分子生物学技术在食品生物安全方面的应用XXXX

基因检测技术在在食品生物安全领域的应用祝长青江苏出入境检验检疫局食品质量安全理化安全生物安全应用于食品安全领域的主要方面转基因产品检测过敏原检测物种鉴别转基因产品检测二十世纪80年代初，美国最早对转基因生物进行研究。首例转基因生物（GMO）于1983年问世，转基因作物(1986）批准进行田间试验，延熟保鲜番茄（1993）在美国批准上市，开创了转基因植物商业应用的先例......到2010年，全世界的转基因食物的种植面积预计将增至6000万公顷，市场总收入将达到3万亿美元。我国的转基因植物现状番茄（华番1号）甜椒（抗病毒）矮牵牛（改变花色）木瓜（抗病毒）大米（抗虫、抗病毒，尚未批准）大斑蝶事件Losey等（Loseyetal.,1999）的实验结果在Nature上发表后引起了很大的轰动。他们在实验室中用加有Bt玉米花粉的马利筋叶片来喂饲大斑蝶幼虫，加普通玉米花粉及不加玉米花粉的马利筋叶片作为对照，结果说明喂饲加有Bt玉米花粉的马利筋的幼虫第二天死亡10%以上，4天后死亡44%，而对照全部存活。此外，对加有Bt玉米花粉的马利筋摄取量小，幼虫生长缓慢，重量只有喂饲无花粉叶片的幼虫的一半。从另外一角度也可能威胁大斑蝶的生存，在无转基因抗除草剂作物前，除草剂一般只能在作物种子萌发前喷洒一次。在种植抗除草剂作物后，就可在作物生长期多次喷洒除草剂，杀死杂草而对作物无威胁，随着多次除草剂的喷洒，马利筋就大量减少。由于大斑蝶的惟一的食物是马利筋，随着马利筋大量减少，也就威胁到大斑蝶的物种的生存。Pusztai土豆事件

英国Ｒｏｗｅｔｔ研究所有位Ｐｕｓｚｔａｉ博士，他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠，１９９８年秋天在英国电视台发表讲话，声称大鼠食用了这种土豆后，体重和器官重量减轻，免疫系统受到了破坏。此事首次引起国际轰动。绿色和平组织、地球之友等反生物技术组织组织了了破坏转基因作物试验地等行动，焚烧了印度的两块试验田，甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏，以致研究生的毕业论文都无法答辩。

英国皇家学会对此非常重视，组织了同行评审，并于１９９９年５月发表评论，指出Ｐｕｓｚｔａｉ的试验有六方面的错误，即：不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异；对食用转基因土豆的大鼠，未补充蛋白质以防止饥饿；供试动物数量少，饲喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，很少统计学意义；试验设计差，未作双盲测定；统计方法不当；试验结果无一致性等。但此事已经使GMO食品的安全性成为了全球民众与各国政府的关注焦点。StarLink玉玉米米事事件件StarLink玉玉米米，，它它是是由由Aventis于于1996年年培培育育出出来来的的一一种种可可能能引引起起过过敏敏的的转转基基因因农农作作物物，，StarLink玉玉米米与与哮哮喘喘发发作作和和其其它它一一些些过过敏敏反反应应有有关关。。这这种种玉玉米米含含有有一一种种来来自自常常见见土土壤壤细细菌菌-————苏苏云云金金芽芽孢孢杆杆菌菌的的cry9C蛋蛋白白，，cry9C蛋蛋白白能能够够保保护护玉玉米米免免遭遭玉玉米米钻钻虫虫和和黑黑毛毛虫虫的的侵侵害害。。StarLink玉玉米米于于1998年年被被美美国国环环境境保保护护协协会会批批准准用用只只能能用用于于动动物物喂喂养养和和非非食食物物性性产产品品上上，，但但到到了了2000年年，，在在墨墨西西哥哥的的玉玉米米食食品品等等中中发发现现有有cry9C的的DNA片片段段。。随随后后欧欧盟盟、、日日本本等等国国也也发发现现了了StarLink玉玉米米污污染染食食品品的的情情况况。。转基因水稻1.欧盟要要求美国政府府保证出口到到欧盟地区的的所有长粒水水稻中不含有有未经许可的的转基因水稻稻品系LL601，该该水稻品系是是由拜耳公司司研发的。欧欧盟表示，至至少在今后6个月将要求求进行转基因因水稻的检测测，而且可能能会要求进行行附加检测。。日本和韩国国也对此表示示关注，一些些媒体暗示政政府可能会发发出禁令。2.2006年～2008年，，欧盟、日本本等国在中国国出口的大米米或米制品中中检测到有抗抗虫转基因大大米的污染，，这些品系在在中国都没有有得到允许商商业化种植的的许可。因此此对中国出口口的米及米制制品加大抽查查检测力度。。转基因产品检检测检测技术基因方法：Real-timePCR，PCRDNAMicroarray蛋白检测方法法：ELISA,Quickteststrip标准方法5个ISO国国际标准8项国家标标准12项出入境境行业标准4项农业部行行业标准QuickteststripforCry1Ab/AccontroltestpositivenegativePrimerannealingat50-70°°CMeltingofDNAat~95°CPolymerisationat72°°C1.Cycle2.CyclePCRandTaqManareregisteredtrademarksofHoffmannLaRocheandPerkinElmerPCRisanexponentialprocess定性常规PCR样品制备↓样品核酸提取↓PCR体系配配置↓PCR扩增↓凝胶电泳检测测只能进行定性性结果的判断断（是/否），具有一定主观观性。实时荧光（Real––time））PCR的的原理CT值表示每个个PCR反应应管内荧光信信号到达设定定的域值时所所经历的循环环数。研究表表明，各模板板的CT值与该模板的的起始拷贝数数的对数存在在线性关系，起始拷贝数数越多，CT值越小，反之之亦然。图1.Rn与时间曲线线荧光实时PCR与普通PCR的比较实时在线监控控对样品扩增的的整个过程进进行实时监控控，能够实时时地观察到产产物的增加，，直观地看到到反应的对数数期降低反应的非非特异性使用引物和荧荧光探针同时时与模板特异异性结合，提提高了PCR反应的特异性增加定量的精精确性全程监控，准准确的算法进进行定量结果分析更加加快捷方便，，无需进行凝凝胶电泳Realtimevs终点法法荧光实时PCR的标记方法内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)实时PCR-TaqMan™Technology国内外常用的的Real-timePCR仪仪器RocheLightCycler2.0RocheLightCycler®480AppliedBiosystems7500型PCR仪BioradiCyclerScreeningtargetsGenespecifictargetsConstructspecificEventspecifictargetsLevelsofspecificity–GMOsequencesLOWHIGHRecentBt10casedemonstratesneedforconstructandeventspecificmethodsGMO荧光PCR检测项项目筛选检测Targetgenes:CaMV35SPromotor,Nosteminator,NptII等品系特异性检检测GTS40-3-2(RoundUpReadySoybean),BT63,Bt176,Mon863等内标基因：GOS，Lectin，，PLD，Zein等本实验室的GMO检测工工作国家认监委首首批认可的GMO检测重重点实验室；；与转基因检测测领先的Eurofins/GeneScan合作成立了基因检测联联合实验室——FoodScan；利用LightCycler1.2多次参加英国国CSL、APLAC的的转基因检检测全球水平平测试，结果果满意。与农业部、中中检院等合作作，利用LightCycler480完成了转基因因大米的国标标协同验证，，结果满意。。每年转基因检检测的接近800～1000批次，，项目多达5000余项项。TT51外源源基因的LC480检测测图Error:0.134Efficiency:1.857Slope:-3.720YIntercept:41.62Error:0.0570Efficiency:1.958Slope:-3.426YIntercept:38.60PLD内标基基因的LC480检测图图食品过敏原的的检测最常见的食品品过敏源Majorseriousallergensinclude主要严重的过过敏源包括(IFST-1999):“Bigeight八大样”:eggs,cow´smilk,peanut,soybean,wheat,treenuts,fishandcrustacean蛋品、牛奶、、花生、黄豆豆、小麦、树树木坚果、鱼鱼类和甲壳类类食品。“Secondeight八小样”:sesameseeds,sunflowerseeds,cottonseed,poppyseed,fruits,beansotherthangreenbeans,peasandlentils.芝麻籽籽、葵葵花子子、棉棉籽、、罂粟粟籽、、水果果、豆豆类（（不包包括绿绿豆））、豌豌豆和和小扁扁豆Others其它它:tartrazine,sulphitesandlatex.KFIfoodallergencategorylist*KFI食品品过过敏敏源源类类别别清清单单Celery芹菜菜Eggs蛋类类Cow´´smilk牛奶奶Peanut花生生Soybean大豆豆Sulphites亚硫硫酸酸盐盐Wheat小麦麦Seeds种子子Seafood海鲜鲜Treenuts树木木坚坚果果Cottonseed棉籽籽poppyseeds罂粟粟子子sesameseeds芝麻麻籽籽sunflowerseeds葵花花子子Crustacean甲壳壳类类Fish鱼类类almond杏仁仁brazilnut巴西西木木坚坚果果cashew贾如如树树坚坚果果chestnut栗子子hazelnut榛子子macadamianutpinenuts松子子pistachio阿月月浑浑子子的的果果实实pecan美洲洲山山核核桃桃walnut核桃桃*Someexemptionsareincludedinthelist-Example一些些例例外外在在-实例例表中中列列出出1.ELISA方方法法检检测测过过敏敏原原（（澳澳大大利利亚亚ELISASYSTEMS)：：1.原原理理：：第一一步步：：加加入入样样品品第二二步步：：加加入入酶酶标标记记物物第三三步步:加加入入发发色色剂剂及及反反应应停停止止液液加入入样样品品后后，，如如果果样样品品中中有有过过敏敏原原（（Allergy)，，样样品品中中的的过过敏敏原原(Allergy)将将会会与与包包被被在在微微孔孔中中的的特特异异性性抗抗体体结结合合。。孵孵育育15分分钟钟后后，，洗洗去去没没有有结结合合的的杂杂质质。。加入入酶酶标标记记物物后后，，酶酶标标记记物物会会与与过过敏敏原原残残留留物物结结合合形形成成““三三明明治治””夹夹心心体体，，孵孵育育15分分钟钟后后，，洗洗去去没没有有结结合合的的没没标标记记物物。。如果果样样品品中中有有过过敏敏原原，，加加入入发发色色剂剂（（TMB底底物物溶溶液液））孵孵育育10分分钟钟后后与与酶酶标标记记物物结结合合显显蓝蓝色色，，加加入入反反应应停停止止液液停停止止反反应应，，溶溶液液显显黄黄色色，，酶酶标标仪仪读读数数或或用用肉肉眼眼判判读读颜颜色色。。1.ELISA方法检检测过敏敏原（澳澳大利亚亚ELISASYSTEMS)：2.检测测步骤：：第一步：：加入100ul的样样品及标标准品到到相应的的微孔中中，轻微微混合10秒，，孵育15分钟钟。第二步：：倒掉微微孔中的的液体。。第三步：：用洗板板缓冲液液洗板，，重复5次。第四步：：在吸水水纸上拍拍打，直直到微孔孔中没有有残留液液体。第五步：：100ul酶酶标记物物（绿盖盖）到每每个微孔孔中，，，轻微微混合10秒，，孵育15分钟钟。第六、七七、八步步：（（（同第二二、三、、四步））1.ELISA方法检检测过敏敏原（澳澳大利亚亚ELISASYSTEMS)：第九步：：加入100ul发色色剂（TMB底底物），，轻微混混合10秒，孵孵育15分钟。。第十步：：加入100ul的反反应停止止液，轻轻微混合合10秒秒。第十一步步：肉眼眼比色（（定性检检测）或或酶标仪仪读数（（定量检检测）1.ELISA方法检检测过敏敏原（澳澳大利亚亚ELISASYSTEMS)：食品过敏敏原检测测（棉拭拭子法））---用于设设备表面面残留的的检测第一步：：选择一一个棉拭拭子。第二步：：在棉拭拭子管上上标记样样品号。。第三步：：放置棉棉拭子管管在棉拭拭子管架架上。第四步：打打开棉拭子子浸湿溶液液管。第五步：将将棉拭子插插入浸湿溶溶液管浸湿湿棉拭子。。第六步：转转移面拭子子，如果棉棉拭子太湿湿，在棉拭拭子浸湿溶溶液管壁上上轻微压一一下。1.ELISA方法法检测过敏敏原（澳大大利亚ELISASYSTEMS)：：第七步：用用浸湿的棉棉拭子交叉叉的平行线线画出阴影影，或用自自己的方式式涂布要检检测的区域域。第八步：放放置棉拭子子到对应样样品的棉拭拭子管。第九步：封封闭好棉拭拭子管。第十步：储储存棉拭子子管，直到到提取、分分析。ELISA方法检测测过敏原（（澳大利亚亚ELISASYSTEMS)：过敏原（ALLERGY）检检测产品表表（ELISA）法法）2.荧光光PCR方方法检测食食品过敏原原检测原理：：PCRFast@是一种即用用型的分子子生物学方方法，用于于检测食品品、设备残残留样品中中的特异性性DNA片片段。检测测系统符合合国际PCR标准（（ISO））。该试剂盒利利用实时荧荧光定量（（Real-timePCR)的方方法（含有FAM报告基因因和非荧光光淬灭基因因的探针）检测食品品及设备残残留中过敏敏原的特异异性DNA片段。2.PCR方法检测测过敏原(德国IFP）6.样品提提取（DNA提取））：每次PCR的分析，，建议对每每个样本进进行两次提取，并且每个个运行分析析都设置提提取对照(ISO21571,用用于检测转转基因生物物体的食品品分析方法法和用于衍衍生产品的的核酸提取取方法)。。对于不同的的样本，用用以下优化的CTAB方法法可以得到好好的结果。。根据不同同的样本也也可以采取取不同的提提取方法。。对于食品样样本，例如如蔬菜和动动物脂肪或或者卵磷脂脂，应该采采用正己烷烷萃取法提提取。a.经典典的核酸提提取方法（（如CTAB方法））b.试剂剂盒法提取取样品核酸酸（用硅胶柱柱纯化DNA，例如如：PCRFast®DNA纯化化。）一次PCR设置的每每个分析系系统都要进进行提取对对照ETC分析，只只加入试剂剂不加样本本。2.PCR方法检测测过敏原(德国IFP）6.3DNA浓度度的评估总DNA的的总量大于于100ng不能进进行PCR反应（用用260nm的紫外外进行检测测，或者通通过琼脂糖糖凝胶进行行估算因此，如果果是含有高高浓度DNA的样本本（大豆粉粉、玉米粉粉、香肠等等样本），，DNA提取取物必须用用0.1xTE缓冲液液进行稀释释。DNA提取取物带有抑抑制效应（（含有可可可、巧克力力的食品等等）同样需需要用0.1xTE缓缓冲液进行行稀释。例如：用步步骤6.1(12)中100µl的柱柱子或者步步骤6.2中100µl的洗洗脱柱子，，已证明最最佳稀释比比例如下：：香肠样本1：40~1：：80玉玉米粉1：20大豆粉1：20鳀鳀鱼片纯纯淀粉纯纯巧巧克力力1：：10和1：20动物饲料1：10~1：：207.PCR设置7.1准准备从锡箔袋中中取出所需需数量的反反应管，将将其余的反反应管和干干燥剂放回回锡箔袋子子，密封好好，贮存于于2-8°C。准备所所需量的MasterMix（每个反反应管12.5µµl）。2.PCR方法检测测过敏原(德国IFP）7.PCR设设置按下列表格格所示吸取取相应的量量加入反应应管：应当当包括核酸酸提取对照照、PCR阴性对照照和阳性对对照、试剂剂空白对照照。reactionvialMaster-Mixextractsampleextractextractioncontrolwaterdeionizedforeachsampleextractionsamplecolourless12.5µl12.5µl--pereachanalysisrunpositivecontrolPTCred12.5µl--12.5µlnegativecontrolNTCcolourless12.5µl--12.5µlextractioncontrolETCcolourless12.5µl-12.5µl-2.PCR方法检测测过敏原(德国IFP）8.评估估：8.1实时时评估样本本：下表显示了了评估。阳阳性反应应应该给出一一个最后的的荧光值，，这个值明明显高于阈阈值。SampleInternalamplificationcontrol(ITC)NegativecontrolN