非洲猪瘟病毒P72单克隆抗体的制备及抗体检测方法的建立课件

非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体的制备及抗体检测

方法的建立研究生：朱红导师：孙怀昌教授研究背景是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起猪的一种急性、热性、高致死性的传染病。强毒株感染的发病率和死亡率可达100%，OIE将其列为国际A类疾病。在非洲国家广泛流行。无有效疫苗进行防治。

非洲猪瘟（Africanswinefever）研究背景形态特征（图1）复制方式：胞浆内分类：非洲猪瘟病毒科是唯一一种DNA虫媒病毒非洲猪瘟病毒（ASFV）下一页研究背景

VP72参与病毒吸附和进入细胞的四种主要蛋白之一。占病毒粒子蛋白的32%，是一种非常保守的抗原性蛋白,对自然感染具有免疫原性。是血清学检测的理想抗原。研究背景常规实验室诊断技术血吸附试验敏感猪接种试验PCR免疫荧光ELISA研究目的及意义诊断的意义目前尚无理想的疫苗对非洲猪瘟进行预防。抗体诊断的目的发病猪产生的IgG抗体在体内能持续很长时间，特别适用于亚急性和慢性病例的检出。

单克隆抗体的优势特异性强高效，灵敏，便捷，成本低研究内容一非洲猪瘟病毒P72单抗的制备免疫原的制备重组细菌pGEX-VP72表达融合蛋白GST-VP72免疫小鼠SDS电泳定量IPTG诱导切胶、磨胶检测用抗原的制备重组细菌pGEX-VP72S

表达GST-VP72S纯化GST-VP72S4℃或-20℃保存备用IPTG诱导GlutathioneSepharose4B

方阵滴定法定量包被96孔反应板筛选结果筛选到五株阳性克隆，命名为3E9、3E11、4A8、4H2、6E5。方法GST-VP72sGST抗GST-VP72s阳性抗GST阳性包被96孔板√×{单克隆抗体的效价测定结论：细胞上清效价在27~212之间，腹水效价可达216。细胞株上清P/N值效价3E910.12123E115.7274A83.4274H26.7286E510.5212单克隆抗体的亚类鉴定细胞上清IgAIgG1IgG2aIgG2bIgG3IgM3E90.2030.2540.1411.20.2150.363E110.1700.2150.1770.8590.2840.4914A80.1940.2590.1980.9150.3050.3224H20.2320.3010.2420.950.2630.386E50.2170.3340.1742.2610.2620.352阴性对照0.2210.2220.2230.3060.2570.358结论：经亚类试剂盒鉴定，单抗的亚类为IgG2b。单克隆抗体的抗原识别间接ELISADot-ELISAWesternblotting方法间接ELISA结果GST-VP72s为抗原一抗OD值P/N3E91.55814.833E111.08510.334A81.21211.544H21.2039.526E51.34612.81阴性血清0.105

GST为抗原一抗OD值P/N3E90.2941.4853E110.1490.7534A80.0670.3384H20.0640.3236E50.1370.692阴性血清0.198结论：与GST-VP72s抗原反应呈阳性，与GST抗原反应呈阴性。WesternblotM：低分子量蛋白质电泳marker1：抗原为复性的GST-VP722：抗原为纯化的GST3：抗原为纯化的GST-VP72sM123976643311410045KDiELISA抗体检测方法的建立研究内容二结论：以碳酸盐缓冲液（pH9.6）包被效果最好，其次是PBS和生理盐水，0.05MTris-cl(pH8.6)包被效果较差，蒸馏水包被效果不理想。封闭液包被条件10%小牛血清的PBST5%脱脂乳1%BSA阴性检测值P/N阴性检测值P/N阴性检测值P/N37℃

2h0.2721.0213.750.1951.4677.50.5921.9983.374℃过夜0.2821.144.040.1981.5147.650.6352.3073.63抗原包被条件及封闭液的选择抗原最佳稀释度的测定单抗稀释倍数2526272829210211212213阴性1001.7651.7641.641.3241.180.8730.6660.490.3480.3512001.7251.5371.5781.2551.0740.840.6090.4530.230.3394001.711.5841.5391.2311.0620.8040.5480.3290.1190.3288001.6181.5611.5051.1671.0310.7560.5340.2910.1710.19816000.7571.491.3191.1640.9170.6270.40.170.1170.082结论：抗原最佳稀释度为1：256，单抗工作浓度为1：800，二抗工作浓度为1：1000。单抗稀释液的选择单抗稀释液PBSPBST检测值1.131.1221.1721.169均值1.1261.171结论：两种稀释液的效果相近，差别不大。冲洗液PBST（0.5%）PBST（0.1%）0.5MNaCl/PBST（0.5%）0.5MNaCl/PBST（0.1%）PBS检测值0.9690.8951.401.471.5511.451.5511.4311.2611.045均值0.9321.431.501.4911.153阴性值0.1390.120.1370.130.10.1030.1140.120.1910.188均值0.1290.1320.1020.1170.19P/N7.221114.712.746.06冲洗液的选择12345用纯化的VP72S抗原包被板子在同一条件下对猪瘟病毒，猪繁殖呼吸综合症病毒，猪无名高热病毒，猪圆环病毒，细小病毒等病毒感染血清以及正常猪血清，抗非洲猪瘟病毒阳性鼠血清，和模拟发病猪血清进行特异性交叉试验。CSFVPRRSV无名PCVPPV正常血清模拟血清阳性对照阴性对照检测值0.1110.0940.0880.0770.0730.1290.3751.3960.1050.0910.0850.080.0750.0760.0760.3951.9420.096均值0.1010.0890.0840.0760.0740.1030.3851.6690.101P/N1.000.880.830.750.731.023.8116.50结果——————++特异性交叉试验灵敏性试验模拟血清稀释倍数×50×100×200×400×800×1600阴性OD4901.8861.4631.0700.6780.4620.3090.065P/N2922.516.4610.467.14.7结论：模拟血清稀释到1600倍仍可以检测到阳性，说明该方法具有较高的灵敏性。抗原包被板保存期的测定第10天第20天第30天第40天第50天第60天OD4901.3391.3451.2081.1991.2671.259P/N8.37.98.27.87.87.6

-20℃放置抗原包被板OD值和P/N的变化

4℃放置抗原包被板OD值和P/N的变化

第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天OD4901.4381.4451.3381.3391.351.4011.32P/N9.69.68.98.999.38.8结论：按此方法包被的酶标板在-20℃至少放置60天，在4℃至少放置7天。统计学t测验分析P=0.321≥0.05差异不显著统计学t测验分析P=0.190≥0.05差异不显著小结获得5株抗ASF-VP72阳性的杂交瘤细胞株腹水效价可达到216亚类鉴定为IgG2b