蛋白重组技术在制备视黄醇结合蛋白质控品和候选参考物质中的方法研究

蛋白重组技术在制备视黄醇结合蛋白质控品和候选参考物质中的方法研究视黄醇结合蛋白（retinol-bindingprotein，RPB）属于脂质运载蛋白家族，由肝脏合成，广泛分布于血液、脑脊液、尿液和其他体液中［1］。绝大多数血清中的RBP4以与甲状腺运载蛋白结合的形式存在，仅10%RBP4以游离形式存在，游离的RBP4能经肾小球完全滤过并能被肾小管重吸收［2］。测定视黄醇结合蛋白能早期发现肾小管的功能损害，并能灵敏反映肾近曲小管的损害程度，还可以作为肝功能早期损害和监护治疗的指标［3,

4,

5］。RBP4还与许多疾病和代谢综合征相关，包括2型糖尿病胰岛素抵抗、心血管疾病、肥胖和黄斑变性等［6,

7,

8,

9］。由此可知准确测定RBP4具有重要的临床意义。使用参考物质（广义上的参考物质指经过制备的物质，包括质控物、质评物、校准物、有证标准物质等）（ISO17511∶2020）是实现临床检测准确性和可比性的重要途径，但高浓度RBP4参考物质不易获得，需要收集高浓度患者标本或者购买价格较高的RBP4纯度物质，给临床RBP4质量控制带来了很大的困难。近年来基因工程蛋白重组技术迅猛发展，标签融合被广泛应用于纯化目标蛋白，融合蛋白被标签特异性的亲和树脂所捕获，再从亲和树脂洗脱而达到分离纯化目的［10,

11,

12,

13］。鉴于此，本研究尝试研发基于基因工程蛋白重组技术，不受取材限制、可高浓度量产的标准物质和质控品研发技术，满足日益增长的临床检验实际需求。材料与方法一、材料1.材料来源：大肠埃希菌（E.coli）BL21表达感受肽和E.coli

DH5α克隆感受肽、DNALadder均购买自北京擎科生物科技有限公司；质粒pET-28a（+）由清华大学结构生物学高精尖创新中心惠赠。限制性核酸内切酶EcoRⅠ、NheⅠ、MluⅠ、HindⅢ以及T4DNA连接酶购自美国NEB公司。质粒提取试剂盒及DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。Luria-Bertani（LB）培养基、卡那霉素、异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-d-thiogalactoside，IPTG）、咪唑等均购自美国Sigma公司。RBP4检测试剂盒购自柏荣诊断（上海）有限公司。蛋白标准带购自美国Thermo公司（货号26616）。2.仪器设备：37℃全温振荡器购自金坛成辉仪器厂；DNA电泳仪购自北京市六一仪器厂；蛋白电泳仪购自美国伯乐公司；PCR仪购自美国ABI公司；Ni-NTA镍离子亲和树脂购自美国Qiagen；镍离子亲和层析柱购自上海生工生物工程股份有限公司；超声细胞破碎仪购自上海力辰邦西仪器科技有限公司，日立7180检测仪购自日本日立公司。二、方法1.hRBP4基因合成：从美国国立生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）数据库检索获得人RBP4编码序列，依据大肠埃希菌密码子偏好进行优化，优化后序列委托擎科公司基因合成。2.原核表达载体构建：基因合成时于N端增加NheI酶切位点，C端增加EcoRI酶切位点。将双酶切片段插入pET-28a（+）载体，T4DNA连接酶连接，并将连接产物转化E.coli

DH5α感受肽，利用卡那霉素抗性筛选，通过菌落聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）及酶切对阳性克隆进行鉴定，初步鉴定成功的菌液提取得到6×His-RBP4-pET质粒，进一步测序鉴定。3.重组hRBP4表达：将构建好的6×His-RBP4-pET转化E.coli

BL21感受肽，挑取单菌落接种至5mlLB培养基37℃摇床培养过夜。以1：500体积比将菌液接种至250mlLB培养基，在37℃，200rpm培养至OD600为0.3~0.5，向培养基中加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，37℃，160rpm诱导6h。所有诱导后的菌液5500×g离心5min收集菌体，菌体重悬于20ml蛋白裂解液（50mmol/LNa3PO4，pH8.0，150mmol/LNaCl）中，冰浴条件下使用超声细胞破碎仪超声15min（超声2s，间隔3s）破碎裂解菌体，裂解产物5500×g，4℃离心15min，分离上清液与沉淀。4.重组hRBP4表达条件优化：经LB培养基培养及IPTG诱导表达后（先选取了常用温度16℃，37℃和常用IPTG浓度0.5mmol/L，将菌体超声破碎后离心取上清，再将沉淀溶于高盐裂解液离心后取上清。上清及沉淀与镍柱Ni-NTA亲和层析，20mmol/L咪唑清洗非特异性结合，250mmol/L咪唑洗脱的蛋白液经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。在0.5mmol/LIPTG，180rpm前提下，16、20、30、37℃条件下诱导6h；确定最佳诱导温度后，在0.1、0.2、0.4和0.5mmol/L的IPTG，37℃，160rpm的条件下诱导6h，以获得重组hRBP4诱导表达最优的温度（16℃）与IPTG浓度（0.2mmol/L）。5.重组hRBP4纯化：考虑对蛋白影响最小，本研究使用His标签亲和纯化，将裂解上清与2mlNi-NTA亲和树脂在4℃充分混匀2h，使连接有His标签的重组蛋白结合于Ni离子螯合的树脂，用20mmol/L5倍于凝胶体积的咪唑溶液清洗非特异性结合，最后用4ml250mmol/L咪唑溶液洗脱重组人6×His-RBP4蛋白。6.重组hRBP4检测：将从250ml菌液中纯化的4mlhRBP4蛋白样品原液，使用ddH2O稀释不同浓度，使用常规免疫比浊法在日立7180全自动生化分析仪上搭配柏荣诊断（上海）有限公司的RBP4检测试剂盒测，分别测定不同稀释浓度下的数值。以稀释倍数为横坐标，测定浓度值为纵坐标绘制标准曲线，并添加回归方程计算R2值。7.统计学分析：利用线性回归分析，确定变量稀释倍数与检测值之间相互依赖的定量关系，使用最小二乘法拟合趋势线，得到线性回归方程及回归系数R。结果一、构建hRBP4原核表达载体hRBP4基因插入NheⅠ和EcoRⅠ两酶切位点之间，并在N端融合了6×His标签用于hRBP4蛋白的亲和纯化。经硫酸卡那霉素筛选的单克隆菌落，经摇菌后提纯质粒使用EcoRⅠ和MluⅠ酶切后得到1300bp左右的片段（图1），证实插入成功。将质粒送测序鉴定以证实基因序列是否正确，经DNAMAN软件对比编码hRBP4蛋白的碱基序列完全正确，表明6×His-RBP4-pET原核表达质粒构建成功。图1

构建和验证视黄醇结合蛋白的原核表达质粒二、6×His-RBP4-pET28a（+）表达亲和纯化产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果中清晰可见相对分子质量26000电泳条带（图2），大小与预期的6×His-RBP4-pET相符，但蛋白表达主要为不溶蛋白，大部分存在于沉淀中，表明重组hRBP4蛋白诱导表达主要以包涵体的形式存在。比较16℃和37℃时hRBP4的表达情况可知，16℃时表达量更大，可见降低温度并没有减少包涵体的形成，同时可以看到不论上清还是沉淀中蛋白纯度很高。通过变性纯化得到hRBP4蛋白纯品后进行检测，不论血清hRBP4还是尿液hRBP4检测试剂盒均能够正常检出。图2

不同条件下上清和沉淀中人视黄醇结合蛋白4的纯化产物三、重组hRBP4诱导表达条件优化为提高表达效率、增加产量、提高蛋白纯度，本研究成功诱导hRBP4表达后又对其诱导表达条件进一步优化。最佳诱导温度和IPTG浓度结果见图3。如图3A所示，在16、20、30和37℃条件下180rpm诱导6h，RBP4浓度在到16℃时到达最高，故最佳诱导温度取16℃。图3B所示，在0.1、0.2、0.4和0.5mmol/L的IPTG，37℃160rpm的条件下诱导6h，IPTG浓度为0.1mmol/L时，RBP4表达量较多，在0.2mmol/L达到最高，而在0.2~0.5mmol/LIPTG诱导时hRBP4的浓度随着IPTG浓度的升高而降低，故而选取0.2mmol/L为IPTG诱导的最优浓度。图3

不同诱导条件下裂解产物上清纯化后聚丙烯酰胺凝胶电泳结果四、重组hRBP4稀释后呈现良好的线性关系将hRBP4重组蛋白分别稀释40、80、120、160、200倍，测得浓度分别为106.11、48.76、32.52、22.60、17.19mg/L。经回归分析可知hRBP4纯品蛋白稀释倍数与测点值之间线性关系良好。这提示纯化蛋白不仅能够被临床检测，且符合线性关系（图4）。图4

视黄醇结合蛋白稀释倍数与测定值之间线性关系图讨论研究发现血清或尿液RBP4水平与人体肾功能、肝功能、临床营养状况、流行性出血热、肿瘤诊断等方面均密切相关。RBP4作为一项灵敏的检测指标不仅应用于肾脏相关疾病的早期诊断，还在肝脏疾病、肥胖、冠心病、糖尿病、肿瘤等疾病诊断和预后中具有较高的临床应用价值［6,

7，14］，临床实验室需提供准确可靠的检测结果，因此研发和制备用于RBP4实验室质量控制的参考物质（包括有证标准物质和质控品）具有重要意义。结合当前实验结果分析可知，本研究体外纯化的hRBP4蛋白，即便在稀释200倍时浓度依旧高达17.19mg/L（图4），结合临床诊断标准可知，稀释后的hRBP4依旧属于临床高浓度。从1L培养基中通常可得到16ml高浓度纯品hRBP4，以制备质控品为例，16ml稀释50~200倍后，以1ml为单位进行分装，则可制作800~3200支浓度水平在20~100mg/L间的室间质量评价质控品（血清RBP4的正常浓度范围在25~70mg/L，临床常见检测试剂盒线性范围一般为10~100mg/L）。由此可见，借助基因工程技术确实可快速、高效、高浓度生产纯品物质，而这种高浓度、高纯度的纯品可为研制有证标准物质和质控品奠定基础。临床实验室检验结果准确与否决定了疾病诊疗的可靠性和效率，而标准物质和质控品的规范化管理可提高临床检验结果的准确性和实验室间不同方法结果的可比性。近年来我国体外诊断试剂发展很快，但大多数项目缺乏标准化，表现在生产试剂、仪器的厂商较多，在我国国家药品监督管理局网站注册的血清RBP4和尿液RBP4检测试剂盒生产厂家已有上百家，但各试剂质量参差不齐，试剂特异性、灵敏度等存在较大的差异，各系统检测结果之间可比性较差。2021年国家卫生健康委临检中心的室间质量评价数据显示，全国参加血清视黄醇结合蛋白的705家实验室检测结果的变异系数为12.6%~19.9%，253家尿液视黄醇结合蛋白检测结果的变异系数为54.03%~94.2%，不同系统之间缺乏准确性和一致性。研制和应用参考物质（包括质控品和有证参考物质）是实现不同实验室检测结果一致化或标准化的重要途径，尤其是具有互通性的参考物质。本项研究旨在通过蛋白重组技术研制RBP4重组蛋白，并探索其用于质控品和参考物质的可能性。研究分为两个阶段，阶段一为研制hRBP4重组蛋白，阶段二为重组蛋白参考物质特性研究及应用。本研究主要介绍阶段一的成果，