STR片段分析相关知识

STR片段分析技术相关知识肖怀东

FieldApplicationSpecialistTel:4008208982/8008208982E-mail:CNAPMsupport@第一页，共63页。摘要基本概念回顾片段分析技术原理及过程常见影响分型因素第二页，共63页。基本概念回顾第三页，共63页。基本概念回顾基本概念——染色体、DNA、基因、遗传标记、等位基因等分子遗传标记的发展STR概念及相关特性第四页，共63页。TargetRegionforPCR双链DNA细胞核（cellnucleus）Individualnucleotides染色体（chromosome）22pairs＋XXorXYGene基因——能够表达出特定功能的产物，并决定生物体特定性状的一段DNA序列常用术语染色体——DNA的组装形式，每个人体细胞含有23对染色体第五页，共63页。常用术语能够稳定遗传的任何分子特征个体间有显著差异且易于检测可位于染色体的任意位置遗传标记（GeneticMarker）第六页，共63页。第2号染色体第2号染色体D2S118GAGAD2S118GAGAD2S118GAGAD2S118GAGAGAGAGA纯合子杂合子常用术语基因座——遗传标记在染色体上的位置。同源染色体——成对的两条染色体互称为同源染色体等位基因——在同源染色体上占据相同座位上的一对等位基因。D2S118第七页，共63页。多态性（Polymorphism）序列多态性，DNA在序列上的变异长度多态性--------AGACTAGACATT---------------AGATTAGGCATT----------------(AATG)(AATG)(AATG)----------2repeats3repeats---------(AATG)(AATG)----------常用术语第八页，共63页。分子遗传标记的发展“Ifyouwanttounderstandtoday,youhavetosearchyesterday.”–AttributedtoPearlBuck(/history.html)TheNobelPrizeinLiterature1938PearlBuck第九页，共63页。分子遗传标记的发展1985199019941998200020021992200619962004201020082013RFLPSNPGilletal.(1985)ForensicapplicationofDNA'fingerprints‘.Nature318:577-9PCR首次描述20121991STR第一个商业化荧光复合STR试剂盒PCR应用于办案CODISlocidefinedUKNationalDatabaselaunched(April10,1995)STR成为常规使用Identifiler5-dyekitandABI3100首个Y-STR试剂盒miniSTRIdentifilerDirectIdentifilerPlus3500/xlY-DirectGlobalFilerPGMCODISupdate参考Bulter《ForensicDNAtyping》第十页，共63页。什么是STR?短串联重复序列（Shorttandemrepeat,STR）=微卫星DNA(microsatelliteDNA)=简单重复序列（simplesequencerepeat,SSR)长度多态性遗传标记，一般由2-6个碱基的DNA重复序列组成，其长度多态性来源于重复单位拷贝数的个体差异。常用术语DinucleotideTrinucleotideTetranucleotidePentanucleotideHexanucleotide(CA)(CA)(CA)(CA)(GCC)(GCC)(GCC)(AATG)(AATG)(AATG)(AGAAA)(AGAAA)(AGTACA)(AGTACA)第十一页，共63页。5’TCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAGATCAATACAGACAGAAGACAGGTGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATCATTGAAAGACAAAACAGAGATGGATGATAGATACATGCTTACAGATGCACAC

3’=12GATArepeats

(“12”isallthatisreported)Targetregion(shorttandemrepeat)7repeats8repeats9repeats10repeats11repeats12repeats13repeatsThenumberofconsecutiverepeatunitscanvarybetweenpeople第十二页，共63页。CategoriesforSTRMarkersCategoryExampleRepeatStructure13CODISLociSimplerepeats–containunitsofidenticallengthandsequence(GATA)(GATA)(GATA)TPOX,CSF1PO,D5S818,D13S317,D16S539Simplerepeatswithnon-consensusalleles

(e.g.,TH019.3)(GATA)(GAT-)(GATA)TH01,D18S51,D7S820Compoundrepeats–comprisetwoormoreadjacentsimplerepeats(GATA)(GATA)(GACA)VWA,FGA,D3S1358,D8S1179Complexrepeats–containseveralrepeatblocksofvariableunitlength(GATA)(GACA)(CA)(CATA)D21S11ThesecategorieswerefirstdescribedbyUrquhartetal.(1994)Int.J.LegalMed.107:13-20第十三页，共63页。适用于法医DNA分型的STR基因座的选择较高的个体识别率，通常>0.9，观测杂合度>0.7在染色体上定位相对较远，确保无连锁低stutter产物、低突变率与其他遗传标记复合检测时易于得到结果，且具有重现性鉴定的位点越多，判错的可能性越小，个体识别能力越来越强第十四页，共63页。统计学基本概念遗传多态性指控制遗传标记的基因座上存在有两个或两个以上的等位基因，并且等位基因的频率大于0.01.基因频率/等位基因频率指某种等位基因数目占该等位基因上所有等位基因总数目的百分比杂合度（heterozygosity）是一个传统的遗传学指标，指群体中某遗传标记所有基因型中杂合子所占的比例。个人识别率（ProbabiltyofDiscriminationpower,PD)在群体中随机抽取两个体，二者的遗传标记表型不同的概率第十五页，共63页。CSF1POD5S818D21S11TH01TPOXD13S317D7S820D16S539D18S51D8S1179D3S1358FGAVWA13CODISCoreSTRLociAMELAMELSex-typing法医学应用的STR在染色体上的位置CoreSTRLocifortheUnitedStates1997SE3320112012D10S1248D2S441D22S104523D2S1338D19S433D1S1656D12S391DYS391第十六页，共63页。第十七页，共63页。STR的特性分布广泛，有高度多态性。检测方法简单。扩增片段短，适用于降解、陈旧和腐败检材的分型鉴定。复合扩增，可以实现自动化操作，节约时间、节约检材、提高检测效率。目前，STR已广泛应用于遗传制图、连锁分析、亲子鉴定、个体识别、疾病基因定位和物种多态性研究等领域。常用术语第十八页，共63页。片段分析技术原理及过程第十九页，共63页。STR片段分析的原理除同卵双生外，每个人/生物包含的DNA序列是不同的，独一无二的同一个个体的各种组织DNA具有相同的序列特征（如同一个人来自皮肤的DNA和血液的DNA是一样的，相匹配的）同一个个体的DNA序列在一生当中保持不变（除外某些疾病）同一个个体的DNA一半来自母亲，一半来自父亲第二十页，共63页。样本采集样本制备/样本提取

FLOQSwab™PrepFilerExpress™PrepFilerExpress™BTAAutoMateExpress™扩增检测&数据分析STR片段分析的过程定量7500HIDRealTimePCRAnalysisSoftware第二十一页，共63页。样本采集样本制备/样本提取

扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程样本采集FLOQSwab™第二十二页，共63页。生物物证的采集DNA是否能开展应用，现场采集至关很重要直接提取转移提取：擦拭、粘取、吸取等FibreSwabFLOQSwab™第二十三页，共63页。生物物证的采集DNA是否能开展应用，现场采集至关很重要直接提取转移提取：擦拭、粘取、吸取等单细胞捕获ArcturusXT™LCM第二十四页，共63页。生物物证的采集DNA是否能开展应用，现场采集至关很重要采集工具/介质无人类DNA，DNA酶和RNA酶高效收集（最大量、操作简便）无人体侵害性转移步骤少可自动化，易存储BodeBuccalCollector™CopanNUCLEICard™System第二十五页，共63页。样本采集样本制备/样本提取

扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程样本制备/样本提取PrepFilerExpress™PrepFilerExpress™BTAAutoMateExpress™第二十六页，共63页。样本制备利于峰均衡性利于得到好的峰高利于减少杂峰用于口腔拭子和未经处理的采集卡Prep-n-Go™BufferBSD及打孔bsdtechsupport@第二十七页，共63页。

使用PrepFiler™Express™试剂盒，专用于法医样品提取，以获得高质量DNA——使用简单、可靠——操作时系统密闭，避免污染——30分钟内可同时处理13个样本

（使用LySep柱简化了裂解过程）——提取的DNA完整、无抑制物——针对定量和片段分析试剂盒进行了验证样本提取第二十八页，共63页。样本采集样本制备/样本提取

扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程定量7500HIDRealTimePCRAnalysisSoftware第二十九页，共63页。定量准确的定量在法医DNA检测过程中至关重要过多的DNA会导致off-scale峰,分裂峰(由于noise或+A),滑移峰和其他颜色的渗透峰.

过少的DNA导致位点丢失、峰高不平衡指导后续试验选择试剂盒D3S1358-A+A10ngtemplate(overloaded)2ngtemplate(suggestedlevel)DNASize(bp)RelativeFluorescence(RFUs)DNASize(bp)100pgtemplate5pgtemplateWegenerallyshootfor0.5-2ng第三十页，共63页。定量仪器7500定量试剂盒的选择Quantifiler™HumanDNAQuantificationKitQuantifiler™YHumanMaleDNAQuantificationKitQuantifiler™DuoDNAQuantificationkit第三十一页，共63页。样本采集样本制备/样本提取

扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程扩增第三十二页，共63页。扩增PCR是什么?

PolymeraseChainReactionPCR的应用有哪些？个人识别和亲权鉴定，传染病诊断，快速分子诊断，动物健康与食品安全PCR的过程PCR反应组分PCR反应影响因素MasterMixPCRbufferTris-HClMgCl2KCldNTP增强剂BSA等PrimerForwardPrimerReversePrimerTaq酶MgCl2浓度dNTP浓度引物浓度模板质量反应PH值循环参数模板第三十三页，共63页。PCR过程示意图第三十四页，共63页。样本采集样本制备/样本提取

扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程电泳检测第三十五页，共63页。不同长短的片段可以通过电泳分离相同长短的片段可以通过不同颜色来区分。电泳检测第三十六页，共63页。样本采集样本制备/样本提取

扩增检测&数据分析定量STR片段分析的过程数据分析GeneMapper3.2/3.3GeneMapperID-X第三十七页，共63页。数据分析1、片段分析（GeneScan）分子量内标（LIZ500）的作用：已知长度的片段作分子量标准，可以得到长度对迁移时间的标准曲线。测定出未知样品的迁移时间，与标准曲线相比较后，计算出未知片段长度，这就是片段分析（GeneScan）。生成标准曲线，判定未知片段大小迁移时间115.75未知片段片段长度75100t1t2t3139第三十八页，共63页。数据分析2、基因分型（Genotyping）样品峰与ladder比对，自动判定等位基因第三十九页，共63页。常见影响分析因素第四十页，共63页。正常的STR图谱第四十一页，共63页。理想的峰型具有良好分型的峰特征：尖锐光滑对称落在bin内，且被软件标注正确分型无肩膀峰或者分裂峰第四十二页，共63页。常见分析因素Stutter（影子峰/滑移峰/DNA聚合酶滑脱产物）Splitpeak（分裂峰）or加A不全（非模板依赖添加）NullAllele等位基因缺失/无效等位基因突变（三等位基因、亲权鉴定观察到的突变）微变异第四十三页，共63页。1、Stutter也叫影子带，或DNA聚合酶滑脱产物stutter第四十四页，共63页。Stutter产生机理机理：链滑脱错配机制，在引物延伸过程中，引物链或模板链滑脱，导致一个重复单位形成的碱基非配对环。模板DNA扩增产物扩增产物扩增产物扩增产物模板DNA模板DNA模板DNA第四十五页，共63页。Stutter特点Stutter峰比相应等位基因峰小一个重复单位，极少出现多一个重复单位的峰。Mainpeak-4bpstutter+4bpstutter第四十六页，共63页。是混合样品还是stutter？Stutterregion9%(a)(b)100%100%Stutter具有基因座特异性Stutter具有试剂盒特异性Stutter对样本分析造成的困扰第四十七页，共63页。Stutter产物的解决主要通过改进Mix的配方来减少滑移峰采用标准反应体系及扩增程序使用适当量的DNA，Identifiler推荐模板量0.5-1.0ng第四十八页，共63页。2、非模板添加，加A峰特点：比正常产物多一个A原理：所有的Taq酶本身都有加A效应AAAAA+A+A+A+A第四十九页，共63页。非模板添加，加A峰产生的原因加入模板DNA过多没有足够的时间给所有的产物都加A没有足够的酶量加A扩增的参数设置不正确延伸时间不充分酶少或者变质反应体系变化（减小或者改变）PCR仪有问题第五十页，共63页。非模板添加，加A峰对样本分析造成的困扰峰型变宽影响潜在的微变异的准确分型-A+A第五十一页，共63页。非模板添加/加A不全的解决——加A方法全部转换成-A全部转换成+A引物进行修饰A引物带一段不同源的尾巴尾巴促使加A采用标准的扩增程序采用推荐的DNA量采用标准的反应体系引物引物A第五十二页，共63页。在DNA模板存在，但由于在PCR过程中的引物结合问题导致扩增失败的等位基因

AmelogeninD22S1045D2S4413、无效等位基因，NullAlleles第五十三页，共63页。无效等位基因（NullAlleles）产生的机理**88668Allele6ampliconhas“droppedout”ImbalanceinallelepeakheightsHeterozygousallelesarewellbalanced引物区突变第五十四页，共63页。杂合子“被”纯合子不同的PCR引物扩增相同样本，得到不同的结果影响DNA数据库的比对结果，出现假阴性结果或者相同来源的两个样本被错误排除。无效等位基因对样本分析造成的困扰第五十五页，共63页。无效等位基因（NullAlleles）的解决降低Tm值扩增更换引物结合区设计兼并引物第五十六页，共63页。AMELD8S1179D21S11D18S51(B)TPOX(A)额外的染色体引物结合区点突变特殊峰型4、突变——三等位基因第五十七页，共63页。4