基因操作的主要技术原理课件

第二章基因操作的主要技术原理

基因操作技术主要包括（1）DNA分子的切割、连接、转化（2）核酸分子杂交，凝胶电泳以及序列分析，基因的人工合成，PCR扩增等第一节核酸的凝胶电泳第二节核酸分子杂交第三节细菌的转化第四节DNA序列分析第五节基因扩增第六节基因的定点诱变第七节蛋白质与DNA相互作用的研究方法在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。2、琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶：

琼脂糖是从海藻中提取处理出来的一种线性聚合物。（1）琼脂糖——海藻中提取的线性高聚物，电泳中EB染色，紫外灯下1ngDNA可以被检测到分离作用依赖于DNA的分子量及构型凝胶的种类及浓度对被分离的DNA的分子大小有影响琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中

DNALadder的形成PCR产物的琼脂糖电泳（3）影响DNA迁移率的因素①DNA分子量大小线状DNA分子的迁移速率与其碱基数目以10为底的对数值成反比。分子量越大，摩擦力越大，越难于在凝胶空隙中蠕行，迁移得越慢。②琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA片段，其迁移速率在不同浓度的琼脂糖中各不相同。③

DNA的构象分子量相同的超螺旋环状，带切口的环状及线性DNA通过凝胶时速度不一。熔点在65oC的琼脂糖凝胶，熔解后可在37oC保持液体形态，可直接用来回收DNA分子。（4）低熔点琼脂糖（LMP）LMP中的DNA分子加入苯酚抽提65oC加热熔解LMP形成沉淀，DNA在上清离心分离3、聚丙烯酰胺凝胶电泳①用于分离和纯化双链DNA的非变性电泳②用于分离和纯化单链DNA的变性电泳，凝胶中加入抑制碱基配对的试剂（尿素、甲醛）（2）聚丙烯酰胺凝胶分离范围如下：（4）检测方法

EB染色放射自显影硝酸银染色

聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析4、脉冲电场凝胶电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE）用于分离超大分子量的DNA，可分辨达到107bp的DNA分子原理：电场方向，电流大小和作用时间都在交替变换，使DNA分子能够随时调整其泳动方向，以适应凝胶孔隙的无规则变化45o夹角PFGEcanresolvelargeDNAfragments溴化乙锭（EtBr）

一种具扁平分子的核酸染料，可插入到DNA或RNA分子的碱基之间。在300nm紫外灯照射下发射出荧光。6、其他染色方法SYBRGreenI核酸染料高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无需脱色或冲洗。至少可检出20pgDNA，高于EB染色法25-100倍。SYBRGreenI与dsDNA结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBRGreenI染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。可适用于多种电泳分析。SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。银染色银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.

也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收.DNA条带大小及量的估算5000（bp）300020001000750500250100基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水（0.1％焦碳酸二乙酯）来配制所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。6、RNA电泳第二节核酸分子杂交

核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。一、DNA/DNA印迹杂交——SouthernBlot1、原理

将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫SouthernDNA印迹转移技术

如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。2、SouthernBlot操作步骤DNA琼脂糖电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或显色80℃烘干1～2hr紫外线交联法：利用DNA分子上一小部分的胸腺嘧啶残基同尼龙膜上的带正电荷的氨基之间形成交联键。

转移方法电泳凝胶预处理：为了使大小不等的DNA都得到转移，要对凝胶作预处理，用0.25MHCl在溶液中作短暂的脱嘌呤处理后进行碱变性，使DNA分子发生断裂利于转移，并且碱性条件下的单链状态易于杂交放射自显影照片SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片

水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。二、RNA/RNA印迹杂交－Northernblotting1、原理

1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northernblotting。2、操作过程mRNA提取甲醛变性电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或化学发光三、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交

斑点印迹杂交（dotblotting）和狭线印迹杂交（slotblotting）是在Southern印迹杂交的基础上发展的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置（多孔过滤进样器），使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。DotblotSlotblot

仪器SampleDNA点阵DNAchip

芯片ResultofanalysisDNA(cDNA,synthesizedoligonucleotide)Fluorescencelabeledsamples（cDNA）检测重组体克隆的菌落杂交技术5、菌落杂交核酸杂交常用几种膜的性能比较四、Probe(探针)

NotesProbeisaspecificDNAorRNAfragmentwhichcanbindwiththesampleDNAorRNAfordetection.eg：ATCCGATCGSourceofprobesynthesized,cloninggenomicDNAorcDNA,aswellasRNA.Probemustbelabeled(标记)beforehybridization.radioactive——αorγ32Pnonradioactive——biotin,digoxigenin(地高辛),fluorescentdyeInasinglestrandedformforhybridization核酸分子杂交法的技术路线比较菌落原位杂交菌落或噬菌斑转印到膜上抽提DNA/RNA提取DNA提取RNA裂解细菌或噬菌斑变性核酸样品琼脂糖凝胶电泳变性DNA将核酸点加到膜上将凝胶上核酸条带转移到膜上，同时变性将核酸固定在膜上→预杂交（消除非特异吸附位点）→加入核素标记探针进行杂交→漂洗膜（洗去非特异结合探针）→放射自显影或显色反应示踪斑点杂交Southern印迹Northern印迹一、转化——以质粒作为克隆载体将目的基因导入宿主细胞1928年,Avery首次开展了肺炎球菌的转化试验感受态细菌——是指细菌处于容易接受外源DNA的状态。有的细菌在生长周期任何时候自动产生如枯草、嗜血杆菌。有的在对数生长期发生，如E.coli。产生机制不明。第三节细菌的转化转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。常见转化方法有原生质体转化法；化学转化法；电穿孔法。（一）原生质体转化法除去细胞壁后加外源DNA，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。例如：酵母细胞的转化利用蜗牛酶、松解酶等消化酵母细胞形成原生质体，在聚乙二醇和氯化钙的作用下，使DNA被俘获。（二）化学转化法1970年Mandel和Higa首先用CaCl2经短暂的热休克后，可使外源DNA转入E.coli。通常转化效率可达105-107转化子/μgDNA。大肠杆菌在0℃的CaCl2溶液中形成原生质球使之呈感受态（CompetentCells）加入DNA，42℃做短暂休克（90s），黏附在细胞表面的DNA进入筛选转化子，质粒DNA中的抗生素是筛选标记1、原理

用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形，外源DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物而被吸附，经短暂42℃热休克，易于进入胞内而不被降解。（三）电穿孔法原理：利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面形成暂时性的微孔,质粒DNA可乘隙而入,在脉冲过后,微孔复原。比CaCl2法操作更简单，转化效率高（一般可达109～1010个转化子／μgDNA）,不仅无需制备感受态细胞,而且适用于任何菌株。二、细菌转化频率影响因素：1、DNADNA浓度、纯度、构型2、转化的条件温度、pH、离子强度等3、限制修饰系统一般选用寄主控制的限制和修饰系统上有缺陷的突变体，hsdR-和hsdM-突变体。三、真核细胞的转染1、转染方法磷酸钙沉淀DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染；人造膜显微注射2、筛选标志

tk-NeorG418瞬时转染目的基因不整合进宿主基因组稳定转染目的基因整合进宿主基因组磷酸钙沉淀法:Ca2+促进哺乳动物细胞吸收外源DNA细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力，将待转移的DNA加入氯化钙和磷酸盐，生成DNA-磷酸钙沉淀，加入培养液中，由于细胞的吞噬作用，DNA-磷酸钙沉淀物进入细胞，DNA释出后先进入细胞质、再进入细胞核。微量注射：一台仪器每小时注射500-1000个细胞，约50%的细胞能稳定地整合并表达，任何DNA都可注射到任何细胞中，效率高，不需筛选压力，但需要昂贵的仪器，技术复杂，难以掌握。脂质体介导法脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂类双分子层围成的囊状结构

·形成囊状结构可将DNA包在其中

·带有外源DNA的脂质体通过细胞的内吞作用进入受体细胞，达到基因转移的目的电转移法

受体细胞与外源DNA按一定比例混合后，放入电脉冲槽中，经用脉冲电压刺激，外源DNA即可进入细胞（或受精卵）neor新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质合成，对真核生物没有抑制作用G418：新霉素的类似物G418对真核细胞及原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真核细胞中表达并能使G418失活（neo基因编码磷酸转移酶），细胞可以生长。neo：新霉素抗性基因，磷酸转移酶，使G418失活neo与目的基因连锁，转染3、真核细胞的筛选标记新霉素类药物G418筛选AmNeoPoriG418（-）蛋白质合成1、Sanger的双脱氧链终止法Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列。其基本原理如下：

①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。一、DNA链末端合成终止法第四节DNA序列分析2、双脱氧－M13体系DNA序列分析法

M13含单链DNA，在细菌内形成双链环状DNA（RF）。成熟噬菌体含单链DNA分泌到培养液中。双链DNA（RF）：克隆载体，按提取质粒方法从细菌中制备单链DNA：测序模板，从培养基的上清中提取目前常用的M13mp18注意：1、胶放射自显影后读序列，变性序列胶浓度20％左右PAGE2、胶上读出序列为测序链的3’——5’方向3、引物标记3’5’ddTddAddGddCAAAAACAACGAACGGAACGGTAACGGTAAACGGTACAACGGTACAAACGGTACAC二、Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)

该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。

硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使DNA链中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位发生甲基化，在中性pH环境中就能使糖苷键发生水解，并引起DNA链的断裂。加入六氢吡啶断裂G；在碱性条件下，肼能特异性切割C和T。如果加入1mol/L的NaCl，那么，只有C被特异性切割。硫酸二甲酯——A＋G硫酸二甲酯————G肼——C＋T肼————C中性六氢吡啶碱性1MNaCl放射性标记：5’端：T4多核苷酸激酶3’端：T4DNA聚合酶决定从胶上读出的顺序

反应试剂G反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸T+C反应：肼C反应：NaCl+肼Maxam-Gilbert化学修饰－CS载体系统DNA分析pSP64CS载体：在其同DNA克隆片段相邻的位置有一个核酸内切酶位点，Tth111Ⅰ，位点GACN↓NNGTCCGACTGAGTCCTGACTCAGGACTGAGTCCTGACTCAGABTth111Ⅰ酶切Klenow大片段选择性标记3’末端[32p-dNTP]GACTGAGTCCTGACTCAGGACTGAGTCCTGACTCAGGAGTC*CTCAGGACTG*CTGAC优越性：1、切割DNA后产生突出的5’端，所以补平后每个末端只有一个放射性标记2、Tth111Ⅰ非常稀少，不会对测序DNA造成影响3、在载体中有两个Tth111Ⅰ位点，即可以对其位点间的DNA测序不需要进行体外酶切，只要使用具有末端标记的DNA，单、双链都可以测序；不同的末端标记方法，可以读出彼此互补的两条链限制于序列胶的分辨能力Maxam-Gilbert化学修饰法优点三、DNA自动测序采用荧光（四甲基若丹明，Tetramethylrhodamine）替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。DNA的测序仪示意图computeranalysis凝胶中DNA移动方向样品槽激光器输入光学系统成象透镜聚焦透镜高灵敏度相机旋光镜/棱镜组件多色荧光标记毛细管电泳

单色荧光标记平板电泳同位素标记平板电泳ACGTACGT测序图谱TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

C

T同位素标记到荧光标记，平板电泳到毛细管电泳一个样本，1个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的ddNTP(终止子)unlabeledprimertemplateDNA+AmpliTaqFSdATP,dCTP,dGTP,dTTPddCTPddATPddGTPddTTP

测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进行纯化，除去过量的ddNTP后上样。一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP

反应结束后，将4管反应液混合，经乙醇沉淀后上样DNA自动测序结果举例四、DNA杂交测序法(SBH-Sequencingbyhybridization)

如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。用一组已知系列的寡核苷酸短序列做为探针，同某一较长的靶DNA分子杂交，从而测定其序列。避免的传统测序的酶切或者化学反应一种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer寡核苷酸控针混合杂交，在48=65536种8-mer的探针群体中，仅有5种探针会与靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。

没有完全互补的会形成不稳定的双链分子，杂交效率会明显下降寡核苷酸矩阵芯片（SHOM）通过连接在DNA末端的活化接头与玻璃或者凝胶共价结合，把寡核苷酸固定成二维阵列形式，做成测序芯片，可以用来进行有效的DNA杂交。杂交的检测（图2-18）探针以同位素或者荧光标记，可用磷光成像仪和特定软件分析。当靶DNA与标记探针形成G-T或G-A末端碱基错配的双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越短，碱基错配造成的去稳定效应越明显，较易与完全的双链体分子相区分。但是，探针短，杂交产物的总体稳定性下降，信/噪比下降，影响结果的可靠性。6-mer寡核苷酸矩阵芯片只能用于测定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。

新一代高通量测序一、PCR技术的创建（polymerasechainreaction）KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。

1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术

1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年

Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。第五节基因扩增KaryB.Mullis三篇重要论文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)

二、技术原理1、原理DNA以指数方式扩增。扩增的公式为:

Nf＝No（1＋Y）n

式中

N0——起始拷贝数

Y——扩增效率;n——循环次数。RateofPCR2nNo＝1Y＝1Nf＝2nInitial

DNA

8421NumberofDNAmolecules靶序列Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’靶序列Primer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。TypicalPCRThermalProfile*ThiscycleisnormallyincludedinaPCRassayinordertoallowany“unfinished”productfrompreviousamplificationtoachieveitsfulllengthReactionConditionforaTypicalPCRAssay2、SomeDNAPolymerasesUsedinPCRKlenowfragmentofE.coli

则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。

Taqpolymerase，则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。

pfu，从海洋附近火山口生活的细菌中发现，比Taq具有更高的扩增准确性，具有3’-5’外切酶活力，可以修复错配。①KlenowfragmentofE.Coli最适反应温度37℃，容易使DNA引物与模板之间形成非专一的碱基错配，或容易受某些DNA二级结构的影响，在扩增结果中产生非特异的DNA条带，降低特异性。在变性温度下会失活，需要不断添加酶72℃94℃55℃PCR循环②TaqDNA聚合酶水生栖热菌(Thermusaquaticus,Taq)的DNA聚合酶

5’3’DNA聚合酶活性无3’5’外切酶活性，35轮0.25%错配，与原始模板有差别；最适聚合酶温度72℃，连续保温30min具有相当活力，选择72℃延伸半衰期：92.5℃130min95℃40min97.5℃5－6min

变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性CharacteristicsofTaqPolymerase

1-2kb/min②pfuDNA聚合酶耐热5’3’DNA聚合酶活性3’→5’外切酶活性精确度：pfu>Taq

但pfu扩增效率通常比Taq酶略差文献报道：Taq+pfu会起到较好效果3、引物人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，Tm值要相近，每条10-50pmol/100l

◆设计原则：（1）引物长度

15～30个碱基引物太短，可能同非靶序列杂交，产生非特异条带例如：长8bp引物，平均每隔48＝65536个bp会出现一个结合位点，在3×109bp的基因组中会有可能43000个结合点；长17bp的引物，平均每隔417＝1.7×1011个bp会出现一个结合位点，在3×109bp的基因组中会有可能1个结合点5'GCTCCATGACCCAGGCGATCTTTTGAGTCCAA3'3'CGCTAGAAAACTCAGGTT5'下游P上游P5'GCTCCATGACCCAG3'5'-TTggACTCAAAAgATCgC-3'正链5’3’负链3’5’（2）靠近5’上游Primer与双链DNA正链相同，3’下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同。（2）Primer本身不要出现内部互补序列形成loop环，内部二级结构如：

GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意减少Primer间互补序列导致2个Primer形成dimer

一般不要超过3个互补bp

如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC修饰如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果

突变：

AGCTCCATGACCCAG

5’CGCTCCATGACCCAG3’

注意：绝不可以在3'端进行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸（4）Primer5’未端可修饰、突变（5）primer5’端增加碱基

①内切酶识别点：（G）GAATTCGCTCCATGACCCAG↑保护bp作用：对PCR产物cloning有很大好处便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同

EcoRI1BglII2-3XbaI2-3HindⅢ>3BamHI2-3PstI>4XhoI>4NotI>10

如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆，若未切开，连接不上。

②ATG起始密码③TAA、TAG、TGA终止密码如：可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。（6）简并引物由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间有一个或数个核苷酸的差异。需要注意变性温度，以避免引物与模板的错配，可以采用“热起始”法：把混合物加热到72℃，然后加入TaqDNA聚合酶。热启动PCR：把PCR混合物在显著低于Tm的温度下哪怕做短暂的保温也可能产生引物二聚体和非特异性配对，采用热启动PCR，在第一个循环中等温度升高到超过反应物的Tm后再加入酶，减少错配。（7）嵌套引物为了尽可能的减少非靶序列的扩增利用第一次PCR扩增的产物做为第二次扩增的模板。4、模板

DNAmRNA→逆转录→cDNADNA包括：质粒、噬菌体、染色体DNA

哺乳动物基因组：0.1～1μg，对于可再现PCR，建议DNA用量少于10μg

细菌基因组或者质粒：pg（10-12）到ng级（10-9）直接以细胞为模板，例如直接从人1×105人细胞中（预先用蛋白酶打开）直接扩增出黄磦呤-鸟磦呤核糖转移酶基因（HPRT）一个片段。防止交叉污染5、dNTP四种脱氧核苷酸，基本原料终浓度：50M注意：不稳定，保存时间长会失效6、Mg2+（1）不同的酶需不同Mg2+Taq：TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+较少，Mg2+

对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度

pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍（2）外界影响：

EDTA鳌合Mg2+∴选较低浓度TE(10mMTris-HCl，1mMEDTA)；

DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+有效浓度。∴如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的Mg2+浓度。7、温度和时间（1）变性温度：94-95℃Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑（2）退火：温度越高，扩增特异性越好取决于Tm值：Tm↑退火T↑Tm↓退火T↓

若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度（3）延伸：500nt——1min500nt——3min

一般：40－60sec三、指数期PCR在大多数情况下，一旦目的片段达到1012（Nf），每次循环的效率（Y）就大大降低，产物停止指数积累；效率的降低可能反应了酶已经成为反应的限制因素，此期以外的扩增通常导致非特异性条带的扩增、小的缺失突变体出现。等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.Nf＝No（1＋Y）nN0＝105107109101110131002030405060Nf＝No（1＋Y）n过渡扩增靶序列数Nf循环数nPCR过程中靶序列的积累与循环数之间的关系，在标准Taq反应体系下，以105

（N0）基因为模板，分别在20，25，至60个循环（n）取出2.5μL，在PAGE上分析，根据EB染色后带的密度估计每阶段产生的靶序列数Nf，在30个循环时加入Taq酶。是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。已知序列未知序列未知序列三、PCR技术的研究应用1、反向PCR

用在靶DNA内无切点的内切酶从该区段的两端切割，产生带有靶DNA的片段（<2～3kb）用连接酶把切割片段连接成环形分子按靶DNA序列设计一对向外的引物，用其与靶DNA5’端互补作用进行PCR扩增，扩增得到靶序列两侧的序列。引物1引物22、不对称PCR为了获得更好的PCR产物直接测序结果，有时采用不对称PCR方法。在一个PCR反应体系中，把一个引物减少到常规用量的1/50左右（称为限制性引物）。其最佳比例一般是0.01∶0.5μM在前十几个循环中，扩增合成一定量的双股DNA，限制性引物被逐渐耗尽。在后十几个循环中，只有加入了常规量的那个引物与模板形成复合物并发生链延伸，只合成单股DNA，可以此单股DNA为模板用末端终止法测序。（图2-38）适用引物合成新链加热、引物退火加热、引物退火无适用引物反应结束，体系中高浓度引物合成的DNA比限制引物多，并且是单链形式3、RT-PCR在mRNA反转录之后进行的PCR扩增基因mRNA蛋白质多肽链①RT-PCR——应用mRNA反转录扩增cDNAmRNA的分离AAAAcDNA的合成p1Oligo(dT)引导AAAAAAAATTTTT基因特异性引物引导随机六核苷酸引物引导N6AAAAcDNA的合成p1Oligo(dT)引导AAAAAAAATTTTT基因特异性引物引导随机六核苷酸引物引导N6RNaseH处理mRNADNAAAAAp1RNA被降解成小片段加入上游引物引导cDNA第二链合成DNA双链p1p2p1’②荧光定量PCR技术

在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。SYBRGreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。4、RAPDRAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列（通常数百个）不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（通常为10聚体）为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增。聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。

RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，对于任一特异的引物，它同基因组DNA序列有其特异的结合位点。这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3‘端相距在一定的长度范围之内，就可扩增出DNA片段。如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。若位点2处碱基发生改变RAPD电泳结果图

使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。一、盒式诱变（cassettemutagenesis）包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。第六节基因的定点诱变（site-directedmutagenesis）1、盒式取代诱变利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒取代野生型基因中的相应序列。寡核苷酸盒：由两条合成的寡核苷酸组成，当他们退火时，会按着设计形成克隆需要的粘性末端。寡核苷酸盒EcoRIHindIII2、利用掺假的寡核苷酸进行的盒式诱变在不正确的核苷酸能够低频率的掺入条件下，合成了两条具有30bp可以和GRE（糖皮质激素效益元件）互补的寡核苷酸序列。二、寡核苷酸引物诱变

（一）诱变原理

1、应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分。2、引物引物与目的基因形成的双链结构稳定性决定于碱基的组成，核苷酸的错配和引物的长度，引物长8～18个核苷酸。3、聚合酶错配碱基要得到保护，避免受到大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ5’→3’外切酶删除，使用Klenow可以消除5’→3’外切酶活力。3’端还有错配碱基以外的碱基可以抵制DNA聚合酶Ⅰ3’→5’外切酶活力利用M13载体的好处：可以简单快速的分离到单链的模板，并且可以用放射性同位素标记的诱变寡核苷酸做探针，可以容易的筛选出突变体克隆（二）诱变过程1、正链DNA的合成2、突变引物的合成3、异源双链DNA分子的制备

Klenow酶和T4DNA连接酶退火在低温下进行，因为形成的双链短、有错配不稳定。4、闭环双链DNA分子的富集单链和具有切口的双链M13转化E.coli有较高本底运用SI核酸酶处理5、转化产生两种转化子，一种野生型，一种突变型6、突变体的筛选杂交筛选，用放射性同位素标记的诱变寡核苷酸做探针7、突变基因的鉴定（三）局限性突变效率受到多种因素制约①异源双链分子中含有没有配对的非突变单链模板及局部双链DNA分子②经过体内DNA复制后，异源双链DNA分子经过半保留复制后，会产生出突变体和非突变体的混合群体。（四）提高突变效率的方法理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡核苷酸定点诱变时，所形成的噬菌体中携带突变基因的应为一半。但实际上，由于技术上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基因的噬菌体。因此，为了获得更多含有突变噬菌体的噬菌斑，必须提高突变体的比率。目前已有多种改良的寡核苷酸定点诱变方法，此处将Kunkel于1985年建立的方法做以简单介绍。1、Kunkel定点诱变法是一种通过筛除含有尿嘧啶的DNA模板链进行的寡核苷酸定点诱变法。原理：①将待突变的基因克隆入RF-M13DNA载体上，导入具有dUTP酶（dut-）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（ung-）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株中。②dUTP酶缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代，然后进行DNA定点诱变。③双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基。结果原来的M13模板链被降解，只有突变链因不含U，被保留下来。这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。2、硫代磷酸诱变法利用AvaⅠ，AvaⅡ，BanⅡ，HindⅡ、NciⅠ，PstⅠ，PvuⅠ等酶无法切割硫代磷酸DNA分子的方法建立。POOHOOHPOOOHPSOCH2OHOOH碱基硫代核苷酸

将寡核苷酸与M13退火，在具有硫代核苷酸的反应条件下，由DNA聚合酶催化延伸，突变体链是硫代磷酸化的DNA；连接酶封闭切口；用NciI切割，只能切割亲本链；核酸外切酶局部消化进行聚合反应三、PCR诱变1、重组PCR定点诱变①设置两个反应管，在每一个反应管中加入两种特定的引物，其中引物A和A’均含有错配核苷酸，但两个引物其他序列与质粒DNA的不同链完全互补，引物B和C均不含有错配核苷酸；②进行PCR扩增获得含有突变碱基的DNA分子；④将两个反应管中的DNA混合，再经过变性和复性，一个反应管中的一条链和另一个反应管中的互补链杂交，形成两种杂交分子1、2；⑤其中1具有5’端凹陷，不能做为DNA聚合酶的底物，2具有3’端凹陷，做为DNA聚合酶的底物，延伸为完整双链；⑥用B和C做引物进行PCR。122、大引物诱变

以第一轮的PCR产物做为第二轮的引物；

TaqDNA聚合酶的保真性不高，需要经过测序确定正确性。第七节蛋白质与DNA相互作用的研究方法（一）凝胶阻滞实验（Gelretardationassay），又称DNA迁移率变化试验（DNAmobilityshiftassay，DMSA）1、原理DNA与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断DNA是否与蛋白质发生结合2、步骤（1）放射性同位素标记的DNA与蛋白质温育；（2）加样至非变性PAGE，控制条件使DNA与蛋白质保持结合；（3）放射自显影bac3、竞争DNA的作用

反应体系