细胞重编程与iPSCs

细胞重编程与iPSCsZujia.W摘要：通过实验技术手段可以逆转终末分化细胞的分化进程，从一种基因表达谱转换成另一套表达谱，这种实现细胞类型转化的方法称为“重编程”。目前重编程的主要策略有：体细胞核移植技术，细胞融合，诱导多能性干细胞，谱系转化，胞质孵育，多能细胞提取物共培养等。由于细胞重编程的过程能够将细胞命运逆转成为具有再生能力干细胞的状态,因此,细胞重编程技术能为再生医学、疾病个体化治疗及药物筛选提供巨大的前景。关键词：重编程核移植细胞融合诱导多能干细胞ABSTRACT:Theprocessofdifferentiationinterminaldifferentiatedcellscanbereversedthroughexperimentaltechniques,andthegeneexpressionspectrumofcellscanchangefromoneformintoanother.Themethodforrealizationofcelltypetransformationcalled"reprogramming."Themainstrategiesofreprogramminginclude:somaticcellnucleartransfer,cellfusion,inducedpluripotentstemcells,lineagetransformation,cytoplasmicincubation,co-culturewithpluripotentcellextractandsoon.Becausecellreprogrammingcanreversethefateofcellsintoregenerativestemcells,cellreprogrammingtechnologycanprovidegreatpotentialforregenerativemedicine,individualizeddiseasetreatmentanddrugscreening.Keywords:reprogrammingnucleartransfercellfusioninducedpluripotentstemcell细胞是人体结构和功能的基本单位。成人体内的细胞大概有40-60万亿个，细胞种类也是成千上万的。不同种类的细胞有着不同的基因表达谱，从而表现出不同的形态结构，具有着不同的生理功能。除了人体细胞数量之庞大、功能之复杂令人震惊之外，更为让人惊叹的是人所有的细胞都来自于一个细胞——受精卵。受精卵具有全能性，可逐渐形成人体的不同种类细胞，这种从同一来源细胞逐渐产生出形态结构和功能特征不同的细胞系的过程称为“分化”。多细胞生物个体的细胞分化，受到一系列动态调控机制的调控并维持其稳态,。不同类型分化细胞之间的转化不会在自然条件下自发发生，而通过实验手段可以在体外逆转细胞分化的进程，使其从一种基因表达谱转换成另一套表达谱,从而实现细胞类型的转化，这个过程称为“重编程”。目前已知的重编程策略主要有：体细胞核移植技术，细胞融合，诱导多能性干细胞，谱系转化，胞质孵育，多能细胞提取物共培养等。重编程的关键是有效开启基因组，从而使得重编程因子与调节区域结合，便于染色质重构，介导基因表达改变［1］。一．体细胞核移植技术细胞核移植技术(somaticcellnucleartransfer)，是指将一个动物细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，产生与供细胞核动物的遗传成份一样的动物的技术。目前，科学家们已经先后利用这种技术，克隆出了绵羊、小鼠、牛、猪、山羊等动物。最早的核移植是在两栖动物一一非洲爪蟾上尝试的，并且成功的孵育出了蝌蚪⑵。最为大家熟知的克隆动物——世界上第一只克隆羊“多莉”，在1997年被成功地克隆出来，这标志着细胞核移植技术第一次应用在哺乳动物身上。细胞核移植的效率受到多种因素的制约。普遍认为，核移植至去核卵母细胞策略的效率低与DNA甲基化有关，核移植胚胎发育异常往往与DNA甲基化缺陷有关。同时还有有研究表明，供体细胞的分化程度也与重编程效率密切相关：分化程度越低，核重编程的效率越高⑶。另外，组蛋白的修饰，染色体重构，基因组印记去除等其他因素也会影响核移植的效率。核移植技术的诞生尽管在保存濒危物种、独特的动物基因型和转基因等多领域取得了巨大成就，但到目前为止，克隆效率一直很低，家畜产活的后代的比率仅在4%以下，克隆后代也常出现体重较大及对外界环境适应性差等问题。并且细胞核移植技术需要充足的卵细胞来源，还会破坏胚胎，受到了极大的伦理质疑和挑战。这些问题在一定程度上制约了该项技术的快速发展。二、细胞融合细胞融合(cellfusion)是指在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。融合的两个细胞中一个对另一个起明显支配作用,将自己的状态强加于另一个细胞。所以我们可以通过与胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞等多能性细胞融合形成杂种细胞,实现体细胞重编程。这样形成的融合细胞中多能性细胞处于统治地位,因而体细胞会向类多能性细胞转变，并且能表现出多能性细胞的所有分子特征。理论上说，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。并且融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，这就为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。但同时细胞融合也有很多劣势：比如细胞融合率很低，需要强烈的细胞筛选辅助，而且杂种细胞内存在多重基因组,不能用于基因治疗。尽管如此，细胞融合却能在细胞不分裂条件下即发生主动DNA去甲基化等重编程过程,因此细胞融合仍然是研究主动去甲基化等重编程机制的良好模型。三．谱系转化通过发育生物学的研究已知，过表达一种或几种转录因子可以深刻影响细胞表型及特性。所以我们就可以人为地,在培养细胞时添加一些转录因子或者miRNA，诱导已分化的细胞转变为另一种细胞，这种直接诱导转分化的方法也称为“谱系转化”，这种方法避免了细胞获得性免疫原性的问题。理论上转录因子过表达能够使体细胞重编程为任意理想细胞类型,但目前转录因子过表达重编程体细胞仅限于几种特定细胞,且通常是谱系相近的细胞类型。科学家们通过导入特定的转录因子或miRNA的方式已实现了如心肌细胞、肝细胞、神经干细胞和神经元、星形胶质细胞、内皮细胞、胰岛0细胞、造血干细胞和巨噬细胞等的转分化(详见表1)[4]表1通过转录因子WmiRNA诱导的体细脂转分化起始细胞诱导因子冃的细膛小鼠成纤维细胞Gata4.MefZc,.Tbx5：心删细胞小鼠成纤维细胞Oct4.Sox2xKlf4.c-Myc心删细胞人成纤维细胞GATA4.HAND?.MYOCD.TBX5.miEt-l.miR-133心肌细胞小鼠成纤维细胞th塩4、Hnfla.Foxa3、P19ARF敲减：肝胱干细胞和肝细胞小鼠成纤维细咆Oct4.Sox2.Klf4肝脏干细胞和肝细胞人成纤维细胞IINF1A.IINF4A.FOXA3.SV40大T抗原HMT-细胞和肝细胞小鼠支持细胞Ascii.Ngn2xHe&l,Ldl.Pax6. c-Myc神经干紬胞和神经元小鼠成纤维细胞OCT/SOX2.KLF4.c-Myc神经干细胞和神纟幸元人尿上皮样细胞OCT4、£0X2、KLF4.SV40LT.miR30^-S67神经干细胞和神经元小鼠成纤维细胞ERG,GATA2、LMO2.RUN%IsSCL.p勺+造血干细胞小鼠B细胞CEBPa巨嚨细胞小鼠成纤维细胞Oct4.Sox2.K114.c-Myc濮岛P细胞小鼠成纤维细咆MfkuNfib^Sox9星形胶质细胞小鼠成纤维细咆FoxoltEr71TKl£2hTull*Lmo2内皮细胞四•诱导多能性干细胞(iPSBs)2006年，日本东京大学的Takahashi和Yamanaka[5]首次过表达4因子Oct3/4,Sox2,Klf4,c-Myc和运用逆转录病毒感染技术,成功地将小鼠成纤维细胞重编程为胚胎干细胞样细胞，并命名为诱导多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)。由于多潜能干细胞与胚胎干细胞高度相似，具多向分化潜能，并且不受细胞来源、免疫排斥、伦理、宗教和法律等诸多方面的限制，故在干细胞治疗领域中有着巨大的研究价值和应用前景。转录因子是诱导体细胞重编程的关键因素，故也被称为重编程因子(reprogrammingfactors),其包括OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、NANOG、LIN28(OSKMNL)等。最基本的重编程因子主要有两类： Yamanaka因子(OSKM)[5]和Thomson因子(OSNL)⑹。它们通过激活全能性基因的表达，同时抑制体细胞中组织特异性基因的表达，使体细胞重新获得干细胞的特性。1.诱导多能干细胞的主要技术：目前，诱导体细胞重编程为iPSCs的方法主要包括以下几种：(1)经典DNA法：这种方法由Takahashi在2006年首创，而后经由许多科研组不断地发展创新。这包括了用逆转录病毒、慢病毒、转座子、腺病毒、质粒等载体将OSKM等重编程因子转染待编程细胞而成功获得iPSCs。该法虽然诱导效率较高，但同时其引起插入突变和致瘤性风险也很高。蛋白质法：将重编程因子在原核或真核表达载体中表达为重组蛋白后导入体细胞实现重编程。这种技术避免了插入突变，提高了重编程的安全性，但诱导效率相当低，技术难度高，需要大量纯化蛋白，成本昂贵。化学方法(小分子化合物法)：筛选适当的小分子化合物取代重编程因子，通过影响细胞的表观遗传学和关键信号通路，实现体细胞的重编程。2013年,邓宏魁研究组开辟了一条全新的iPSCs诱导途径一一仅使用6种小分子化合物实现体细胞诱导重编程，这种诱导出来的iPSCs被命名为“CiPSCs”⑺。小分子化合物诱导法完全避免了外源基因的插入,大大降低了iPSCs诱导造成基因突变的风险。化学方法另一个主要的优点在于可以微调小分子的浓度、持续时间、结构和组合，更为精细地分阶段操控CiPSCs的生成。RNA法：该法具有诱导速度快、效率较高、无基因组整合和插入风险等特点，故而成为如今诱导iPSCs的热点。迄今用于iPSCs诱导的RNAs主要有mRNAs和非编码RNAs(ncRNAs)两大类。2.iPSCs的来源：自成功建立小鼠iPSCs以来，与iPSCs有关的研究取得了突飞猛进的发展。科学家们已经探索出了许多的方法用以获得iPSCs，包括基因导入技术重编程，蛋白质转染技术重编程，以及加入一些化学物质提高重编程的效率⑻。经过许多科学家的努力，迄今为止，许多iPSCs的细胞系均已建立，如人、大鼠、猪、猴和兔⑼。而细胞的来源也多种多样，用于细胞治疗的研究工作的细胞可以来源于人肝细胞，胃上皮细胞，间充质细胞，胰细胞，皮肤成纤维细胞，还有一些通过无创方法得到的外周血细胞，尿液中的肾小管内皮细胞等[10][11]。由于细胞来源的广泛以及取材的便利，iPSCs的研究发展迅速，应用前景十分可观。3.疾病特异性iPSCs细胞系的建立：科学家们在对某些疾病的发病机制和治疗方案的研究中，往往需要建立特定的疾病背景，例如利用动物模型对发病机制进行排查以及药物筛选。但是由于很多疾病并没有相应的动物模型,特别是某些人类遗传病。因此，科学家们更为关注的是对于人类疾病特异性iPSCs的研究。由于疾病特异性iPSCs带有与疾病有关的遗传信息，可以用于建立疾病模型以研究疾病发生机制，进而用于药物筛选和个性化细胞及基因治疗。到目前为止,成功建立的人的疾病特异性iPSCs细胞系主要包括糖尿病、肌萎缩性侧索硬化症、雷特氏综合征、杜氏肌营养不良症、帕金森病、精神分裂症、威尔森氏症、范氏贫血症、地中海贫血症、豹斑综合征、肝脏疾病、长Q-T间期综合征、脊髓性肌萎缩、弗里德赖希共济失调、普瑞德-威利综合征、蒂莫西综合征、阿尔茨海默病、骨性关节炎、先天性角化不良以及白内障等[8]。这些人类疾病特异性iPSCs的获得,为疾病体外模型的建立奠定了基础。由此可见，利用iPSCs建立的的疾病的模型及相关疾病的机理研究已取得了系列进展，但iPSCs定向分化成复杂疾病相关细胞和研究多重细胞表型疾病机制仍是挑战，这也是目前全世界科学家们的研究热点。重编程过程是一个复杂的网络化的协作过程,尽管目前仍然有大量的问题等待探索，但其对于科研和临床的巨大益处是大家有目共睹的！我们应该对这种技术的未来充满信心！参考文献：[1]李鑫,王加强,周琪.体细胞重编程研究进展[J].中国科学:生命科学,2016(1).[2]BriggsR,KingTJ.Transplantationoflivingnucleifromblastulacellsintoenucleatedfrogs'eggs.ProcNatlAcadSciUSA,1952,38:455-463GrigoryevS.A.,BednarJ.,andWoodcockC.L.,1999,MENT,aheterochromatinproteinthatmediateshigherorderchromatinfolding,isanewserpinfamilymember,J.Biol.Chem.,274(9):5626-5636付艳宾,龙媛,谢欣.全化学诱导体细胞重编程和转分化[J].生命科学,2016(8):941-948.TakahashiK,YamanakaS.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors[J].Cell,2006,126:663-76CoxJL,RizzinoA.2010.Inducedpluripotentstemcells:Whatliesbeyondtheparadigmshift.ExperimentalBiologyandMedicine,235(2):