鸡绿脓杆菌的分离鉴定与毒力试验

第6页共6页鸡绿脓杆菌的分离鉴定与毒力试验【摘要】：^p：20________年～20________年临床上从鸡场分离到15株绿脓杆菌，进行细菌的鉴定，调查鸡群中绿脓杆菌的血清型，了解鸡群发病情况，鸡群中绿脓杆菌主要存在三种血清型，其中G型最多，有11株，占总数的73.3%，B型次之，有3株，占总数的20%，C型最少，1株，占总数的6.7%。分离菌株进行小白鼠的毒力试验，观察绿脓杆菌的毒力，不同菌株对小白鼠的毒力不一样，其中G型最小致死剂量2____107CFU/0.3ml，B型最小致死剂量5____107CFU/0.3ml，C型最小致死剂量10____107CFU/0.3ml。【关键词】：^p：鸡；绿脓杆菌；鉴定；毒力中图分类号：S858.31文献标识码：B文章编号：2096-3637（20________）04-0006-03绿脓杆菌病是由绿脓杆菌引起的一种人畜共患病。绿脓杆菌又叫绿脓假单胞菌，属于假单胞菌科假单胞菌属。绿脓杆菌是一种条件致病菌，常见的眼观症状是在感染后可见到绿色的浓汁，所以称为绿脓杆菌。机体抵抗力低的时候容易发病，特别是集约化养殖的鸡场以及鸭场绿脓杆菌的发病率较高，常常引起急性败血症死亡[1]。绿脓杆菌革兰氏阴性小杆菌，不产生芽孢，只有一根鞭毛，显微镜运动活泼。广泛分布于土壤、水和空气中，潮湿的污水中常年存在，该菌营养要求比较低，一般的环境都可以生长，可感染众多哺乳动物、禽类、爬行类和鱼类[2]，一般情况下健康的人和动物不患病，但是在机体抵抗力低下时容易引发绿脓杆菌病，有时是天气变化、转群、疫苗免疫等等应激因素促进该病的发生。雏鸡容易感染绿脓杆菌[3]，造成严重的经济损失，感染后的症状主要是发病急促、病程短、精神沉郁、衰竭、脱水、皮下水肿[4]。绿脓杆菌容易检测和治疗，但是使用抗菌药物治疗后，原来的敏感抗菌药物容易变成耐药[5]，疫苗的使用将是以后的研究方向。1材料和方法1.1试验菌株20________年～20________年从发病养殖场分离到的绿脓杆菌15株1.2试验动物18～22g小白鼠，购自山东大学实验动物中心；7日龄鸡，购自济南章丘某养殖场。1.3器材生物安全柜，苏净安泰，型号BSC-1600IIA2；基因扩增仪，杭州博日科技有限公司，型号TC-96/G/H（b）c；显微镜，奥林巴斯，型号C____-31；恒温培养箱，三洋，型号MCO-15AC；全自动样品快速研磨仪，上海净信科技，型号Tiss-24。微量药敏片，购自杭州天和生物试剂有限公司；绿脓菌素鉴定培养基、营养琼脂、麦康凯琼脂、马丁肉汤粉，购自青岛海博试剂公司；细菌微量生化反应小管，购自北京路桥试剂公司；B型、C型、G型绿脓菌素阳性定型鉴定血清，购自日本力生株式会社；牛血清，购自济南劲牛试剂公司；高压锅、超声波清洗机、解剖台、解剖刀、剪刀、酒精灯、接种环、试管，实验室常备物品。1.3.1细菌分离与鉴定发现精神沉郁、衰竭、脱水，眼睛肿、皮下水肿病鸡进行检测，着重检测绿脓杆菌，无菌条件下取肝脏，接种10%血清的营养琼脂平板，37℃温箱培养16h，观察细菌细菌生长情况。疑似绿脓杆菌的菌落再进行细菌革兰氏染色，观察细菌形态，转接绿脓菌素鉴定培养基、麦康凯琼脂、绵羊鲜血培养基，记录细菌状况和生长特性。1.4生化试验将分离的疑似绿脓杆菌的细菌全部进行生化试验。1.4.1氧化酶试验加2滴1%四甲基对苯二胺试剂于滤纸上，用牙签挑去1个菌落到纸上涂布，若5s内由粉色变为黑色，则判为阳性。1.4.2触酶试验取干净的载玻片，在上面滴加1%过氧化氢溶液，挑取一环斜面培养的分离菌，在过氧化氢溶液中混合，若有气泡则触酶试验阳性。1.4.3硝酸盐还原试验先制备溶液，甲液：甲基萘胺0.6g，5mol/L冰醋酸100ml，稍加热，脱脂棉过滤，放棕色瓶。乙液：对氨基苯磺酸0.8g，用5mol/L冰醋酸30ml溶解对氨基苯磺酸，定溶至100ml，放带玻璃瓶塞的玻璃瓶中。把菌接种在硝酸盐培养基中，37℃培养24h，加甲液和乙液各3滴，30s出现红色则为阳性，若无颜色加少量的锌，随后出现红色则为阴性。1.4.4脂酶试验将菌接种在含维多利亚蓝的脂酶中，35℃培养24h，培养基颜色变为蓝色，则脂酶试验阳性，无颜色或者粉色则为阴性。1.4.5甲基红试验将菌接种在葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育48h，于5ml培养基中滴加5滴甲基红指示剂，立即观察结果，培养液出现红色为阳性，黄色为阴性。1.4.6VP试验将菌接种葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35℃孵育24h，加入50gL-萘酚0.6ml，轻轻振摇试管，然后加入0.2ml400g/LKOH，轻轻振摇30min，然后静止观察结果，15min后呈现红色的为阳性，不变颜色的为阴性。1.4.7硫化氢试验将待检菌接种含硫化物及亚铁离子的培养基中，35℃孵育18h，若有黑色沉淀出现，判为阳性。1.4.8明胶液化试验将菌接种明胶培养基，35℃孵育24h至7日，每24h取样放入4℃冰箱2h，观察有无凝固，若呈现液态不凝固，判为阳性。1.4.9吲哚试验将菌液接种富含色氨酸的蛋白