格。其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测。利用laplacianGaussian,DOG(differenceofGaussians)opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。

图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。4、蛋白质组鉴定技术

与质谱(massspectrometry)相关的技术

氨基酸组分分析

图象分析技术(Imageanalysis)

微量测序(micro-sequencing)SampleInletIonizationMassAnalyzerMassSorting(filtering)IonDetectorDetectionIonSourceSample/MatrixdriedonMALDIPlate(AutoloaderCassette)DetectionsFormsions(chargedmolecules)SortIonsbyMass(m/z)质谱的基本组成元件DataProcessingVacuumEnvelopeRelativeAbundancem/z10002000MassSpectrumDataSystem质谱技术的应用蛋白质和DNA的序列测定分析复合体的蛋白质组研究蛋白质修饰分析单核苷酸多态性研究生物分子的相互作用鉴定蛋白质的三维结构ProteinsampleImageanalysisProteiningelProteinonmembraneProteininsolution2-DPAGEExcisionBlottingElutionPartialdegradationPeptidemixtureMassofproteinN-terminalsequenceMSEdmandegradationPeptidemassfingerprintPeptidesequenceMS/MSdataDatabasesearchingNovelorpreviouslystudiedproteinCharacterizationofpost-translocationmodifications蛋白质组的分析流程昆明动物所在抗菌肽研究方面取得重要进展

大量的抗菌肽已经从两栖动物的皮肤中发现，但从动物脑中很少报道。中国科学院昆明动物研究所赖仞研究员领导的课题组采用蛋白质组学结合基因组学的手段，从两种两栖动物（大蹼铃蟾和微蹼铃蟾）脑中识别了59种新抗菌肽分子，该研究表明两栖动物脑是重要的抗菌肽分子资源库。极端低温下新疆沙冬青蛋白质组学研究取得新进展

新疆沙冬青源于第三纪，为亚洲中部荒漠地区唯一的常绿阔叶灌木，抗寒和耐旱，能耐-30℃以下的低温，是我国特种植物化学成分（如抗冻蛋白AFP）研究、提取和转接的珍贵材料，已被列为国家二级濒危保护植物。中科院新疆生态与地理研究所吐鲁番沙漠植物园尹林克研究员及其团队开展了极端低温下新疆沙冬青的蛋白组学研究，结果发现在pH3-10的胶上，经过PDQuest图像分析软件平均可检测到500个左右的蛋白质点，对差异蛋白点进行胶内酶解，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行了鉴定，并采用RT-PCR验证了2-DE结果。搜索Unigene库及NCBI库共鉴定出8个蛋白质，主要是与抗性、细胞分化、代谢相关蛋白、蛋白酶、转录与翻译因子相关的蛋白。这一结果证实：极端低温下新疆沙冬青叶片中含有的与能量代谢有关的蛋白质在植物的抗冻过程中起着重要的作用。影响生物钟节律PRMT5蛋白质

阿根廷研究人员发现，一种蛋白质能通过参与某些生物的生长发育机制，影响它们的生物钟节律。阿根廷生理学、分子生物学和神经科学研究院的专家发现，十字花科植物—拟南芥的生物周期约为24小时；果蝇通常白天活动，夜晚休息。但研究者培育出了一种生物周期达到72小时的拟南芥，并通过红外线照射使果蝇在白天和夜晚都四处活动。此后，研究者重点检查了与这些拟南芥和果蝇的生物钟有关的生命活动物质，结果发现它们的PRMT5蛋白质都发生了变异。研究者指出，PRMT5蛋白质通过调控某些生物的基因转录、核糖核酸剪切和细胞增殖，保证有关生物正常生长发育。PRMT5蛋白质变异可导致与开花等重要生命活动有关的植物基因表达发生改变，导致开花提前或推迟，影响其正常生物节律。同样，与PRMT5蛋白质变异有关的另外一些基因变化，也会引起动物与时间概念有关行为的改变。大肠杆菌蛋白组及转录物单分子水平测量

哈佛大学化学与生物化学系谢晓亮小组最新的研究报道了大肠杆菌的1018个基因在单个细胞内的绝对表达数以及各个细胞间的差异，这些基因占了大肠杆菌全基因组的四分之一左右。他们还同时测量了其中137个大量表达的基因的mRNA分子数量。研究人员利用自己搭建的一套全新的大肠杆菌黄色荧光蛋白融合库，成功地实现了单个细胞内在单分子水平对整个表达谱范围内的蛋白和mRNA的定量分析。该项研究有两个惊人的发现。首先，20%的蛋白质表达水平很低，小于每个细胞一个分子。研究人员发现当表达水平较低的时候，几乎所有的蛋白分布均可用两个参数的伽玛分布来描述，也就是mRNA的转录速率和每个mRNA分子表达为蛋白质的数量。而当表达水平较高的时候，分布图被其他的外部噪音所充斥。另一重要发现是，单细胞中某基因在某一时刻的mRNA表达拷贝数与其蛋白表达拷贝数无关，由此可见，单个细胞中的蛋白组分析与转录物分析是没有关联的。由于细胞中某些功能基因的蛋白质和绝大多数mRNA的拷贝数都相当低，这项研究成果提供的方法将大大促进科学家对基因随机表达和调控的理解。首张酵母遗传图谱出炉

蛋白质通过相互作用来执行功能。但是某一信号通路或生物进程中关联的蛋白并不一定在物理上相互作用，因此蛋白之间的相互作用研究受到限制。通过了解遗传水平的功能相互作用，研究人员能更多地了解基因的功能，以及基因型如何翻译成表型。加拿大多伦多大学的Brenda

Andrews和Charles

Boone，以及美国明尼苏达大学的Chad

Myers一直以来都致力于这方面的研究。他们早在2001年就开发出合成基因阵列（SGA）方法，如今，他们利用此方法获得了一张酿酒酵母的大规模遗传相互作用图谱。通过研究540万个基因对，他们构建出基因组规模的遗传相互作用图谱，覆盖75%的酿酒酵母基因。SGA方法是系统检测双突变对酵母生存影响的高通量方法。酵母基因中的大多数是非必需的，也就是说，如果这些基因突变，其它基因将顶替它们，酵母仍能存活。SGA方法通过两个基因的双突变，鉴定出负面影响酵母生存的基因对，表明这两个基因可能包含在同一个生物进程中。干酪乳杆菌蛋白表达参考图谱

内蒙古农业大学教育部乳品生物技术与工程重点实验室，上海交通大学农生学院的研究人员采用双向凝胶电泳和质谱分析技术，首次完成了干酪乳杆菌不同生长期蛋白表达参考图谱。研究组2002年从内蒙古地区传统发酵酸马奶中自主分离、筛选获得1株性能优异的益生菌L.caseiZhang，在传统生理生化和基因组学研究基础上对干酪乳杆菌进行的蛋白组学研究。研究采用双向凝胶电泳和质谱分析技术，首次完成了干酪乳杆菌不同生长期蛋白表达参考图谱，分别获得了487±21（对数期）和494±13（稳定期）个蛋白点；发现了47个蛋白点在对数期和稳定期表现显著的差异表达。进一步分析显示，这些差异表达蛋白更多属于胁迫应答蛋白或细胞代谢中关键蛋白，推测它们在菌体生长和代谢，尤其抵御和适应乳酸或其它环境变化中起重要作用。哺乳动物卵母细胞发育蛋白质组研究突破

北京生命科学研究所(NIBS)高绍荣博士实验室研究了不同发育阶段小鼠卵母细胞的蛋白组学特点，为进一步鉴定卵母细胞重编程因子打下基础。卵母细胞具有非常强的重编程能力，它可以在短短几个细胞周期内把高度分化的体细胞重编程为了具有全能性的克隆胚胎并可以进一步发育成为克隆动物。然而卵母细胞中究竟有什么重要的重编程因子还不清楚，要想了解哪些蛋白是卵母细胞重编程过程所需要的蛋白，就需要对卵母细胞蛋白质组做深入研究。但是由于取材的限制，已知的卵母细胞蛋白表达图谱只发现几百种蛋白。本课题组在应用LC-MS蛋白质谱方法对每组7000个未成熟的GV卵母细胞、成熟的MII卵母细胞和受精卵进行研究，该研究在GV、MII、受精卵中分别鉴定发现了2781、2973、2082种蛋白，同时也分析了不同发育阶段卵母细胞对应的表达丰富的信号通路。研究组发现在成熟的卵母细胞中比其他时期表达更多的转录因子和染色体重构因子。同时也发现了卵母细胞发育和受精所需要的许多营养物质和信号通路，为了解胚胎早期发育、体外培养卵母细胞和不孕不育的研究和治疗提供了一定的基础。线虫体内有控制