色谱分析一般步骤课件

色谱分析的一般步骤

色谱法分离的基本原理

色谱法分离的基本原理是基于组分通过互不相溶的两相而达到分离的。即样品溶解在流动相(MobilePhase)中，从装填在柱子中或涂渍在载体表面的固定相(StationaryPhase)上通过，依据组分与固定相之间的相互作用力的不同，经过充分的运行时间，它们即可被分离。色谱法是一种分离技术，这种分离技术应用于分析化学中，就是色谱分析。

最早的色谱分析法是俄罗斯植物学家Michail-Tswett在1906年，将碳酸钙装填在玻璃管(也称为色谱柱，Column)内，石油醚洗脱，用于分离植物叶子中的叶绿素，植物叶子的提取液在通过柱子后，在柱床上出现了不同颜色的色带，因此他将这种方法命名为色谱法(Chromatography)。这就是最早使用的柱色谱法。

薄层色谱法

(thinlayerchromatography，TLC)

薄层色谱法基本原理

TLC是20世纪50年代从经典色谱法及纸色谱法的基础上发展起来的一种微量分离分析方法。

TLC法具有设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观等优点。

定义固定相（吸附剂或载体）涂布成一均匀薄层，点样，在装有流动相的密闭的容器中展开，斑点显色，与对照物质比较进行定性定量分析。

特点快，需十至几十分钟，同时展开多个试样。试样预处理简单，对试样限制少。仪器简单，操作方便。分离能力较强。灵敏度较高主要技术参数比移值相对比移值分配系数分离度相对比移值(relativeRf；Ri,s)

Ri,s=b/a与组分、色谱条件、参考物质有关。Ri,s值可以大于1，也可以小于1。重现性和可比性均比Rf值好，能消除系统误差（参考物质与组分在完全相同的条件下展开）ba(b)Ri,s值参比物i被测物s原点前沿×

分离度

两个斑点中心距离与其平均宽度之比。

薄层色谱法操作流程吸附剂或载体的选择及薄层的制备点样展开定位定性定量色谱前衍生化薄层板预平衡薄层板的预处理样品的制备

最基本材料及设备

滤纸及薄层板

涂布器点样器展开室显色器薄层扫描仪吸附剂的选择根据分离物的性质选择固定相。常规吸附剂：硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素、聚酰胺、离子交换纤维素、葡萄糖凝胶等。硅胶化学分子式为mSiO2·nH2O,多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。活度与含水量的关系：

含水量高，活性级高，活度低。活化：

加热至110℃左右，除去吸附水提高活度。分离效率：

与其粒度、孔径及表面积等有关。氧化铝碱性氧化铝(pH9.0)：分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维生素等；中性氧化铝(pH7.5)：分离酸性及对碱不稳定的化合物；酸性氧化铝(pH4.0)：酸性化合物的分离，活度也与含水量有关。展开剂

选择原则：根据被分离物质的极性Stahl简图：极性物质—活度低（活性级大）的吸附剂--极性展开剂展开剂先用单一溶剂展开，若Rf值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，如果Rf值太大，则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、石油醚等)，以降低极性。可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起的凹坑和裂纹。例：硅胶板（粒度10～40um）硅胶G——将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一般为1份固定相与3份水)，迅速研磨均匀，立即涂铺。硅胶或硅胶G——以CMC为黏合剂。配制0.3%～0.8%CMC水溶液,放置过夜,使悬浮的纤维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。薄层板活化涂布后的薄层先在室温下阴干，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有不同。如：硅胶110℃0.5-1h氧化铝110℃30min点样(关键点)要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍～几十倍为宜。手工点样工具：定容玻璃毛细管（1–5ul），微量注射器。检测物理方法——紫外光下显示荧光或荧光淬灭化学方法——加化学试剂显色，要求显色稳定、持久、专属、灵敏。定性和定量分析定性分析比较Rf值或Rr值、斑点颜色或荧光常采用已知标准物质对照（同一板上展开）多种展开系统的Rf值与对照品一致。定量分析

洗脱法直接定量法

1.目视比较法（如杂质限度检查方法）

2.薄层扫描法参考文献杜斌、张振中，现代色谱技术，河南医科大学出版社，第108—151页（2001）.A.Elatkis著，洪筱坤、王智华、曾一译，《层析理论与应用》，上海科学技术出版社，第122—126页（1981）.CamagCatalogue,“InstrumentalThinLaterChromatography”,TL-9-E(1981).D.Nurok,R.M.Becker,K.A.Sassic,Anal.